Summary
Her beskriver vi en protokoll for finjustering av interesseområder (ROIs) for Spatial Omics-teknologier for bedre å karakterisere tumormikromiljøet og identifisere spesifikke cellepopulasjoner. For proteomikkanalyser kan automatiserte tilpassede protokoller veilede avkastningsvalg, mens transkriptomikkanalyser kan finjusteres ved å bruke avkastninger så små som 50 μm.
Abstract
Multiplexing gjør det mulig å vurdere flere markører på samme vev samtidig som det gir romlig kontekst. Romlige Omics-teknologier tillater både protein- og RNA-multipleksing ved å utnytte henholdsvis fotospaltbare oligo-merkede antistoffer og prober. Oligoer spaltes og kvantifiseres fra bestemte regioner over vevet for å belyse den underliggende biologien. Her viser studien at automatiserte tilpassede antistoffvisualiseringsprotokoller kan brukes til å veilede avkastningsvalg i forbindelse med romlige proteomikkanalyser. Denne spesifikke metoden viste ikke akseptabel ytelse med romlige transkriptomikkanalyser. Protokollen beskriver utviklingen av en 3-plex immunfluorescerende (IF) analyse for markørvisualisering på en automatisert plattform, ved hjelp av tyramidsignalforsterkning (TSA) for å forsterke fluorescerende signal fra et gitt proteinmål og øke antistoffbassenget å velge mellom. Visualiseringsprotokollen ble automatisert ved hjelp av en grundig validert 3-plex analyse for å sikre kvalitet og reproduserbarhet. I tillegg ble utvekslingen av DAPI for SYTO-fargestoffer evaluert for å tillate avbildning av TSA-baserte IF-analyser på den romlige profileringsplattformen. I tillegg testet vi muligheten til å velge små avkastninger ved hjelp av spatial transcriptomics-analysen for å tillate undersøkelse av svært spesifikke interesseområder (f.eks. Områder beriket for en gitt celletype). ROI på 50 μm og 300 μm diameter ble samlet, noe som tilsvarer henholdsvis ca. 15 celler og 100 celler. Prøver ble laget i biblioteker og sekvensert for å undersøke evnen til å oppdage signaler fra små avkastninger og profilspesifikke regioner i vevet. Vi bestemte oss for at romlige proteomikkteknologier drar stor nytte av automatiserte, standardiserte protokoller for å veilede avkastningsvalg. Selv om denne automatiserte visualiseringsprotokollen ikke var kompatibel med romlige transkriptomikkanalyser, var vi i stand til å teste og bekrefte at spesifikke cellepopulasjoner med hell kan oppdages selv i små avkastninger med standard manuell visualiseringsprotokoll.
Introduction
Fremskritt i multipleksingsteknikker fortsetter å gi bedre karakteriseringsverktøy for mål som er tilstede i svulster. Tumormikromiljøet (TME) er et komplekst system av tumorceller, infiltrerende immunceller og stroma, hvor romlig informasjon er avgjørende for å bedre forstå og tolke mekanismer for interaksjon mellom biomarkører av interesse1. Med nye teknikker som GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) og 10x Visium, kan flere mål oppdages og kvantifiseres samtidig innenfor deres romlige kontekst. Bruken av immunfluorescensprotokoller som letter vevsvisualisering, kan ytterligere forbedre de romlige profileringsegenskapene til disse teknologiene.
Spatial Omics-teknologien vi fokuserte på for denne metodeutviklingen består av romlige proteomikk- og transkriptomikkanalyser der oligonukleotider er festet til antistoffer eller RNA-sonder via en UV-sensitiv fotoklyvbar linker. Histologiske lysbilder er merket med disse oligo-konjugerte antistoffene eller sondene og deretter avbildet på den romlige profileringsplattformen. Deretter velges avkastninger av forskjellige størrelser og former for belysning, og de fotokleaved oligonukleotidene aspireres og samles i en 96-brønns plate. De fotokleaved oligonukleotidene er forberedt på å bli kvantifisert med enten Nanostring nCounter-systemet eller Next Generation Sequencing (NGS) 2,3 (Figur 1) 4,5.
