Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

التنميط المكاني للبروتين وتعبير الحمض النووي الريبي في الأنسجة: نهج لضبط التشريح المجهري الافتراضي

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/62651
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 1
1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا لضبط مناطق الاهتمام (ROIs) لتقنيات Spatial Omics لتوصيف البيئة المكروية للورم بشكل أفضل وتحديد مجموعات خلايا معينة. بالنسبة لفحوصات البروتينات ، يمكن للبروتوكولات المخصصة الآلية توجيه اختيار عائد الاستثمار ، بينما يمكن ضبط فحوصات النسخ باستخدام عائد استثمار صغير يصل إلى 50 ميكرومتر.

Abstract

يتيح تعدد الإرسال تقييم العديد من العلامات على نفس النسيج مع توفير السياق المكاني. تسمح تقنيات Omics المكانية بتعدد إرسال كل من البروتين والحمض النووي الريبي من خلال الاستفادة من الأجسام المضادة والمجسات الموسومة بالصور ، على التوالي. يتم شق Oligos وقياسها كميا من مناطق محددة عبر الأنسجة لتوضيح البيولوجيا الأساسية. هنا ، توضح الدراسة أنه يمكن استخدام بروتوكولات تصور الأجسام المضادة المخصصة الآلية لتوجيه اختيار عائد الاستثمار بالتزامن مع فحوصات البروتينات المكانية. لم تظهر هذه الطريقة المحددة أداء مقبولا مع فحوصات النسخ المكاني. يصف البروتوكول تطوير مقايسة 3-plex immunofluorescent (IF) لتصور العلامة على منصة آلية ، باستخدام تضخيم إشارة التيراميد (TSA) لتضخيم إشارة الفلورسنت من هدف بروتين معين وزيادة تجمع الأجسام المضادة للاختيار من بينها. تم أتمتة بروتوكول التصور باستخدام اختبار 3-plex تم التحقق من صحته بدقة لضمان الجودة وقابلية الاستنساخ. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم تبادل DAPI لأصباغ SYTO للسماح بتصوير مقايسات IF القائمة على TSA على منصة التنميط المكاني. بالإضافة إلى ذلك ، اختبرنا القدرة على اختيار عائد استثمار صغير باستخدام مقايسة النسخ المكاني للسماح بالتحقيق في مجالات اهتمام محددة للغاية (على سبيل المثال ، المناطق المخصبة لنوع خلية معين). تم جمع عائد الاستثمار بقطر 50 ميكرومتر و 300 ميكرومتر ، وهو ما يتوافق مع حوالي 15 خلية و 100 خلية على التوالي. تم عمل العينات في المكتبات وتسلسلها للتحقيق في القدرة على اكتشاف الإشارات من عائد الاستثمار الصغير والمناطق الخاصة بالملف الشخصي في الأنسجة. لقد قررنا أن تقنيات البروتينات المكانية تستفيد بشكل كبير من البروتوكولات الآلية الموحدة لتوجيه اختيار عائد الاستثمار. على الرغم من أن بروتوكول التصور الآلي هذا لم يكن متوافقا مع فحوصات النسخ المكاني ، فقد تمكنا من اختبار وتأكيد أنه يمكن اكتشاف مجموعات خلايا معينة بنجاح حتى في عائد الاستثمار الصغير باستخدام بروتوكول التصور اليدوي القياسي.

Introduction

يستمر التقدم في تقنيات تعدد الإرسال في توفير أدوات توصيف أفضل للأهداف الموجودة في الأورام. البيئة المكروية للورم (TME) هي نظام معقد من الخلايا السرطانية ، والخلايا المناعية المتسللة ، والسدى ، حيث تكون المعلومات المكانية ضرورية لفهم وتفسير آليات التفاعل بين المؤشرات الحيوية ذات الأهميةبشكل أفضل 1. مع التقنيات الناشئة مثل GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) و 10x Visium ، يمكن اكتشاف أهداف متعددة وقياسها كميا في وقت واحد ضمن سياقها المكاني. يمكن أن يؤدي استخدام بروتوكولات التألق المناعي التي تسهل تصور الأنسجة إلى زيادة تحسين قدرات التنميط المكاني لهذه التقنيات.

تتكون تقنية Spatial Omics التي ركزنا عليها لتطوير هذه الطريقة من البروتينات المكانية ومقايسات النسخ حيث يتم ربط oligonucleotides بالأجسام المضادة أو مجسات الحمض النووي الريبي عبر رابط ضوئي حساس للأشعة فوق البنفسجية. يتم تمييز الشرائح النسيجية بهذه الأجسام المضادة أو المجسات المترافقة ثم يتم تصويرها على منصة التنميط المكاني. بعد ذلك ، يتم اختيار عائد الاستثمار بأحجام وأشكال مختلفة للإضاءة ، ويتم استنشاق قليل النوكليوتيدات المشقوقة ضوئيا وتجميعها في لوحة ذات 96 بئرا. يتم تحضير قليل النيوكليوتيدات المشقوقة ضوئيا ليتم قياسها كميا إما باستخدام نظام Nanostring nCounter أو تسلسل الجيل التالي (NGS) 2,3 (الشكل 1) 4,5.