Cellefordelinger varierer innenfor vev, og evnen til å karakterisere bestemte steder av celler ved hjelp av utvalgte markører og forskjellige avkastningsstørrelser er av stor betydning for å forstå vevsmiljøet fullt ut og identifisere spesifikke funksjoner. I Spatial Omics-teknologien som er nevnt her, bruker standard visualiseringsprotokoll direkte konjugerte antistoffer og er en manuell protokoll. Standardmarkørene for å skille mellom tumor og stroma er panCytokeratin (panCK) og CD456,7, men ytterligere markører er nødvendige for å målrette mot spesifikke cellepopulasjoner av interesse. Videre mangler bruk av direkte konjugerte fluorescerende antistoffer forsterkning, noe som begrenser antistoffvalg til rikelig markører. I tillegg er manuelle analyser gjenstand for større variasjon enn automatiserte arbeidsflyter8. Derfor er det ønskelig å ha en tilpassbar, automatisert og forsterket visualiseringsprotokoll for valg av avkastning.
Her viser studien at TSA-teknologi for romlige proteomikkanalyser kan brukes til visualiseringsprotokoller på en automatisert plattform, noe som resulterer i en mer målrettet og standardisert analyse. I tillegg muliggjør TSA-baserte analyser bruk av markører med lav uttrykk, noe som øker rekkevidden av mål som kan velges for visualisering. En 3-plex analyse for panCK, FAP og antistoff X ble utviklet ved hjelp av en automatisert plattform der panCK og FAP ble brukt til å skille mellom henholdsvis tumor og stroma. Antistoff X er et stromalt protein som ofte oppstår i svulster, men dets biologi og innvirkning på antitumorimmunitet er ikke fullt ut forstått. Karakterisering av immunkontexture i områder rik på antistoff X kan belyse sin rolle i antitumorimmunitet og terapeutisk respons, samt potensialet som et legemiddelmål.
Mens tilpassede automatiserte TSA-visualiseringspaneler viste seg å være vellykkede for romlige proteomikkanalyser, kunne anvendelsen av disse analysene for romlige transkriptomikkanalyser ikke bekreftes. Dette skyldes mest sannsynlig reagensene og protokollen som brukes til de automatiserte visualiseringsprotokollene, som ser ut til å kompromittere RNA-integriteten. Erkjennelsen av at en automatisert merkingsprotokoll for visualiseringsmarkører kan brukes til romlige proteomikkanalyser, men ikke for romlige transkriptomikkanalyser, gir viktig veiledning om Spatial Omics teknologianalysedesign.
I tillegg viser studien at den romlige transkriptomikkanalysen kan brukes til å profilere mål i regioner så små som 50 μm i diameter, eller omtrent 15 celler. To ROIer i forskjellige størrelser ble valgt for å teste analysens evne til også å oppdage transkripsjoner i små avkastninger. For hver interesseregion ble oligoer tilsvarende 1,800 mRNA-mål samlet og gjort til biblioteker i henhold til den romlige profileringsplattformprotokollen. Biblioteker ble individuelt indeksert, deretter samlet og sekvensert. Dette tillot evalueringen av både pooling effektivitet og evnen til å identifisere spesifikke cellepopulasjoner i små avkastninger.
Dette papiret viser at for romlige proteomikkanalyser kan en automatisert protokoll for å veilede avkastningsvalg på spesifikke markører av interesse brukes til selektivt å målrette avhør av relevante vevsområder og karakterisere vevets romlige miljø. Videre demonstrerer vi at mindre avkastninger kan brukes til romlige transkriptomiske analyser for å oppdage og karakterisere spesifikke cellepopulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt menneskelig vev ble anskaffet fra kommersielle biobanker eller akkrediterte vevsbanker under garanti for at passende godkjenning fra Institutional Review Board og informert samtykke ble innhentet.
MERK: Protokollen utføres ved hjelp av Discovery Ultra og GeoMx Digital Spatial Profiler. Se materialtabellen for detaljer om reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Automatisert visualiseringsprotokoll for romlige proteomikkanalyser
- Program autostainer for å bruke fluorescerende visualiseringsantistoffer
- I autostainer-programvaren klikker du på hjem-knappen og velger Protokoller. Klikk deretter på Opprett / rediger protokoller og velg RUO DISCOVERY Universal som prosedyre.
- Klikk på Første sekvens > Deparaffinization > Depar v2. For Middels temperatur, velg 72 grader C, klikk deretter på Forbehandling og velg Cell Conditioning og CC1 Reservoir. For Svært høy temperatur, velg 100 grader C, klikk deretter på CC1 8 Min og fortsett å klikke til CC1 64 Min er valgt.
- Klikk på Inhibitor > DISCOVERY Inhibitor, og velg 8 minutter for Inkubasjonstid. Klikk deretter på Antistoff > High Temp Ab Inkubasjon; for lav temperatur, velg 37 grader C; for Antistoff, velg antistoffnummeret fra dispenseretiketten (Antistoff 6 i dette eksemplet); for Pluss inkubasjonstid, velg 32 minutter.
MERK: Denne protokollen har tre forskjellige antistoffnumre. Det første antistoffet er FAP, det andre er Pan-Cytokeratin, og det tredje er antistoff X. - Klikk på Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, velg deretter Gt Ig Block for Antistoffblokkering, og velg 4 minutter for Inkubasjonstid. Deretter velger du OMap anti-Rb HRP på Multimer HRP-reagens, og for Inkubasjonstid velger du 16 minutter. Klikk deretter på Cy5, og velg 0 Hr 8 min for lang inkubasjonstid.
- Klikk på Dual Sequence og velg Antibody Denaturation, velg deretter Antibody Denature CC2-1, og for Very High Temperature, velg 100 Grader C. Sørg for at inkubasjonstiden er 8 min. Deretter klikker du på DS Inhibitor og velger Nøytraliser.
- Klikk på DS antistoff, og velg 37 grader C for svært lav temperatur. Velg deretter antistoffnummeret fra dispenseretiketten (Antistoff 3 i dette eksemplet), og velg 32 minutter under Pluss inkubasjonstid.
- Klikk på DS Multimer HRP og velg DS Multimer HRP Blocker. Deretter, for Antistoffblokkering, velg Gt Ig Block, og velg 4 minutter for Inkubasjonstid. Deretter velger du OMap anti-Ms HRP på Multimer HRP-reagens, og for Inkubasjonstid velger du 16 minutter. Klikk deretter på DS Rhodamine 6G, og velg 0 timer 8 min for lang inkubasjonstid.
- Klikk på Triple Stain og velg TS Antibody Denaturation, velg deretter Antibody Denature CC2-2, og for Very High Temperature, velg 100 Grader C. Sørg for at inkubasjonstiden er 8 min. Klikk deretter på TS Inhibitor og velg TS Neutralize.
- Klikk på TS antistoff, og for svært lav temperatur, velg 37 grader C. Velg deretter antistoffnummeret fra dispenseretiketten (Antistoff 7 i dette eksemplet) i Antistoff, og velg 32 minutter for Plus Inkubasjonstid.
- Klikk på TS Multimer HRP og velg TS Multimer HRP Blocker. Deretter, for Antistoffblokkering, velg Gt Ig Block, og velg 4 minutter for Inkubasjonstid. Deretter velger du OMap anti-Rb HRP på Multimer HRP-reagens, og for Inkubasjonstid velger du 16 minutter. Klikk deretter på TS FAM, og velg 0 Hr 8 Min for Lang inkubasjonstid.
- Legg til en tittel i protokollen. Velg et protokollnummer, legg til en kommentar, og klikk på Aktiv etterfulgt av Lagre.
- Klargjøre lysbilder, skrive ut etiketter og starte autostainer-kjøringen
- Bakeleverandøren anskaffet FFPE (Formalin-fixed, paraffin-embedded) menneskevevsseksjoner i en ovn satt til 70 °C i 20-60 min. Mens lysbildene baker, skriver du ut etiketter ved å klikke på Opprett etikett i autostainer-programvaren. Deretter klikker du på Protokoller, velger protokollnummeret og klikker på Lukk / Skriv ut. Legg til relevant informasjon på lysbildeetiketten og klikk på Skriv ut.
- Ta lysbildene ut av ovnen og la dem avkjøles til romtemperatur (RT). Bruk de tidligere utskrevne protokolletikettene på de tilsvarende lysbildene.
- Last påfyllbare antistoffdispensere med antistoffer i henhold til antistoffetikettnummeret tildelt i trinn 1.1. I denne protokollen bruker du antistoff 6 for FAP ved 1 μg/ml, bruker antistoff 3 for pan-cytokeratin ved 0,1 μg/ml og bruker antistoff 7 for antistoff X ved 2,5 μg/ml. Fortynn hvert antistoff i det angitte fortynningsmiddelet og prime de påfyllbare antistoffdispenserne.
- Samle blokkering, deteksjon og forsterkning ferdigfylte reagensdispensere nevnt ovenfor og legg dem på et reagensbrett. Last inn lysbilder i lysbildeskuffene (opptil 30 lysbilder per kjøring) og klikk på Kjører etterfulgt av Ja. Merk at DAPI ikke brukes til kjernefysisk motangrep.
- Bekreft starten av kjøringen ved å sjekke kjørevarigheten på autostainer-programvaren. Protokollen tar ~ 11 timer for ferdigstillelse og kan kjøre over natten.