تختلف توزيعات الخلايا داخل الأنسجة ، والقدرة على توصيف مواقع محددة للخلايا باستخدام علامات محددة وأحجام عائد استثمار مختلفة لها أهمية كبيرة لفهم بيئة الأنسجة بشكل كامل وتحديد ميزات محددة. في تقنية Spatial Omics المذكورة هنا ، يستخدم بروتوكول التصور القياسي أجساما مضادة مترافقة مباشرة وهو بروتوكول يدوي. العلامات القياسية للتمييز بين الورم والسدى هي panCytokeratin (panCK) و CD45 6,7 ، ولكن هناك حاجة إلى علامات إضافية لاستهداف مجموعات خلايا معينة ذات أهمية. علاوة على ذلك ، فإن استخدام الأجسام المضادة الفلورية المترافقة مباشرة يفتقر إلى التضخيم ، مما يحد من اختيار الأجسام المضادة إلى علامات وفيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تخضع المقايسات اليدوية لتنوع أكبر من سير العمل الآلي8. لذلك ، من المستحسن أن يكون لديك بروتوكول تصور قابل للتخصيص وتلقائي ومضخم لاختيار عائد الاستثمار.

هنا ، توضح الدراسة أنه بالنسبة لمقايسات البروتينات المكانية ، يمكن استخدام تقنية TSA لبروتوكولات التصور على منصة آلية مما يؤدي إلى فحص أكثر استهدافا وتوحيدا. بالإضافة إلى ذلك ، تتيح المقايسات القائمة على TSA استخدام علامات منخفضة التعبير ، مما يزيد من نطاق الأهداف التي يمكن اختيارها للتصور. تم تطوير اختبار 3-plex ل panCK و FAP و Antibody X باستخدام منصة آلية حيث تم استخدام panCK و FAP للتمييز بين الورم والسدى ، على التوالي. الجسم المضاد X هو بروتين انسجة كثيرا ما يصادف في الأورام ، لكن بيولوجيته وتأثيره على المناعة المضادة للورم غير مفهومين تماما. يمكن أن يوضح توصيف النسيج المناعي في المناطق الغنية بالجسم المضاد X دوره في المناعة المضادة للورم والاستجابة العلاجية ، فضلا عن إمكاناته كهدف دوائي.

في حين أثبتت لوحات التصور TSA الآلية المخصصة نجاحها في فحوصات البروتينات المكانية ، لا يمكن تأكيد تطبيق هذه المقايسات لمقايسات النسخ المكاني. ويرجع ذلك على الأرجح إلى الكواشف والبروتوكول المستخدم لبروتوكولات التصور الآلي ، والتي يبدو أنها تعرض سلامة الحمض النووي الريبي للخطر. إن إدراك أنه يمكن استخدام بروتوكول وضع العلامات الآلي لعلامات التصور لمقايسات البروتينات المكانية ولكن ليس لفحوصات النسخ المكاني يوفر إرشادات مهمة حول تصميمات مقايسة تقنية Spatial Omics.

بالإضافة إلى ذلك ، توضح الدراسة أنه يمكن استخدام اختبار النسخ المكاني لتحديد الأهداف في مناطق صغيرة يصل قطرها إلى 50 ميكرومتر ، أو ما يقرب من 15 خلية. تم اختيار اثنين من عائد الاستثمار مختلفي الحجم لاختبار قدرة الفحص على اكتشاف النصوص أيضا في عائد الاستثمار الصغير. لكل منطقة ذات أهمية ، تم جمع oligos المقابلة لأهداف 1,800 mRNA وتحويلها إلى مكتبات وفقا لبروتوكول منصة التنميط المكاني. تمت فهرسة المكتبات بشكل فردي ، ثم تجميعها وتسلسلها. سمح ذلك بتقييم كل من كفاءة التجميع والقدرة على تحديد مجموعات خلايا معينة في عائد استثمار صغير.

توضح هذه الورقة أنه بالنسبة لفحوصات البروتينات المكانية ، يمكن استخدام بروتوكول آلي لتوجيه اختيار عائد الاستثمار على علامات محددة ذات أهمية لاستهداف استجواب مناطق الأنسجة ذات الصلة بشكل انتقائي وتوصيف البيئة المكانية للأنسجة. علاوة على ذلك ، أثبتنا أنه يمكن استخدام عائد استثمار أصغر لفحوصات النسخ المكاني لاكتشاف وتوصيف مجموعات خلايا معينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على جميع الأنسجة البشرية من البنوك الحيوية التجارية أو بنوك الأنسجة المعتمدة بموجب ضمان الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية المناسبة والموافقة المستنيرة.

ملاحظة: يتم تنفيذ البروتوكول باستخدام Discovery Ultra وملف التعريف المكاني الرقمي GeoMx. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الكواشف والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. بروتوكول التصور الآلي لفحوصات البروتينات المكانية