- Neste dag må du sørge for at kjøringen er fullført ved å observere grønne blinkende lys på sporene i skyvebrettet. Ta deretter lysbildene av instrumentet og skyll lysbildene kraftig i 1x reaksjonsbuffer til væskedekselløsningen er helt fjernet.
- Romlig profileringsplattformprotokoll for proteomikkanalyse
- Følg den romlige proteomikkprotokollen som er angitt i notatet nedenfor. Inkluder følgende endringer i protokollen for å aktivere 3-plex automatisert merkingsprosedyre.
- Utfør trinn 1.2.1-1.2.6 dagen før du starter den romlige proteomikkprotokollen og gå rett til antigeninnhentingstrinnet i den romlige proteomikkprotokollen etter å ha utført trinn 1.2.6. Utelat visualiseringsprosedyren som er skissert i protokollen for romlig profileringsproteomikk.
- Bytt ut SYTO 13 med SYTO 64 ved 5000 nM for å muliggjøre fluoroforintegrasjon. Fortynn SYTO 64 i 1x TBS og inkuber i et fuktighetskammer i 15 minutter.
- Når du setter opp skanneparametrene i den romlige profileringsplattformen, velger du filtrene og fokuseringskanalene i henhold til fluoroforene som brukes i visualiseringspanelet for å tillate 3-plex-integrasjon. Bruk FITC for DISCOVERY FAM og sett eksponeringen til 200 ms, bruk Cy3 for DISCOVERY Rhodamine 6G og sett eksponeringen til 200 ms, bruk Texas Red for SYTO 64 og sett eksponeringen til 50 ms (spesifiser dette som fokuskanal), og til slutt, bruk Cy5 for DISCOVERY Cy5, sett eksponeringen til 200 ms, og lagre endringer.
MERK: Detaljerte instruksjoner for protokollen for romlig profileringsproteomikk finner du på den offisielle nettsiden Support-fanen ved å velge Dokumentasjon > brukerhåndbøker. Her, se etter proteinprotokollen for nCounter ved hjelp av Bond RX.
2. Valg av avkastning for romlige transkriptomikkanalyser
- Stek FFPE cellepelletsseksjoner i en ovn satt til 70 ° C i 20-60 min. Følg NGS-protokollen for den romlige profileringsplattformen som er angitt i notatet nedenfor, og skann lysbilder på den romlige profileringsplattformen, og velg størrelser på 50 μm og 300 μm. Følgende anbefaling er uthevet for spatial transcriptomics assay:
- Når du klargjør biblioteket, hvis ulike størrelser på avkastninger ble valgt, samler du avkastninger av lignende størrelser for å lage ett bibliotek per størrelse. Dette er for å sikre at tilstrekkelige sekvenseringsdybder oppnås for alle avkastninger uten skjevhet fra størrelse.
MERK: Detaljerte instruksjoner for den romlige profileringsplattformen finner du på det offisielle nettstedet Support-fanen ved å velge Dokumentasjon > brukerhåndbøker. Her ser du etter RNA-protokollen for NGS-applikasjoner som bruker Bond RX.
- Når du klargjør biblioteket, hvis ulike størrelser på avkastninger ble valgt, samler du avkastninger av lignende størrelser for å lage ett bibliotek per størrelse. Dette er for å sikre at tilstrekkelige sekvenseringsdybder oppnås for alle avkastninger uten skjevhet fra størrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Automatisert visualiseringsprotokoll for å veilede valg av avkastning
I dette papiret presenterer vi bruken av en automatisert, tilpasset TSA-basert IF-protokoll for å visualisere vevet og velge spesifikke avkastninger. Visualiseringspanelutvikling ved bruk av melanom og menneskelig normal hud som kontrollvev besto av epitopstabilitetstesting, finjustering av markørintensiteter og blødningsvurdering gjennom la en ut kontroller. For å teste om epitopstabiliteten til antistoffene påvirkes av repeterende elueringstrinn, ble FAP- og antistoff X-signaler kvalitativt vurdert etter merking i hver posisjon av 3-plex. Antistoff X-signalet var konsistent i alle posisjoner, mens FAP-signalintensiteten avtok etter én eluering (figur 2). Tidligere interne studier viste at panCK-epitopen er stabil gjennom en 3-plex analyse. Derfor ble FAP valgt til å være i 1st posisjon i 3-plex, panCK ble plassert i 2nd, og antistoff X i 3rd posisjon. Siden FAP-signalet generelt var svakere sammenlignet med antistoff X og panCK, ble FAP parret med den lysere fluoroforen, Cy5.
Den automatiserte 3-plex ble optimalisert med la en ut kontroller, der hver markør ble utelatt fra 3-plex protokollen en gang for å bekrefte at det ikke var noen gjennomblødning i nabokanaler (figur 3).
Fluoroforene som brukes på den automatiserte fargeplattformen ble testet på den romlige profileringsplattformen for å bekrefte at filtrene er kompatible med TSA-fluoroforene i 3-plex visualiseringspanelet. Siden 3-plex-protokollen bruker FITC, Cy3 og Cy5, og DAPI-kanalen brukes til UV-spaltning på den romlige profileringsplattformen, måtte en kjernefysisk motvekt i Texas Red-kanalen brukes. To forskjellige kjernefarger, SYTO 59 og SYTO 64, ble testet, og fargestoffene viste et tydelig kjernefysisk signal i kolonvev. SYTO 59 viste imidlertid også noe gjennomfallende signal i Cy5-kanalen mens Cy5-kanalen var ren ved bruk av SYTO 64 (figur 4). Derfor var SYTO 64 det foretrukne valget for kjernefysisk deteksjon.
Videre testing av SYTO 64 viste at dette fargestoffet ikke var fotostabilt og fotobleket raskt under bildebehandling. Når signalet er bleket, fokuserer bildesystemet på bakgrunnen, som kan tolkes som et ikke-spesifikt signal (figur 5). Å øke konsentrasjonen av kjernefargestoffet for å øke signalintensiteten bidro til å minimere dette problemet.
Vev merket med panCK / CD45 manuell visualiseringsprotokoll, som bruker direkte konjugerte antistoffer, ble sammenlignet med vev merket med panCK / FAP / Antibody X automatisert tilpasset visualiseringsprotokoll. Begge protokollene deler panCK som en felles markør, og signalet var sammenlignbart mellom de to protokollene (figur 6).
For å sikre at en modifisert visualiseringsprotokoll ikke har noen innvirkning på oppstrøms romlig proteomikkanalyse, sammenlignet vi telleverdiene som ble oppnådd etter innsamling av romlig profileringsplattform og telleplattformbehandling ved bruk av panCK/CD45 manuell visualiseringsprotokoll. Dette bruker direkte konjugerte antistoffer eller 3-plex automatisert tilpasset visualiseringsprotokoll, som bruker TSA. Fire kolorektal kreft (CRC) vev ble merket med panCK / CD45 manuell visualiseringsprotokoll eller 3-plex automatisert tilpasset visualiseringsprotokoll i kombinasjon med spatial proteomics assay. Lignende avkastninger ble valgt for hver protokoll, og telledata for de tilsvarende avkastningene ble sammenlignet ved hjelp av rengjøringsnormalisering for S6 og Histone. Lignende trender ble observert mellom disse ROIene som vist i log2-varmekartet (figur 7A), med en Spearman R-verdi på 0,88 for alle markører som inngår i spatial proteomics assay (figur 7B). Av de 31 antistoffene som ble brukt i analysene, hadde 23 antistoffer en Spearman R-verdi høyere enn eller lik 0,5.
Siden romlig proteomikk og transkriptomiske protokoller er forskjellige, evaluerte vi om den automatiserte visualiseringsprotokollen også kunne brukes på romlige transkriptomikkanalyser. Den automatiserte visualiseringsprotokollen krever at IHC-analysen utføres før RNA-deteksjon, mens den opprinnelige manuelle protokollen oppdager RNA først før visualiseringsprotokollen brukes. Den 3-plex automatiserte visualiseringsprotokollen ble testet side om side med CK / CD45 manuell visualiseringsprotokoll i kombinasjon med spatial transcriptomics assay. Sekvenseringsdata for 3-plex automatisert visualiseringsprotokoll kvartil 3-telling (Q3), normalisert på den romlige profileringsprogramvaren, presenterte lavere verdier sammenlignet med CK / CD45 manuell visualiseringsprotokoll (figur 8A), som også gjenspeiles av de lave Spearman R-verdiene på 0,15 (figur 8B). Det ble også observert et tap av dynamisk område ved bruk av 3-plex visualisering automatisert protokoll (figur 8C).
Dette tapet av tellinger med den automatiserte visualiseringsprotokollen indikerer at denne protokollen kompromitterer RNA-integriteten, og at det er nødvendig å oppdage RNA før visualiseringsanalysen utføres for å bevare RNA-kvaliteten. Siden dette automatiserte visualiseringspanelet krever at proteindelen utføres før RNA-deteksjon, er denne protokollen ikke egnet for RNA-analyser.