  1. برنامج autostainer لتطبيق الأجسام المضادة التصور الفلورسنت
    1. في برنامج autostainer ، انقر فوق زر الصفحة الرئيسية واختر البروتوكولات. ثم ، انقر فوق إنشاء / تحرير البروتوكولات وحدد RUO DISCOVERY Universal كإجراء.
    2. انقر فوق التسلسل الأول > Deparaffinization > Depar v2. بالنسبة لدرجة الحرارة المتوسطة ، اختر 72 درجة مئوية ، ثم انقر فوق المعالجة المسبقة وحدد تكييف الخلية وخزان CC1. للحصول على درجة حرارة عالية جدا ، اختر 100 درجة مئوية ، ثم انقر فوق CC1 8 Min واستمر في النقر حتى يتم تحديد CC1 64 Min.
    3. انقر فوق المانع > مثبط DISCOVERY ، ولوقت الحضانة ، اختر 8 دقائق. ثم ، انقر فوق الأجسام المضادة > حضانة Ab عالية الحرارة. لدرجة حرارة منخفضة ، اختر 37 درجة مئوية ؛ بالنسبة للجسم المضاد ، اختر رقم الجسم المضاد من ملصق الموزع (الجسم المضاد 6 في هذا المثال) ؛ لوقت الحضانة الإضافية، حدد 32 دقيقة.
      ملاحظة: يحتوي هذا البروتوكول على ثلاثة أرقام مختلفة للأجسام المضادة. الجسم المضاد الأول هو FAP ، والثاني هو Pan-Cytokeratin ، والثالث هو الجسم المضاد X.
    4. انقر فوق Multimer HRP > Multimer HRP Blocking ، ثم لحظر الأجسام المضادة ، اختر Gt Ig Block ، ولوقت الحضانة ، اختر 4 دقائق. بعد ذلك ، في كاشف Multimer HRP ، حدد OMap anti-Rb HRP ، ولوقت الحضانة ، اختر 16 دقيقة. ثم ، انقر فوق Cy5 ، ولوقت الحضانة الطويل ، اختر 0 ساعة 8 دقيقة.
    5. انقر فوق تسلسل مزدوج واختر تمسخ الأجسام المضادة ، ثم حدد تشوه الجسم المضاد CC2-1 ، ولدرجة الحرارة العالية جدا ، اختر 100 درجة مئوية. تأكد من أن وقت الحضانة هو 8 دقائق. بعد ذلك ، انقر فوق DS Inhibitor وحدد تحييد.
    6. انقر فوق الجسم المضاد DS ، وللحصول على درجة حرارة منخفضة جدا ، اختر 37 درجة مئوية. بعد ذلك، في Antibody، اختر رقم الجسم المضاد من ملصق الموزع (الجسم المضاد 3 في هذا المثال)، وبالنسبة إلى Plus Incubation Time، حدد 32 دقيقة.
    7. انقر فوق DS Multimer HRP واختر DS Multimer HRP Blocker. ثم ، بالنسبة لحظر الأجسام المضادة ، حدد gt ig block ، ولوقت الحضانة ، اختر 4 دقائق. بعد ذلك ، في كاشف Multimer HRP ، حدد OMap anti-Ms HRP ، ولوقت الحضانة ، اختر 16 دقيقة. ثم ، انقر فوق DS Rhodamine 6G ، ولوقت الحضانة الطويل ، اختر 0 ساعة 8 دقيقة.
    8. انقر فوق Triple Stain وحدد TS Antibody Denaturation ، ثم حدد Antibody Denature CC2-2 ، ولدرجة الحرارة العالية جدا ، حدد 100 درجة مئوية. تأكد من أن وقت الحضانة هو 8 دقائق. بعد ذلك ، انقر فوق مثبط TS وحدد تحييد TS.
    9. انقر فوق TS Antibody ، وللحصول على درجة حرارة منخفضة جدا ، حدد 37 درجة مئوية. بعد ذلك، في الأجسام المضادة، حدد رقم الجسم المضاد من ملصق الموزع (الجسم المضاد 7 في هذا المثال)، وبالنسبة إلى وقت الحضانة الإضافية، حدد 32 دقيقة.
    10. انقر فوق TS Multimer HRP واختر مانع TS Multimer HRP. ثم ، بالنسبة لحظر الأجسام المضادة ، حدد gt ig block ، ولوقت الحضانة ، اختر 4 دقائق. بعد ذلك ، في كاشف Multimer HRP ، حدد OMap anti-Rb HRP ، ولوقت الحضانة ، اختر 16 دقيقة. ثم ، انقر فوق TS FAM ، ولوقت الحضانة الطويل ، اختر 0 ساعة 8 دقيقة.
    11. أضف عنوانا إلى البروتوكول. حدد رقم بروتوكول ، وأضف تعليقا ، وانقر فوق نشط متبوعا بحفظ.
  2. قم بإعداد الشرائح وطباعة الملصقات وبدء تشغيل جهاز التلوين التلقائي
    1. اشترى بائع المخبوزات FFPE (ثابت بالفورمالين ، مضمن بالبارافين) أقسام الأنسجة البشرية في فرن مضبوط على 70 درجة مئوية لمدة 20-60 دقيقة. أثناء خبز الشرائح، اطبع الملصقات بالنقر فوق إنشاء ملصق في برنامج التلوين التلقائي. بعد ذلك ، انقر فوق البروتوكولات ، وحدد رقم البروتوكول ، وانقر فوق إغلاق / طباعة. أضف المعلومات ذات الصلة على ملصق الشريحة وانقر فوق طباعة.
    2. أخرج الشرائح من الفرن واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتطبيق تسميات البروتوكول المطبوعة مسبقا على الشرائح المقابلة.
    3. قم بتحميل موزعات الأجسام المضادة القابلة لإعادة التعبئة بالأجسام المضادة وفقا لرقم ملصق الأجسام المضادة المعين في الخطوة 1.1. في هذا البروتوكول ، استخدم الأجسام المضادة 6 ل FAP عند 1 ميكروغرام / مل ، واستخدم الجسم المضاد 3 ل Pan-Cytokeratin عند 0.1 ميكروغرام / مل ، واستخدم الجسم المضاد 7 للجسم المضاد X عند 2.5 ميكروغرام / مل. قم بتخفيف كل جسم مضاد في المادة المخففة المحددة وقم بتجهيز موزعات الأجسام المضادة القابلة لإعادة التعبئة.
    4. اجمع موزعات الكواشف المملوءة مسبقا للحجب والكشف والتضخيم المذكورة أعلاه وضعها على صينية الكاشف. قم بتحميل الشرائح في أدراج الشرائح (حتى 30 شريحة لكل تشغيل) وانقر فوق تشغيل متبوعا بنعم. لاحظ أن DAPI لا يستخدم في التلوين النووي.
    5. قم بتأكيد بدء التشغيل عن طريق التحقق من مدة التشغيل على برنامج autostainer. يستغرق البروتوكول ~ 11 ساعة للإكمال ويمكن تشغيله بين عشية وضحاها.
    6. في اليوم التالي ، تأكد من اكتمال التشغيل من خلال مراقبة الأضواء الوامضة الخضراء على فتحات درج الانزلاق. بعد ذلك ، قم بإزالة الشرائح من الجهاز وشطف الشرائح بقوة في 1x Reaction Buffer حتى تتم إزالة محلول انزلاق الغطاء السائل تماما.
  3. بروتوكول منصة التنميط المكاني لفحص البروتينات
    1. اتبع بروتوكول البروتينات المكانية المشار إليه في الملاحظة أدناه. قم بتضمين التغييرات التالية على البروتوكول لتمكين إجراء وضع العلامات الآلي 3-plex.
    2. قم بتنفيذ الخطوات 1.2.1-1.2.6 في اليوم السابق لبدء بروتوكول البروتينات المكانية وانتقل مباشرة إلى خطوة استرجاع المستضد لبروتوكول البروتينات المكانية بعد تنفيذ الخطوة 1.2.6. حذف إجراء التصور الموضح في بروتوكول البروتينات التنميط المكاني.
    3. استبدل SYTO 13 ب SYTO 64 عند 5000 نانومتر لتمكين تكامل الفلوروفور. خفف SYTO 64 في 1x TBS واحتضانه في غرفة الرطوبة لمدة 15 دقيقة.
    4. عند إعداد معلمات المسح في منصة التنميط المكاني ، حدد المرشحات وقنوات التركيز وفقا للفلوروفورات المستخدمة في لوحة التصور للسماح بتكامل 3-plex. استخدم FITC ل DISCOVERY FAM واضبط التعرض على 200 مللي ثانية ، واستخدم Cy3 ل DISCOVERY Rhodamine 6G واضبط التعرض على 200 مللي ثانية ، واستخدم Texas Red ل SYTO 64 واضبط التعرض على 50 مللي ثانية (حدد هذا كقناة التركيز) ، وأخيرا ، استخدم Cy5 ل DISCOVERY Cy5 ، واضبط التعرض على 200 مللي ثانية ، وحفظ التغييرات.
      ملاحظة: توجد تعليمات مفصلة لبروتوكول البروتينات التنميط المكاني في علامة التبويب دعم الموقع الرسمي عن طريق تحديد الوثائق > أدلة المستخدم. هنا ، ابحث عن بروتوكول البروتين ل nCounter باستخدام Bond RX.

2. اختيار عائد الاستثمار لفحوصات النسخ المكاني

  1. تخبز أقسام حبيبات خلية FFPE في فرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 20-60 دقيقة. اتبع بروتوكول NGS لمنصة التنميط المكاني المشار إليه في الملاحظة أدناه وقم بمسح الشرائح على منصة التنميط المكاني ، واختيار أحجام 50 ميكرومتر و 300 ميكرومتر. تم تسليط الضوء على التوصية التالية لفحص النسخ المكاني:
    1. عند إعداد المكتبة ، إذا تم تحديد أحجام مختلفة من عائد الاستثمار ، فقم بتجميع عائد الاستثمار بأحجام مماثلة لإنشاء مكتبة واحدة لكل حجم. هذا لضمان تحقيق أعماق تسلسل كافية لجميع عائد الاستثمار دون تحيز من الحجم.
      ملاحظة: توجد تعليمات مفصلة لمنصة التنميط المكاني في علامة التبويب دعم الموقع الرسمي عن طريق تحديد الوثائق > أدلة المستخدم. هنا ، ابحث عن بروتوكول RNA لتطبيقات NGS باستخدام Bond RX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بروتوكول التصور الآلي لتوجيه اختيار عائد الاستثمار
في هذه الورقة ، نقدم استخدام بروتوكول IF آلي مخصص قائم على TSA لتصور الأنسجة وتحديد عائد استثمار محدد. تألف تطوير لوحة التصور باستخدام سرطان الجلد والجلد الطبيعي البشري كأنسجة تحكم من اختبار ثبات الحافة ، والضبط الدقيق لشدة العلامة ، وتقييم النزيف من خلال ترك واحد خارج الضوابط. لاختبار ما إذا كان استقرار الخلاصة للأجسام المضادة يتأثر بخطوات الشطف المتكررة ، تم تقييم إشارات FAP و Antibody X نوعيا بعد وضع العلامات في كل موضع من 3-plex. ظلت إشارة الجسم المضاد X متسقة في جميع المواضع ، بينما انخفضت شدة إشارة FAP بعد شطف واحد (الشكل 2). أظهرت الدراسات الداخلية السابقة أن حاتم panCK مستقر خلال فحص 3-plex. لذلك ، تم اختيار FAP ليكونفي المركز الأول في 3-plex ، وتم وضع panCK في 2nd ، و Antibody Xفي الموضع الثالث. نظرا لأن إشارة FAP كانت أضعف بشكل عام مقارنة بالجسم المضاد X و panCK ، فقد تم إقران FAP بالفلوروفور الأكثر إشراقا ، Cy5.

تم تحسين 3-plex الآلي باستخدام عناصر تحكم ترك واحدة ، حيث تم حذف كل علامة من بروتوكول 3-plex مرة واحدة للتأكد من عدم وجود نزيف في القنوات المجاورة (الشكل 3).

تم اختبار الفلوروفورات المستخدمة في منصة التلوين الآلية على منصة التنميط المكاني للتأكد من أن المرشحات متوافقة مع الفلوروفورات TSA في لوحة التصور 3-plex. نظرا لأن بروتوكول 3-plex يستخدم FITC و Cy3 و Cy5 ، ويتم استخدام قناة DAPI لانقسام الأشعة فوق البنفسجية على منصة التنميط المكاني ، كان لا بد من استخدام صبغة نووية في قناة تكساس الحمراء. تم اختبار صبغتين نوويتين مختلفتين ، SYTO 59 و SYTO 64 ، وأظهرت الأصباغ إشارة نووية مميزة في أنسجة القولون. ومع ذلك ، أظهر SYTO 59 أيضا بعض إشارات التسييل في قناة Cy5 بينما كانت قناة Cy5 نظيفة عند استخدام SYTO 64 (الشكل 4). لذلك ، كان SYTO 64 هو الخيار المفضل للكشف النووي.