Størrelse på avkastningsvalg i romlige transkriptomikkanalyser
For bedre å forstå virkningen av ROI-størrelse på RNA-datautgang, ble RNA-tellinger av forskjellige størrelser ROIer sammenlignet. Den romlige transkriptomikkanalysen ble utført på SUDHL1- og JURKAT-cellelinjer for å minimere forskjeller som er forbundet med vev. Sirkulære avkastninger på 50 μm og 300 μm diameter ble valgt og sammenlignet med hverandre ved hjelp av Q3 normalisering på den romlige profileringsprogramvaren. RNA-tellinger for utvalgte mål på forskjellige cellelinjer var sammenlignbare mellom de to ROI-størrelsene etter normalisering (figur 9A, B).
Figur 1: Arbeidsflyt for digital romprofilering. (A) Lysbilder er merket med antistoffer (spatial proteomics assay) eller prober (spatial transcriptomics assay) samt visualiseringsmarkører. (B) Lysbilder plasseres på den romlige profileringsplattformen for å avbilde og velge avkastningsnivåer. (C) Oligoer spaltes av UV-lys og samles i en 96-brønns plate. Denne prosessen gjentas for hver valgte avkastning. (D) Prøvene behandles, og data genereres ved hjelp av telleplattformen eller en sequencer. Dette tallet er endret fra Nanostring teknologier nettsted 4,5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Epitop stabilitet. (A-C) Antistoff X og (D-F) FAP testet på henholdsvis human normal hud og melanom. Hver markør i (A,D) 1st, (B,E) 2 nd og (C,F) 3rd posisjon av en 3-plex. Antistoff X er stabil i alle posisjoner, mens (D) FAP viser synkende signalintensitet etter (E-F) henholdsvis en og to elueringer. Antistoff X i grønt, FAP i rødt, DAPI i grått. Skalastenger er på 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Utelate én kontroller for 3-plex automatisert tilpasset visualiseringsprotokoll på humant pankreasvev. For alle bilder er antistoff X avbildet i grønt, panCK i cyan og FAP i rødt. Den første raden viser (A) 3-plex og enkeltkanalene for (B) antistoff X i FITC, (C) panCK i Cy3 og (D) FAP i Cy5. Den andre raden viser utelat en ut-kontroll 3-plex for (E) antistoff X og (F-H) enkeltkanalene for hver markør. Den tredje raden viser la en ut-kontroll 3-plex for (I) panCK og (J-L) enkeltkanalene for hver markør. Den fjerde raden viser utelat en ut-kontroll 3-plex for (M) FAP og (N-P) enkeltkanalene for hver markør. Ingen blødning ble observert i noen av utelatelseskontrollene som indikert av mangel på signal i de tilsvarende kanalene når de ble testet (F) uten FAP, (K) uten panCK og (P) uten antistoff X. Skalastenger er på 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: SYTO fargestofftesting. Texas Rød kanal viser atomsignalet i Kolon for (A) SYTO 59 med blødning til (B) Cy5-kanal (rød). Texas Red-kanalen viser atomsignalet i Colon for (D) SYTO 64 uten å blø gjennom i (E) Cy5-kanalen. Texas Red og Cy5 kanaler i Colon vises sammen for å vise (C) blø gjennom av SYTO 59 og (F) ingen blødning for SYTO 64. Skalastenger er på 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: SYTO 64 fotostabilitet. Kolonprøver merket med SYTO 64 (A) før og (B) etter fotobleking. Bilde B viser det uspesifikke signalet som blir mer synlig etter kjernefysisk signaltap. Skalastenger er på 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Sammenligning av panCK-merking . panCK-signal på prøver av kolorektal kreft (CRC) med (A) panCK/CD45 manuell visualiseringsprotokoll og (B) panCK/FAP/Antibody X automatisert visualiseringsprotokoll. Ingen forskjeller i panCK-signal ble observert mellom de to protokollene. Skalastenger er på 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Sammenligning av telleverdier for romlig proteomikkanalyse ved hjelp av to forskjellige visualiseringsprotokoller på lignende avkastning på fire CRC-vev. (A) Logg 2 Varmekart over alle markørene som er inkludert i den romlige proteomikkanalysen som sammenligner den manuelle panCK/CD45-protokollen (svart) med den automatiserte 3-plex-protokollen (grå). (B) Logg 2 Spearman-korrelasjon for alle markørene presenterer en R-verdi på 0,88. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 7 Software eller med Python programmeringsspråk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Sammenligning av telleverdier for spatial transcriptomics-analysen ved hjelp av to forskjellige visualiseringsprotokoller. (A) Logg 2 Varmekart over utvalgte mål inkludert i spatial transcriptomics-analysen som sammenligner den manuelle panCK/CD45-protokollen (svart) med den 3-plex automatiserte protokollen (grå). (B) Logg 2 Spearman-korrelasjon for alle markørene presenterer en R-verdi på 0,15. (C) Middelverdien (blå) og standardavviket der det dynamiske området går tapt i den 3-plex automatiserte protokollen. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 7 Software eller med Python programmeringsspråk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Sammenligning av RNA-tallverdier for spatial transcriptomics-analysen på cellepellets. Sammenlignbare resultater ble observert for 50 μm (svart) og 300 μm (grå) diameter avkastning for utvalgte mål på (A) SUDHL1 og (B) JURKAT cellelinjer. Ingen signifikant forskjell ble observert ved bruk av t-test. Gjennomsnitt og standardavvik vist for n = 3 avkastninger per størrelse. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 7 Software. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til dags dato er direkte konjugerte fluorescerende antistoffer i en manuell protokoll mest brukt som visualiseringspaneler for romlig proteomikk eller romlige transkriptomikkanalyser 9,10. Imidlertid kan bruk av direkte konjugerte fluorescerende antistoffer være utfordrende for mindre rikelige markører, noe som begrenser valget av egnede antistoffer. Denne protokollen viser at merking av visualiseringsmarkører kan automatiseres på en automatisert fargeplattform ved hjelp av TSA-teknologier for å støtte romlige proteomikkanalyser. Dette gir mer fleksibilitet i tilpasningen av visualiseringspaneler, noe som muliggjør et mer målrettet avkastningsvalg og innsamling av relevante biologiske data fra bestemte områder av et vev. TSA-teknologi tillater også visualisering av markører med lav overflod, og øker dermed antall potensielle egnede antistoffer. I tillegg sikrer automatisering av visualiseringsprotokollen reproduserbarhet og kvalitet på merkingsprosedyren.
Utvikling av en 3-plex IF-analyse krever nøye vurdering av markør-/fluoroforsignalintensiteter på passende kontrollvev. Det anbefales å titrere antistoffkonsentrasjoner for å oppnå det beste signal-til-støy-forholdet, noe som vil bidra til å minimere blødning i tilstøtende kanaler. Videre bør epitopstabilitet for hver markør av interesse testes for å sikre at epitopen ikke påvirkes av gjentatte elueringstrinn. Når rekkefølgen av antistoffer i panelet er bekreftet, må analysen finjusteres ved hjelp av la en ut kontroller. Her utelates en bestemt markør i panelet, og den tilsvarende kanalen i det anskaffede bildet gjennomgås for gjennomfallende og kryssprat.
Det ble vist her at TSA-baserte analyser kan avbildes på den romlige profileringsplattformen, og at DAPI-alternativer må brukes til kjernefarging. Vi testet SYTO-fargestoffer og bestemte oss for at når vi bestemmer oss for hvilket SYTO-fargestoff som skal brukes, må signalet vurderes nøye for å unngå gjennomblødning i tilstøtende kanaler. En annen begrensning ved bruk av SYTO-fargestoffer er at noen SYTO-fargestoffer fotoblekes raskere, for eksempel SYTO 64 og SYTO 83 (interne data), noe som kan påvirke kjernefysisk kvantifisering. Derfor bør lyseksponering av de flekkete lysbildene unngås så mye som mulig. Andre grupper har vist bruken av SYTO 1311,12, som er mer fototable (interne data) og kan brukes i et panel så lenge markørene av interesse er tildelt fluoroforer som er kompatible med det valgte kjernefysiske fargestoffet.
Mens automatiserte TSA-baserte fluorescerende analyser fungerte bra for visualisering i kombinasjon med romlige proteomikkanalyser, ble det her bestemt at kombinasjon av en 3-plex automatisert visualiseringsprotokoll med en romlig transkriptomikkprotokoll resulterte i tap av dynamisk område, noe som kan skyldes de tøffere protokollbetingelsene for å legge til ekstra antigeninnhenting / elueringstrinn som kan påvirke RNA-integriteten. Derfor bør den 3-plex automatiserte visualiseringsprotokollen bare tilpasses for proteomikkanalyser, noe som er en begrensning og krever alternative visualiseringsmetoder for RNA-baserte analyser. Som et alternativ til visualisering av samme lysbilde, kan serielle seksjoner farget med markører av interesse legges over for å lette avkastningsvalg13. I tillegg beskriver litteraturen bruken av in situ hybridisering på tilstøtende lysbilder for å veilede avkastningsvalg14. Imidlertid kan disse tilnærmingene begrenses av vevstilgjengelighet, seksjon-til-seksjon-variabilitet og celle-til-celle-registreringer.