أظهر اختبار إضافي ل SYTO 64 أن هذه الصبغة لم تكن قابلة للضوء وتم تبييضها ضوئيا بسرعة أثناء التصوير. بمجرد تبييض الإشارة ، يركز نظام التصوير على الخلفية ، والتي يمكن تفسيرها على أنها إشارة غير محددة (الشكل 5). ساعدت زيادة تركيز الصبغة النووية لزيادة شدة الإشارة في تقليل هذه المشكلة.

تمت مقارنة الأنسجة الموسومة ببروتوكول التصور اليدوي panCK / CD45 ، والذي يستخدم الأجسام المضادة المترافقة مباشرة ، بالأنسجة الموسومة ببروتوكول التصور المخصص الآلي panCK / FAP / ANTIBODY X. يشترك كلا البروتوكولين في panCK كعلامة مشتركة ، وكانت الإشارة قابلة للمقارنة بين البروتوكولين (الشكل 6).

للتأكد من أن بروتوكول التصور المعدل ليس له أي تأثير على مقايسة البروتينات المكانية المنبع ، قمنا بمقارنة قيم العد التي تم الحصول عليها بعد جمع منصة التنميط المكاني ومعالجة منصة العد عند استخدام بروتوكول التصور اليدوي panCK / CD45. يستخدم هذا الأجسام المضادة المترافقة مباشرة أو بروتوكول التصور المخصص الآلي 3-plex ، والذي يستخدم TSA. تم تمييز أربعة أنسجة لسرطان القولون والمستقيم (CRC) ببروتوكول التصور اليدوي panCK / CD45 أو بروتوكول التصور المخصص الآلي 3-plex بالاشتراك مع فحص البروتينات المكانية. تم اختيار عائد استثمار مماثل لكل بروتوكول ، وتمت مقارنة بيانات حساب عائد الاستثمار المقابلة باستخدام تطبيع التدبير المنزلي ل S6 و Histone. لوحظت اتجاهات مماثلة بين عائد الاستثمار هذا كما هو موضح في خريطة الحرارة log2 (الشكل 7 أ) ، مع قيمة Spearman R تبلغ 0.88 لجميع العلامات المدرجة في مقايسة البروتينات المكانية (الشكل 7 ب). من بين 31 جسما مضادا مستخدما في المقايسات ، كان ل 23 جسما مضادا قيمة Spearman R أعلى من أو تساوي 0.5.

نظرا لاختلاف البروتينات المكانية وبروتوكولات النسخ ، قمنا بتقييم ما إذا كان يمكن أيضا تطبيق بروتوكول التصور الآلي على مقايسات النسخ المكاني. يتطلب بروتوكول التصور الآلي إجراء اختبار IHC قبل اكتشاف الحمض النووي الريبي ، بينما يكتشف البروتوكول اليدوي الأصلي الحمض النووي الريبي أولا قبل تطبيق بروتوكول التصور. تم اختبار بروتوكول التصور الآلي 3-plex جنبا إلى جنب مع بروتوكول التصور اليدوي CK / CD45 بالاشتراك مع فحص النسخ المكاني. قدمت بيانات التسلسل لبروتوكول التصور الآلي 3-plex عدد الربع 3 (Q3) ، الذي تم تسويته على برنامج التنميط المكاني ، قيما أقل عند مقارنته ببروتوكول التصور اليدوي CCK / CD45 (الشكل 8 أ) ، والذي ينعكس أيضا في قيم Spearman R المنخفضة البالغة 0.15 (الشكل 8 ب). أيضا ، لوحظ فقدان النطاق الديناميكي عند استخدام البروتوكول الآلي للتصور 3-plex (الشكل 8C).

يشير فقدان الأعداد مع بروتوكول التصور الآلي إلى أن هذا البروتوكول يضر بسلامة الحمض النووي الريبي ، وأن اكتشاف الحمض النووي الريبي قبل إجراء فحص التصور ضروري للحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي. نظرا لأن لوحة التصور الآلي هذه تتطلب إجراء جزء البروتين قبل اكتشاف الحمض النووي الريبي ، فإن هذا البروتوكول غير مناسب لفحوصات الحمض النووي الريبي.

حجم اختيار عائد الاستثمار في فحوصات النسخ المكاني
لفهم تأثير حجم عائد الاستثمار على إخراج بيانات الحمض النووي الريبي بشكل أفضل ، تمت مقارنة عدد عائد الاستثمار بأحجام مختلفة. تم إجراء فحص النسخ المكاني على خطوط خلايا SUDHL1 و JURKAT لتقليل الاختلافات المتأصلة في الأنسجة. تم اختيار عائد استثمار دائري بقطر 50 ميكرومتر و 300 ميكرومتر ومقارنتها ببعضها البعض باستخدام تسوية Q3 على برنامج التنميط المكاني. كانت أعداد الحمض النووي الريبي لأهداف مختارة على خطوط خلايا مختلفة قابلة للمقارنة بين حجمي عائد الاستثمار بعد التطبيع (الشكل 9 أ ، ب).