Vi testet også brukervennligheten til forskjellige ROI-størrelser for romlige transkriptomikkanalyser. Ved å bruke små avkastninger på 50 μm kan forskeren samle inn data fra bestemte regioner, slik at en mer detaljert avlesning av utvalgte celler eller interesseområder. Begrensninger ved å velge små avkastninger er at antallet celler som er til stede, kanskje ikke er rikelig nok til å få telleverdier som kan skilles fra bakgrunnen. Et alternativ er å velge rene cellepopulasjoner for å fange mindre rikelige mål. Valg av avkastning for enkeltceller er imidlertid begrenset av høyt signal-til-støy-forhold15. Videre er det viktig å vurdere ROI-størrelser for bibliotekforberedelse hvis ROIer i forskjellige størrelser samles inn i et enkelt eksperiment. Hvis ROI-størrelsene varierer betydelig, kan det være fordelaktig å slå sammen avkastningsøkninger i henhold til størrelsene og konstruere separate biblioteker for å forhindre at store avkastninger blir overrepresentert i ett bibliotek. Dette vil også sikre at hver avkastning vil få tilstrekkelig sekvenseringsdekning i henhold til størrelsen.
Andre faktorer å vurdere når du utfører Spatial Omics-eksperimenter er at dataene kan vise variasjoner på grunn av lysbilde-til-lysbilde-variabilitet, og lavere uttrykk for visse mål kan få opp bakgrunn og forskjeller i korrelasjonsverdier. Tilstrekkelige kontroller og normaliseringsmetoder må vurderes når du planlegger eksperimenter og evaluerer data. For romlige proteomikkanalyser på nCounter er normalisering til rengjøringsmål eller til den negative kontrollen IgG de foretrukne metodene i henhold til intern erfaring og leverandøranbefalinger der korrelasjonen mellom rengjøringsmålene eller til den negative kontrollen IgG må evalueres16. Men avhengig av vevene som brukes, må den beste normaliseringen defineres for hver studie17,18. For eksempel sier litteraturen at for brystkreft Spatial Omics-studier har GAPDH, som ofte brukes til å normalisere til rengjøringsmål, vært mindre konkordant enn S6 og Histone19. Derfor har S6 og Histone vært de anbefalte rengjøringsmålene for normalisering i brystkreftvev19.
For romlige transkriptomikkanalyser må normaliseringsstrategier defineres avhengig av studiedesignet (f.eks. vevstyper og avkastning). Noen strategier som brukes i RNA-Seq, for eksempel upperquartile eller trimmet gjennomsnitt av M-verdier (TMM) normalisering, kan brukes til å normalisere sekvenserte data19,20.
Romlige transkriptomikkanalyser gir informasjon om tusenvis av mål og blir stadig mer vanlig brukt til å utforske hele transkriptomet, hvor spesifikke TME-rom velges og analyseres i forbindelse med enkeltkjerne RNA-seq20 eller encellet RNA-sekvensering21. Vi viste at visualiseringsprotokoller for å veilede avkastningsvalg for å vurdere den romlige fordelingen av mål kunne automatiseres for romlige proteomikkanalyser, men ikke for romlige transkriptomikkanalyser. I tillegg presenterer vi at avkastninger så små som 50 μm kan velges for å tillate en mer grundig undersøkelse av en bestemt vevsregion. Fremtidige anvendelser av denne teknologien vil forbedre forståelsen av tumormikromiljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan og Sandra Rost er ansatte og aksjonærer i Genentech, medlem av Roche-konsernet. Andre selskaper som er en del av Roche produserer reagenser og instrumenter som brukes i dette manuskriptet. Ciara Martin er heltidsansatt i NanoString Technologies Inc, som produserer reagenser og instrumenter som brukes i dette manuskriptet.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Thomas Wu for behandling av NGS-filer. Vi takker James Ziai for resultatdiskusjonene og manuskriptgjennomgangen og Meredith Triplet og Rachel Taylor for intern manuskriptrevisjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