Figure 1
الشكل 1: سير عمل التنميط المكاني الرقمي. (أ) يتم تمييز الشرائح بالأجسام المضادة (مقايسة البروتينات المكانية) أو المجسات (مقايسة النسخ المكاني) بالإضافة إلى علامات التصور. (ب) يتم وضع الشرائح على منصة التنميط المكاني لتصوير وتحديد عائد الاستثمار. (ج) يتم شق Oligos بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية ويتم جمعها في صفيحة من 96 بئرا. تتكرر هذه العملية لكل عائد استثمار محدد. (د) تعالج العينات، وتولد البيانات باستخدام منصة العد أو جهاز التسلسل. تم تعديل هذا الرقم من موقع تقنيات Nanostring 4,5. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: استقرار الحاشية. (أ - ج) تم اختبار الجسم المضاد X و (D-F) FAP على الجلد الطبيعي البشري وسرطان الجلد ، على التوالي. كل علامة في (A ، D) 1st ، (B ، E) 2nd ، و (C ، F) 3rd موضع 3-plex. الجسم المضاد X مستقر في جميع المواضع ، بينما يظهر (D) FAP انخفاضا في شدة الإشارة بعد (E-F) واحد واثنين من الشطف ، على التوالي. الجسم المضاد X باللون الأخضر ، FAP باللون الأحمر ، DAPI باللون الرمادي. قضبان المقياس عند 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: اترك أحد عناصر التحكم لبروتوكول التصور المخصص الآلي 3-plex على أنسجة البنكرياس البشرية. بالنسبة لجميع الصور ، يتم تصوير Antibody X باللون الأخضر ، و panCK باللون السماوي ، و FAP باللون الأحمر. يعرض الصف الأول (A) 3-plex والقنوات الفردية ل (B) الجسم المضاد X في FITC ، (C) panCK في Cy3 ، و (D) FAP في Cy5. يظهر الصف الثاني ترك واحد خارج السيطرة 3-plex ل (E) Antibody X و (F-H) القنوات الفردية لكل علامة. يظهر الصف الثالث عنصر التحكم 3-plex ل (I) panCK و (J-L) القنوات الفردية لكل علامة. يظهر الصف الرابع ترك واحد خارج السيطرة 3-plex ل (M) FAP و (N-P) القنوات الفردية لكل علامة. لم يلاحظ أي نزيف في أي من عناصر التحكم في ترك واحد كما هو موضح من خلال نقص الإشارة في القنوات المقابلة عند اختبارها (F) بدون FAP ، (K) بدون panCK ، و (P) بدون الجسم المضاد X. أشرطة المقياس عند 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: اختبار صبغة SYTO. تعرض قناة تكساس الحمراء الإشارة النووية في القولون ل (A) SYTO 59 مع النزف إلى (B) قناة Cy5 (حمراء). تظهر قناة تكساس الحمراء الإشارة النووية في القولون ل (D) SYTO 64 دون أن تنزف في قناة (E) Cy5. تم عرض قنوات Texas Red و Cy5 في القولون معا لإظهار (C) نزيف SYTO 59 و (F) لا ينزف ل SYTO 64. قضبان المقياس عند 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: SYTO 64 الثبات الضوئي. عينات القولون الموسومة ب SYTO 64 (A) قبل و (B) بعد التبييض الضوئي. توضح الصورة (ب) الإشارة غير المتخصصة التي تصبح أكثر وضوحا بعد فقدان الإشارة النووية. قضبان المقياس عند 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: مقارنة بين وضع العلامات panCK . إشارة panCK على عينات سرطان القولون والمستقيم (CRC) مع (A) بروتوكول التصور اليدوي panCK / CD45 و (B) بروتوكول التصور الآلي panCK / FAP / ANTIBODY X. لم تلاحظ أي اختلافات في إشارة panCK بين البروتوكولين. قضبان المقياس عند 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: مقارنة قيم العد لمقايسة البروتينات المكانية باستخدام بروتوكولين مختلفين للتصور على عائد استثمار مماثل لأربعة أنسجة CRC. (أ) السجل 2 خريطة حرارية لجميع العلامات المضمنة في مقايسة البروتينات المكانية التي تقارن بروتوكول panCK / CD45 اليدوي (أسود) ببروتوكول 3-plex الآلي (رمادي). (ب) يمثل ارتباط سبيرمان للسجل 2 لجميع العلامات قيمة R تساوي 0.88. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج GraphPad Prism 7 أو باستخدام لغة برمجة Python. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: مقارنة قيم العد لمقايسة النسخ المكاني باستخدام بروتوكولين مختلفين للتصور. (أ) السجل 2 خريطة حرارية للأهداف المختارة المدرجة في مقايسة النسخ المكاني التي تقارن بروتوكول panCK / CD45 اليدوي (أسود) بالبروتوكول الآلي 3-plex (رمادي). (ب) سجل 2 يمثل ارتباط سبيرمان لجميع العلامات قيمة R تساوي 0.15. (C) المتوسط (الأزرق) والانحراف المعياري حيث يتم فقد النطاق الديناميكي في البروتوكول الآلي 3-plex. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج GraphPad Prism 7 أو باستخدام لغة برمجة Python. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 9
الشكل 9: مقارنة قيم عدد الحمض النووي الريبي لمقايسة النسخ المكاني على كريات الخلايا. لوحظت نتائج مماثلة لعائد استثمار قطره 50 ميكرومتر (أسود) و 300 ميكرومتر (رمادي) لأهداف مختارة على خطوط خلايا (A) SUDHL1 و (B) JURKAT. لم يلاحظ أي فرق كبير باستخدام اختبار t. يظهر المتوسط والانحراف المعياري ل n = 3 عائد استثمار لكل حجم. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج GraphPad Prism 7. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حتى الآن ، يتم استخدام الأجسام المضادة الفلورية المترافقة مباشرة في بروتوكول يدوي بشكل شائع كلوحات تصور للبروتينات المكانية أو فحوصات النسخ المكاني 9,10. ومع ذلك ، فإن استخدام الأجسام المضادة الفلورية المترافقة مباشرة يمكن أن يمثل تحديا للعلامات الأقل وفرة ، مما يحد من اختيار الأجسام المضادة المناسبة. يوضح هذا البروتوكول أن وضع العلامات على علامات التصور يمكن أن يكون آليا على منصة تلطيخ آلية باستخدام تقنيات TSA لدعم فحوصات البروتينات المكانية. يتيح ذلك مزيدا من المرونة في تخصيص لوحات التصور ، مما يتيح اختيار عائد استثمار أكثر استهدافا والحصول على البيانات البيولوجية ذات الصلة من مناطق محددة من الأنسجة. تسمح تقنية TSA أيضا بتصور علامات الوفرة المنخفضة ، وبالتالي تزيد من عدد الأجسام المضادة المناسبة المحتملة. بالإضافة إلى ذلك ، تضمن أتمتة بروتوكول التصور قابلية التكرار وجودة إجراء وضع العلامات.

يتطلب تطوير اختبار 3-plex IF تقييما دقيقا لشدة إشارة العلامة / الفلوروفور على أنسجة التحكم المناسبة. يوصى بمعايرة تركيزات الأجسام المضادة للحصول على أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء ، مما سيساعد على تقليل النزيف إلى القنوات المجاورة. علاوة على ذلك ، يجب اختبار استقرار الحافة لكل علامة من علامات الاهتمام للتأكد من أن الحاشية لا تتأثر بخطوات الشطف المتكررة. بمجرد تأكيد ترتيب الأجسام المضادة في اللوحة ، يجب ضبط الفحص باستخدام عناصر التحكم في الخروج. هنا ، يتم حذف علامة محددة في اللوحة ، ويتم مراجعة القناة المقابلة في الصورة المكتسبة من أجل النزف والحديث المتبادل.

وقد تبين هنا أنه يمكن تصوير المقايسات القائمة على TSA على منصة التنميط المكاني ، وأن بدائل DAPI تحتاج إلى استخدامها في التلوين النووي. اختبرنا أصباغ SYTO وقررنا أنه عند اتخاذ قرار بشأن صبغة SYTO التي يجب استخدامها ، يجب تقييم الإشارة بعناية لتجنب النزيف في القنوات المجاورة. هناك قيد آخر على استخدام أصباغ SYTO وهو أن بعض أصباغ SYTO تبيض ضوئيا بشكل أسرع ، مثل SYTO 64 و SYTO 83 (البيانات الداخلية) ، مما قد يؤثر على القياس الكمي النووي. لذلك ، يجب تجنب التعرض للضوء للشرائح الملطخة قدر الإمكان. أظهرت مجموعات أخرى استخدام SYTO 1311,12 ، وهو أكثر قابلية للضوء (بيانات داخلية) ويمكن استخدامه في لوحة طالما تم تعيين علامات الاهتمام للفلوروفورات المتوافقة مع الصبغة النووية المختارة.

في حين أن المقايسات الفلورية الآلية القائمة على TSA عملت بشكل جيد للتصور بالاقتران مع فحوصات البروتينات المكانية ، فقد تقرر هنا أن الجمع بين بروتوكول التصور الآلي 3-plex مع بروتوكول النسخ المكاني أدى إلى فقدان النطاق الديناميكي ، والذي قد يكون بسبب ظروف البروتوكول الأكثر قسوة لإضافة خطوات استرجاع / شطف مستضد إضافية قد تؤثر على سلامة الحمض النووي الريبي. لذلك ، يجب تكييف بروتوكول التصور الآلي 3-plex فقط لفحوصات البروتينات ، وهو قيد ويتطلب مناهج تصور بديلة للمقايسات القائمة على الحمض النووي الريبي. كبديل لتصور نفس الشريحة ، يمكن تراكب الأقسام التسلسلية الملطخة بعلامات الاهتمام لتسهيل اختيار عائد الاستثمار13. بالإضافة إلى ذلك ، تصف الأدبيات استخدام التهجين في الموقع على الشرائح المجاورة لتوجيه اختيار عائد الاستثمار14. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الأساليب محدودة بتوافر الأنسجة ، والتباين من قسم إلى قسم ، والتسجيلات من خلية إلى خلية.

اختبرنا أيضا قابلية استخدام أحجام عائد الاستثمار المختلفة لفحوصات النسخ المكاني. يتيح استخدام عائد استثمار صغير يبلغ 50 ميكرومتر للباحث الحصول على بيانات لمناطق محددة مما يسمح بقراءة أكثر تفصيلا للخلايا أو مجالات الاهتمام المحددة. تتمثل قيود اختيار عائد الاستثمار الصغير في أن عدد الخلايا الموجودة قد لا يكون وفيرا بما يكفي للحصول على قيم العد التي يمكن تمييزها عن الخلفية. أحد الخيارات هو اختيار مجموعات الخلايا النقية لالتقاط أهداف أقل وفرة. ومع ذلك ، فإن اختيار عائد الاستثمار للخلايا المفردة محدود بنسبة إشارة إلى ضوضاء عالية15. علاوة على ذلك ، من المهم مراعاة أحجام عائد الاستثمار لإعداد المكتبة إذا تم جمع عائد استثمار بأحجام مختلفة في تجربة واحدة. إذا كانت أحجام عائد الاستثمار تختلف اختلافا كبيرا ، فقد يكون من المفيد تجميع عائد الاستثمار وفقا لأحجامها وإنشاء مكتبات منفصلة لمنع تمثيل عائد الاستثمار الكبير في مكتبة واحدة. سيضمن ذلك أيضا حصول كل عائد استثمار على تغطية تسلسل كافية وفقا لحجمه.

العوامل الأخرى التي يجب مراعاتها عند إجراء تجارب Spatial Omics هي أن البيانات يمكن أن تظهر اختلافات بسبب التباين من شريحة إلى شريحة ، ويمكن أن يؤدي التعبير المنخفض عن أهداف معينة إلى ظهور الخلفية والاختلافات في قيم الارتباط. يجب مراعاة الضوابط الكافية ونهج التطبيع عند تخطيط التجارب وتقييم البيانات. بالنسبة لفحوصات البروتينات المكانية على nCounter ، فإن التطبيع مع أهداف التدبير المنزلي أو التحكم السلبي IgGs هي الطرق المفضلة وفقا للخبرة الداخلية وتوصيات البائعين حيث يجب تقييم العلاقة بين أهداف التدبير المنزلي أو التحكم السلبي IgGs16. ومع ذلك ، اعتمادا على الأنسجة المستخدمة ، يجب تحديد أفضل تطبيع لكل دراسة17,18. على سبيل المثال ، تشير الأدبيات إلى أنه بالنسبة لدراسات Omics المكانية لسرطان الثدي ، كان GAPDH ، الذي يستخدم عادة للتطبيع مع أهداف التدبير المنزلي ، أقل توافقا من S6 و Histone19. لذلك ، كانت S6 و Histone هي أهداف التدبير المنزلي الموصى بها للتطبيع في أنسجة سرطان الثدي19.

بالنسبة لفحوصات النسخ المكاني ، يجب تحديد استراتيجيات التطبيع اعتمادا على تصميم الدراسة (على سبيل المثال ، أنواع الأنسجة واختيار عائد الاستثمار). يمكن تطبيق بعض الاستراتيجيات المستخدمة في RNA-Seq ، مثل تطبيع القيم العليا أو المشذبة لقيم M (TMM) ، لتطبيع البيانات المتسلسلة19,20.

توفر مقايسات النسخ المكاني معلومات عن آلاف الأهداف وأصبحت أكثر شيوعا لاستكشاف النسخ الكامل ، حيث يتم اختيار مقصورات TME محددة وتحليلها بالتزامن مع RNA-seq20 أحادي النواة أو تسلسل الحمض النووي الريبيأحادي الخلية 21. لقد أثبتنا أن بروتوكولات التصور لتوجيه اختيار عائد الاستثمار لتقييم التوزيع المكاني للأهداف يمكن أتمتتها لمقايسات البروتينات المكانية ولكن ليس لمقايسات النسخ المكاني. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم أنه يمكن اختيار عائد استثمار صغير يصل إلى 50 ميكرومتر للسماح بإجراء تحقيق أكثر تعمقا لمنطقة نسيج معينة. ستعمل التطبيقات المستقبلية لهذه التكنولوجيا على تحسين فهم البيئة المكروية للورم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

فيرونيكا إيبارا لوبيز ، سانجيتا جاياكار ، يتشينغ أنجيلا يانغ ، زورا مودروسان ، وساندرا روست هم موظفون ومساهمون في Genentech ، عضو في مجموعة روش. تنتج الشركات الأخرى التي تشكل جزءا من روش الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المخطوطة. سيارا مارتن موظفة بدوام كامل في شركة NanoString Technologies Inc، التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المخطوطة.

Acknowledgments

يعترف المؤلفون بتوماس وو لمعالجة ملفات NGS. نشكر جيمس زياي على مناقشات النتائج ومراجعة المخطوطات وميريديث تريبليت وراشيل تايلور على المراجعة الداخلية للمخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris buffered saline (TBS) Cell Signaling Technologies 12498S Diluted to 1x TBS in DEPC treated water
Antibody X (not disclosed) antibody blinded due to confidentiality
DEPC-treated water ThermoFisher AM9922 Another can be used
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) Ventana 950-500
DISCOVERY Cy5 Kit Ventana 760-238 Referred as Cy5
DISCOVERY FAM Kit Ventana 760-243 Referred as FAM
DISCOVERY Goat Ig Block Ventana 760-6008 Referred as Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP Ventana 760-4310 Referred as OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP Ventana 760-4311 Referred as OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G Kit Ventana 760-244 Referred as Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System Ventana 05 987 750 001 / N750-DISU-FS Referred as autostainer on the manuscript
FAP [EPR20021] Antibody Abcam Ab207178
GeoMx Digital Spatial Profiler NanoString GMX-DSP-1Y Referred as spatial profiling platform on the manuscript
Humidity chamber Simport M920-2 Another can be used
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody Abcam Ab27988
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Python Python Statistical analysis
Reaction Buffer (10x) Ventana 950-300
Statistical analysis software GraphPad Prism 7 Statistical analysis
SYTO 64 ThermoFisher S11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana 950-223
Ventana Antibody Diluent with Casein Ventana 760-219 Referred as specified diluent on the manuscript
Ventana Primary antibody dispenser Ventana Catalog number depends on dispenser number

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
  2. Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
  3. McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
  4. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
  5. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
  6. McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
  7. McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
  8. Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  9. Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
  10. Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
  11. Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
  12. Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
  13. Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
  14. Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
  15. Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
  16. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  17. Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
  18. Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
  19. Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
  20. Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
  21. Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 185 ، تعدد الإرسال ، الحمض النووي الريبي ، البروتين ، الأهداف ، الأتمتة ، عائد الاستثمار ، التصور ، الأجسام المضادة ، المجسات ، البروتينات ، النسخ
التنميط المكاني للبروتين وتعبير الحمض النووي الريبي في الأنسجة: نهج لضبط التشريح المجهري الافتراضي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ibarra-Lopez, V., Jayakar, S., Yang, … More

Ibarra-Lopez, V., Jayakar, S., Yang, Y. A., Martin, C., Modrusan, Z., Rost, S. Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection. J. Vis. Exp. (185), e62651, doi:10.3791/62651 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter