Summary
Здесь мы описываем протокол для тонкой настройки областей интереса (ROI) для технологий пространственной омики, чтобы лучше охарактеризовать микроокружение опухоли и идентифицировать конкретные клеточные популяции. Для анализов протеомики автоматизированные настраиваемые протоколы могут направлять выбор ROI, в то время как анализы транскриптомики могут быть точно настроены с использованием ROI размером до 50 мкм.
Abstract
Мультиплексирование позволяет оценить несколько маркеров на одной и той же ткани, обеспечивая при этом пространственный контекст. Технологии пространственной омики позволяют мультиплексировать как белки, так и РНК, используя фоторасщепляемые олиго-помеченные антитела и зонды соответственно. Олиго расщепляются и количественно определяются из определенных областей по всей ткани, чтобы прояснить основную биологию. Здесь исследование показывает, что автоматизированные пользовательские протоколы визуализации антител могут быть использованы для управления выбором ROI в сочетании с пространственными протеомическими анализами. Этот специфический метод не показал приемлемой производительности с пространственными транскриптомическими анализами. Протокол описывает разработку 3-плексного иммунофлуоресцентного (ПЧ) анализа для визуализации маркеров на автоматизированной платформе с использованием амплификации тирамидного сигнала (TSA) для усиления флуоресцентного сигнала от заданной белковой мишени и увеличения пула антител на выбор. Протокол визуализации был автоматизирован с использованием тщательно проверенного 3-плексного анализа для обеспечения качества и воспроизводимости. Кроме того, был оценен обмен DAPI на красители SYTO, чтобы позволить визуализировать анализы ПЧ на основе TSA на платформе пространственного профилирования. Кроме того, мы проверили способность выбора небольших ROI с использованием пространственного транскриптомического анализа, чтобы позволить исследовать высокоспецифичные области, представляющие интерес (например, области, обогащенные для данного типа клеток). Были собраны ROI диаметром 50 мкм и 300 мкм, что соответствует примерно 15 клеткам и 100 клеткам соответственно. Образцы были собраны в библиотеки и секвенированы для изучения способности обнаруживать сигналы от небольших ROI и профильных областей ткани. Мы определили, что технологии пространственной протеомики извлекают большую выгоду из автоматизированных, стандартизированных протоколов для управления выбором ROI. Хотя этот автоматизированный протокол визуализации не был совместим с пространственными транскриптомическими анализами, мы смогли протестировать и подтвердить, что конкретные популяции клеток могут быть успешно обнаружены даже при небольших ROI со стандартным протоколом ручной визуализации.
Introduction
Достижения в методах мультиплексирования продолжают предоставлять лучшие инструменты характеристики для мишеней, присутствующих в опухолях. Микроокружение опухоли (TME) представляет собой сложную систему опухолевых клеток, инфильтрирующих иммунные клетки и стромы, где пространственная информация имеет решающее значение для лучшего понимания и интерпретации механизмов взаимодействия между биомаркерами, представляющими интерес1. С помощью новых методов, таких как GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) и 10x Visium, несколько целей могут быть обнаружены и количественно определены одновременно в их пространственном контексте. Использование протоколов иммунофлуоресценции, которые облегчают визуализацию тканей, может еще больше улучшить возможности пространственного профилирования этих технологий.
Технология пространственной омики, на которой мы сосредоточились для разработки этого метода, состоит из пространственной протеомики и транскриптомики, где олигонуклеотиды прикрепляются к антителам или РНК-зондам через УФ-чувствительный фоторасщепляющийся линкер. Гистологические слайды маркируются этими олигоконъюгированными антителами или зондами, а затем визуализируются на платформе пространственного профилирования. Далее для освещения подбираются ROИ разных размеров и форм, а фоторасщепленные олигонуклеотиды аспирируются и собираются в 96-луночную пластину. Фоторасщепленные олигонуклеотиды готовятся к количественной оценке либо с помощью системы Nanostring nCounter, либо с помощью секвенирования следующего поколения (NGS)2,3 (рисунок 1)4,5.
Распределение клеток варьируется внутри тканей, и способность характеризовать конкретные местоположения клеток с использованием выбранных маркеров и различных размеров ROI имеет большое значение для полного понимания тканевой среды и выявления конкретных особенностей. В технологии Spatial Omics, упомянутой здесь, стандартный протокол визуализации использует непосредственно сопряженные антитела и является ручным протоколом. Стандартными маркерами для различения опухоли и стромы являются панцитокератин (panCK) и CD45 6,7, но дополнительные маркеры необходимы для нацеливания на конкретные клеточные популяции, представляющие интерес. Кроме того, использование непосредственно конъюгированных флуоресцентных антител не сопровождается амплификацией, что ограничивает отбор антител обильными маркерами. Кроме того, ручные анализы подвержены большей изменчивости, чем автоматизированные рабочие процессы8. Поэтому желательно иметь настраиваемый, автоматизированный и усиленный протокол визуализации для выбора ROI.
Здесь исследование показывает, что для пространственных протеомических анализов технология TSA может использоваться для протоколов визуализации на автоматизированной платформе, что приводит к более целенаправленному и стандартизированному анализу. Кроме того, анализы на основе TSA позволяют использовать маркеры с низкой экспрессией, увеличивая диапазон целей, которые могут быть выбраны для визуализации. 3-плексный анализ для panCK, FAP и Antibody X был разработан с использованием автоматизированной платформы, где panCK и FAP использовались для дифференциации опухоли и стромы соответственно. Антитело X является стромальным белком, часто встречающимся в опухолях, но его биология и влияние на противоопухолевый иммунитет до конца не изучены. Характеристика иммунного контекста в областях, богатых антителом X, может прояснить его роль в противоопухолевом иммунитете и терапевтическом ответе, а также его потенциал в качестве лекарственной мишени.
В то время как индивидуальные автоматизированные панели визуализации TSA оказались успешными для пространственных протеомических анализов, применение этих анализов для пространственных транскриптомических анализов не может быть подтверждено. Это, скорее всего, связано с реагентами и протоколом, используемым для автоматизированных протоколов визуализации, которые, по-видимому, ставят под угрозу целостность РНК. Признание того, что автоматизированный протокол маркировки для маркеров визуализации может использоваться для пространственных протеомических анализов, но не для пространственных транскриптомических анализов, дает важное руководство по проектированию технологических анализов пространственной омики.
Кроме того, исследование показывает, что анализ пространственной транскриптомики может быть использован для профилирования целей в областях диаметром до 50 мкм или примерно 15 клеток. Были выбраны два ROI разного размера для проверки способности анализа также обнаруживать транскрипты в небольших ROI. Для каждой интересующей области олиго, соответствующие мишеням 1 800 мРНК, были собраны и превращены в библиотеки в соответствии с протоколом платформы пространственного профилирования. Библиотеки индексировались по отдельности, впоследствии объединялись в пул и секвенировались. Это позволило оценить как эффективность объединения, так и способность идентифицировать конкретные популяции клеток в небольших ROI.
В данной работе показано, что для пространственных протеомических анализов автоматизированный протокол для управления выбором ROI по конкретным маркерам, представляющим интерес, может быть использован для избирательного нацеливания на опрос соответствующих областей ткани и характеристики пространственной среды ткани. Кроме того, мы демонстрируем, что меньшие ROI могут быть использованы для пространственных транскриптомных анализов для обнаружения и характеристики конкретных клеточных популяций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все ткани человека были приобретены из коммерческих биобанков или аккредитованных банков тканей на гарантии того, что было получено соответствующее одобрение Институционального наблюдательного совета и информированное согласие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол выполняется с использованием Discovery Ultra и GeoMx Digital Spatial Profiler. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о реагентах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.
1. Автоматизированный протокол визуализации для анализа пространственной протеомики
- Программа автостейнера для применения флуоресцентной визуализации антител
- В программном обеспечении autostainer нажмите кнопку «Домой» и выберите «Протоколы». Затем нажмите «Создать/Изменить протоколы» и выберите RUO DISCOVERY Universal в качестве процедуры.
- Нажмите на Первую последовательность > депарафинизации > Depar v2. Для средней температуры выберите 72 ° C, затем нажмите « Предварительная обработка» и выберите «Кондиционирование клеток » и резервуар CC1. Для очень высокой температуры выберите 100 ° C, затем нажмите CC1 8 мин и продолжайте нажимать, пока не будет выбран CC1 64 мин .
- Нажмите на Ингибитор > Ингибитор DISCOVERY, и для инкубации выберите 8 минут. Затем нажмите на Антитела > высокотемповой инкубации Ab; для низкой температуры выберите 37 ° C; для антитела выберите номер антитела из этикетки дозатора (антитело 6 в этом примере); В поле Время инкубации Plus выберите 32 минуты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол имеет три различных номера антител. Первое антитело — FAP, второе — пан-цитокератин, а третье — антитело X. - Нажмите на Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, затем для блокировки антител выберите Gt Ig Block, а для времени инкубации выберите 4 минуты. Затем на Multimer HRP Reagent выберите OMap anti-Rb HRP, а в поле Время инкубации выберите 16 минут. Затем нажмите на Cy5 и для длительного времени инкубации выберите 0 часов 8 минут.
- Нажмите « Двойная последовательность» и выберите «Денатурация антител», затем выберите «Денатура антител CC2-1», а для «Очень высокой температуры» выберите 100 градусов Цельсия. Убедитесь, что время инкубации составляет 8 мин. Затем нажмите на DS Inhibitor и выберите Нейтрализовать.
- Нажмите на DS Antibody, и для очень низкой температуры выберите 37 ° C. Затем в поле Антитело выберите номер антитела на этикетке дозатора (Антитело 3 в этом примере), а для Plus Incubation Time выберите 32 минуты.
- Нажмите на DS Multimer HRP и выберите DS Multimer HRP Blocker. Затем для параметра «Блокировка антител» выберите «Блок Ig», а в поле «Время инкубации» выберите «4 минуты». Затем на Multimer HRP Reagent выберите OMap anti-Ms HRP, а в поле Время инкубации выберите 16 минут. Затем нажмите на DS Rhodamine 6G и для длительного времени инкубации выберите 0 часов 8 минут.
- Нажмите на Triple Stain и выберите TS Antibody Denaturation, затем выберите Antibody Denature CC2-2, а для Very High Temperature выберите 100 Deg C. Убедитесь, что время инкубации составляет 8 мин. Затем нажмите на ингибитор TS и выберите TS Neutralize.
- Нажмите на TS Antibody, и для очень низкой температуры выберите 37 ° C. Затем в поле Антитело выберите номер антитела на этикетке дозатора (Антитело 7 в этом примере), а для Plus Incubation Time выберите 32 минуты.
- Нажмите на TS Multimer HRP и выберите TS Multimer HRP Blocker. Затем для параметра «Блокировка антител» выберите «Блок Ig», а в поле «Время инкубации» выберите «4 минуты». Затем на Multimer HRP Reagent выберите OMap anti-Rb HRP, а в поле Время инкубации выберите 16 минут. Затем нажмите на TS FAM, и для длительного времени инкубации выберите 0 часов 8 минут.
- Добавьте заголовок в протокол. Выберите номер протокола, добавьте комментарий и нажмите «Активный », а затем «Сохранить».
- Подготовка слайдов, печать этикеток и запуск автостинелера
- Продавец выпечки закупил FFPE (формалин-фиксированный, парафин-внедренный) участки тканей человека в духовке, установленной на 70 °C в течение 20-60 мин. Во время выпечки слайдов печатайте этикетки, нажав кнопку «Создать этикетку» в программном обеспечении autostainer. Затем нажмите « Протоколы», выберите номер протокола и нажмите « Закрыть/Распечатать». Добавьте соответствующую информацию на этикетку слайда и нажмите «Печать».
- Извлеките слайды из духовки и дайте им остыть до комнатной температуры (RT). Примените ранее напечатанные наклейки протокола к соответствующим слайдам.
- Загружайте многоразовые диспенсеры антител антителами в соответствии с номером этикетки антитела, присвоенным на этапе 1.1. В этом протоколе используют антитело 6 для FAP при 1 мкг/мл, используют антитело 3 для пан-цитокератина при 0,1 мкг/мл и используют антитело 7 для антитела X при 2,5 мкг/мл. Разводят каждое антитело в указанном разбавителе и праймируют многоразовые дозаторы антител.
- Соберите блокирующие, детектирующие и усиливающие предварительно заполненные дозаторы реагентов, упомянутые выше, и поместите их на лоток для реагентов. Загрузите слайды в лотки для слайдов (до 30 слайдов за прогон) и нажмите «Выполняется », а затем « Да». Обратите внимание, что DAPI не используется для ядерного противодействия.
- Подтвердите начало запуска, проверив продолжительность выполнения на программном обеспечении autostainer. Протокол занимает ~ 11 ч для завершения и может работать в течение ночи.
- На следующий день обеспечьте завершение запуска, наблюдая за зелеными мигающими огнями на слотах лотка для слайдов. Затем снимите слайды с инструмента и энергично промойте их в 1-кратном реакционном буфере до тех пор, пока жидкий раствор крышки не будет полностью удален.
- Протокол платформы пространственного профилирования для анализа протеомики
- Следуйте протоколу пространственной протеомики, указанному в примечании ниже. Включите следующие изменения в протокол, чтобы включить 3-ступенчатую автоматическую процедуру маркировки.
- Выполните шаги 1.2.1-1.2.6 за день до запуска протокола пространственной протеомики и перейдите прямо к этапу извлечения антигена протокола пространственной протеомики после выполнения шага 1.2.6. Пропустите процедуру визуализации, описанную в протоколе протеомики пространственного профилирования.
- Замените SYTO 13 на SYTO 64 при 5000 нМ, чтобы обеспечить интеграцию флуорофоров. Развести SYTO 64 в 1x TBS и инкубировать в камере влажности в течение 15 мин.
- При настройке параметров сканирования в платформе пространственного профилирования выберите фильтры и каналы фокусировки в соответствии с флуорофорами, используемыми в панели визуализации, чтобы обеспечить интеграцию 3-плексов. Используйте FITC для DISCOVERY FAM и установите экспозицию на 200 мс, используйте Cy3 для DISCOVERY Rhodamine 6G и установите экспозицию на 200 мс, используйте Texas Red для SYTO 64 и установите экспозицию на 50 мс (укажите это в качестве канала фокусировки), и, наконец, используйте Cy5 для DISCOVERY Cy5, установите экспозицию на 200 мс, и сохраните изменения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции протокола пространственной профилирования протеомики можно найти на вкладке официального сайта Поддержка, выбрав Документация > Руководства пользователя. Здесь ищите белковый протокол для nCounter с использованием Bond RX.
2. Выбор ROI для анализа пространственной транскриптомики
- Выпекайте секции гранул FFPE в духовке, установленной на 70 °C в течение 20-60 мин. Следуйте протоколу NGS платформы пространственного профилирования, указанному в примечании ниже, и сканируйте слайды на платформе пространственного профилирования, выбирая размеры 50 мкм и 300 мкм. Для анализа пространственной транскриптомики выделена следующая рекомендация:
- При подготовке библиотеки, если были выбраны различные размеры ROI, объедините ROI одинаковых размеров, чтобы создать одну библиотеку на размер. Это необходимо для обеспечения достаточной глубины секвенирования для всех ROI без смещения от размера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции по платформе пространственного профилирования можно найти на вкладке официального сайта Поддержка, выбрав Документация > Руководства пользователя. Здесь найдите протокол РНК для приложений NGS с использованием Bond RX.
- При подготовке библиотеки, если были выбраны различные размеры ROI, объедините ROI одинаковых размеров, чтобы создать одну библиотеку на размер. Это необходимо для обеспечения достаточной глубины секвенирования для всех ROI без смещения от размера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Автоматизированный протокол визуализации для управления выбором ROI
В этой статье мы представляем использование автоматизированного пользовательского протокола IF на основе TSA для визуализации ткани и выбора конкретных ROI. Разработка панели визуализации с использованием меланомы и нормальной кожи человека в качестве контрольных тканей состояла из тестирования стабильности эпитопов, тонкой настройки интенсивности маркеров и сквозной оценки кровотечения через один контроль. Чтобы проверить, влияет ли эпитопная стабильность антител на повторяющиеся этапы элюирования, сигналы FAP и Antibody X были качественно оценены после маркировки в каждом положении 3-плекса. Сигнал антитела X оставался неизменным во всех положениях, в то время как интенсивность сигнала FAP снижалась после одного элюирования (рисунок 2). Предыдущие внутренние исследования показали, что эпитоп panCK стабилен на протяжении всего 3-плексного анализа. Поэтому FAP был выбран для нахождения на1-й позиции в 3-плексе, panCK был помещен во2-й, а Antibody X в3-й позиции. Поскольку сигнал FAP был слабее в целом по сравнению с антителом X и panCK, FAP был сопряжен с более ярким флуорофором Cy5.
Автоматизированный 3-плекс был оптимизирован с помощью элементов управления leave one out, где каждый маркер был опущен из 3-плексного протокола один раз, чтобы подтвердить, что в соседние каналы не было кровотечения (рисунок 3).
Флуорофоры, используемые на автоматизированной платформе окрашивания, были протестированы на платформе пространственного профилирования, чтобы подтвердить, что фильтры совместимы с флуорофорами TSA в 3-ступенчатой панели визуализации. Поскольку 3-плексный протокол использует FITC, Cy3 и Cy5, а канал DAPI используется для УФ-расщепления на платформе пространственного профилирования, пришлось использовать ядерное контрокрашивание в канале Texas Red. Были протестированы два разных ядерных красителя, SYTO 59 и SYTO 64, и красители показали отчетливый ядерный сигнал в тканях толстой кишки. Тем не менее, SYTO 59 также отображал некоторый сквозной сигнал в канале Cy5, в то время как канал Cy5 был чистым при использовании SYTO 64 (рисунок 4). Поэтому SYTO 64 был предпочтительным выбором для ядерного обнаружения.
Дальнейшее тестирование SYTO 64 показало, что этот краситель не был фотостабильным и быстро отбеливался во время визуализации. Как только сигнал отбеливается, система визуализации фокусируется на фоне, который может быть интерпретирован как неспецифический сигнал (рисунок 5). Увеличение концентрации ядерного красителя для увеличения интенсивности сигнала помогло свести к минимуму эту проблему.
Ткани, помеченные протоколом ручной визуализации panCK / CD45, который использует непосредственно конъюгированные антитела, сравнивались с тканями, помеченными автоматизированным пользовательским протоколом визуализации panCK / FAP / Antibody X. Оба протокола имеют общий маркер panCK, и сигнал был сопоставим между двумя протоколами (рисунок 6).
Чтобы убедиться, что модифицированный протокол визуализации не влияет на восходящий анализ пространственной протеомики, мы сравнили значения количества, полученные после сбора платформы пространственного профилирования и обработки счетной платформы при использовании ручного протокола визуализации panCK / CD45. При этом используются непосредственно сопряженные антитела или 3-ступенчатый автоматизированный пользовательский протокол визуализации, который использует TSA. Четыре ткани колоректального рака (CRC) были помечены протоколом ручной визуализации panCK / CD45 или 3-плексным автоматизированным пользовательским протоколом визуализации в сочетании с пространственным протеомическим анализом. Для каждого протокола были выбраны аналогичные ROI, а данные подсчета соответствующих ROI сравнивались с использованием нормализации ведения домашнего хозяйства для S6 и Histone. Аналогичные тенденции наблюдались между этими ROI, как показано на тепловой карте log2 (рисунок 7A), со значением Spearman R 0,88 для всех маркеров, включенных в пространственный протеомический анализ (рисунок 7B). Из 31 антитела, использованного в анализах, 23 антитела имели значение R Spearman выше или равное 0,5.
Поскольку пространственная протеомика и транскриптомные протоколы различаются, мы оценили, может ли автоматизированный протокол визуализации также применяться к анализам пространственной транскриптомики. Автоматизированный протокол визуализации требует, чтобы анализ IHC был выполнен до обнаружения РНК, тогда как оригинальный ручной протокол сначала обнаруживает РНК перед применением протокола визуализации. 3-плексный автоматизированный протокол визуализации был протестирован бок о бок с протоколом ручной визуализации CK/CD45 в сочетании с анализом пространственной транскриптомики. Данные секвенирования для 3-плексного автоматизированного протокола визуализации Quartile 3 count (Q3), нормализованные в программном обеспечении пространственного профилирования, представляли более низкие значения по сравнению с протоколом ручной визуализации CK / CD45 (рисунок 8A), что также отражено низкими значениями Spearman R 0,15 (рисунок 8B). Также наблюдалась потеря динамического диапазона при использовании 3-х плексного автоматизированного протокола визуализации (рисунок 8С).
Эта потеря подсчетов с помощью автоматизированного протокола визуализации указывает на то, что этот протокол ставит под угрозу целостность РНК и что обнаружение РНК до выполнения анализа визуализации необходимо для сохранения качества РНК. Поскольку эта автоматизированная панель визуализации требует, чтобы белковая часть была выполнена до обнаружения РНК, этот протокол не подходит для анализов РНК.
Размер выбора ROI в анализах пространственной транскриптомики
Чтобы лучше понять влияние размера ROI на вывод данных РНК, сравнивали количество РНК разного размера ROI. Анализ пространственной транскриптомики проводили на клеточных линиях SUDHL1 и JURKAT для минимизации различий, присущих тканям. Круговые ROI диаметром 50 мкм и 300 мкм были выбраны и сопоставлены друг с другом с использованием нормализации Q3 в программном обеспечении пространственного профилирования. Количество РНК для выбранных мишеней на разных клеточных линиях было сопоставимо между двумя размерами ROI после нормализации (рисунок 9A, B).
Рисунок 1: Рабочий процесс цифрового пространственного профилирования. (A) Слайды маркируются антителами (пространственный протеомический анализ) или зондами (пространственный транскриптомический анализ), а также маркерами визуализации. (B) Слайды размещаются на платформе пространственного профилирования для изображения и выбора ROI. (C) Олиго расщепляются ультрафиолетовым светом и собираются в 96-луночную пластину. Этот процесс повторяется для каждого выбранного ROI. (D) Образцы обрабатываются, и данные генерируются с помощью счетной платформы или секвенсора. Эта цифра была изменена с сайта Nanostring technologies 4,5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стабильность эпитопа. (А-С) Антитела X и (D-F) FAP протестированы на нормальной коже человека и меланоме соответственно. Каждый маркер в (A,D) 1-й, (B,E)2-й и (C,F)3-й позиции 3-плекса. Антитело X стабильно во всех положениях, в то время как (D) FAP показывает снижение интенсивности передачи сигналов после (E-F) одного и двух элюций соответственно. Антитело X в зеленом, FAP в красном, DAPI в сером. Шкала составляет 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Оставьте один элемент управления для 3-плексного автоматизированного пользовательского протокола визуализации тканей поджелудочной железы человека. Для всех изображений антитело X изображено зеленым цветом, panCK — голубым, а FAP — красным. Первая строка показывает (A) 3-плекс и одиночные каналы для (B) антитела X в FITC, (C) panCK в Cy3 и (D) FAP в Cy5. Во второй строке показаны один из них контрольный 3-плекс для (E) антитела X и (F-H) одиночные каналы для каждого маркера. В третьей строке показаны 3-плексные элементы управления для (I) panCK и (J-L) отдельные каналы для каждого маркера. В четвертой строке показаны 3-плексные элементы управления для (M) FAP и (N-P) отдельные каналы для каждого маркера. Ни в одном из контрольных элементов управления не наблюдалось кровотечения, о чем свидетельствует отсутствие сигнала в соответствующих каналах при тестировании (F) без FAP, (K) без panCK и (P) без антител X. Шкала баров составляет 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Тестирование красителя SYTO. Техасский красный канал отображает ядерный сигнал в двоеточии для (A) SYTO 59 с кровотечением в канал (B) Cy5 (красный). Канал Texas Red показывает ядерный сигнал в Colon для (D) SYTO 64 без кровотечения в канал (E) Cy5. Каналы Texas Red и Cy5 в Colon отображаются вместе, чтобы показать (C) кровотечение SYTO 59 и (F) отсутствие кровотечения для SYTO 64. Шкала шкалы составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Фотостабильность SYTO 64. Образцы толстой кишки, помеченные SYTO 64 (A) до и (B) после фотоотбеливания. На рисунке B показан неспецифический сигнал, который становится более заметным после потери ядерного сигнала. Шкала шкалы составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Сравнение маркировки panCK. сигнал panCK на образцах колоректального рака (CRC) с (A) протоколом ручной визуализации panCK / CD45 и (B) протоколом визуализации panCK / FAP / Antibody X. Различий в сигнале panCK между двумя протоколами не наблюдалось. Шкала составляет 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Сравнение значений количества для пространственного протеомического анализа с использованием двух различных протоколов визуализации на аналогичных ROI четырех тканей CRC. (A) Log 2 Тепловая карта всех маркеров, включенных в пространственный протеомический анализ, сравнивающая ручной протокол panCK / CD45 (черный) с автоматизированным 3-плексным протоколом (серый). (B) Log 2 Корреляция Спирмена для всех маркеров представляет значение R 0,88. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7 или языка программирования Python. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Сравнение значений количества для анализа пространственной транскриптомики с использованием двух различных протоколов визуализации. (A) Log 2 Тепловая карта выбранных целей, включенных в пространственный транскриптомический анализ, сравнивающий ручной протокол panCK / CD45 (черный) с 3-плексным автоматизированным протоколом (серый). (B) Log 2 Корреляция Спирмена для всех маркеров представляет значение R 0,15. (C) Среднее (синее) и стандартное отклонение, при котором динамический диапазон теряется в 3-ступенчатом автоматизированном протоколе. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7 или языка программирования Python. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Сравнение значений количества РНК для анализа пространственной транскриптомики на клеточных гранулах. Сопоставимые результаты наблюдались для ROI диаметром 50 мкм (черный) и 300 мкм (серый) для выбранных целей на клеточных линиях (A) SUDHL1 и (B) JURKAT. При использовании t-теста существенной разницы не наблюдалось. Среднее и стандартное отклонение показаны для n = 3 ROI на размер. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
На сегодняшний день непосредственно сопряженные флуоресцентные антитела в ручном протоколе чаще всего используются в качестве панелей визуализации для пространственной протеомики или пространственных транскриптомических анализов 9,10. Однако использование непосредственно конъюгированных флуоресцентных антител может быть сложным для менее распространенных маркеров, ограничивая выбор подходящих антител. Этот протокол показывает, что маркировка маркеров визуализации может быть автоматизирована на автоматизированной платформе окрашивания с использованием технологий TSA для поддержки пространственных протеомических анализов. Это обеспечивает большую гибкость в настройке панелей визуализации, что позволяет более целенаправленно выбирать ROI и получать соответствующие биологические данные из конкретных областей ткани. Технология TSA также позволяет визуализировать маркеры низкой плотности и тем самым увеличивает количество потенциально подходящих антител. Кроме того, автоматизация протокола визуализации обеспечивает воспроизводимость и качество процедуры маркировки.
Разработка 3-плексного анализа ПЧ требует тщательной оценки интенсивности сигнала маркера/флуорофора на соответствующих контрольных тканях. Рекомендуется титровать концентрации антител для получения наилучшего отношения сигнал/шум, что поможет свести к минимуму кровотечение в соседние каналы. Кроме того, стабильность эпитопа для каждого маркера, представляющего интерес, должна быть проверена, чтобы убедиться, что эпитоп не подвержен повторным шагам элюирования. Как только порядок антител в панели подтвержден, анализ должен быть точно настроен с использованием одного элемента управления. Здесь на панели опускается конкретный маркер, а соответствующий канал в полученном изображении проверяется на предмет пропускания и перекрестного разговора.
Здесь было показано, что анализы на основе TSA могут быть сфотографированы на платформе пространственного профилирования и что альтернативы DAPI должны использоваться для ядерного окрашивания. Мы протестировали красители SYTO и определили, что при принятии решения о том, какой краситель SYTO использовать, сигнал необходимо тщательно оценить, чтобы избежать кровотечения в соседние каналы. Другим ограничением использования красителей SYTO является то, что некоторые красители SYTO фотоотбеливаются быстрее, такие как SYTO 64 и SYTO 83 (внутренние данные), что может повлиять на ядерную количественную оценку. Поэтому следует максимально избегать светового воздействия окрашенных слайдов. Другие группы показали использование SYTO 1311,12, который является более фотостабильным (внутренние данные) и может быть использован в панели, если маркеры, представляющие интерес, назначены флуорофорам, совместимым с ядерным красителем по выбору.
В то время как автоматизированные флуоресцентные анализы на основе TSA хорошо работали для визуализации в сочетании с пространственными протеомическими анализами, здесь было определено, что объединение 3-плексного автоматизированного протокола визуализации с протоколом пространственной транскриптомики привело к потере динамического диапазона, что может быть связано с более жесткими условиями протокола добавления дополнительных этапов извлечения / элюирования антигена, которые могут повлиять на целостность РНК. Поэтому 3-ступенчатый автоматизированный протокол визуализации должен быть адаптирован только для анализов протеомики, что является ограничением и требует альтернативных подходов к визуализации для анализов на основе РНК. В качестве альтернативы визуализации с одним и тем же слайдом можно наложить последовательные секции, окрашенные маркерами, представляющими интерес, для облегчения выбора ROI13. Кроме того, в литературе описывается использование гибридизации in situ на соседних слайдах для руководства выбором ROI14. Однако эти подходы могут быть ограничены доступностью тканей, изменчивостью от раздела к участку и регистрацией от клетки к клетке.
Мы также проверили удобство использования различных размеров ROI для пространственных транскриптомических анализов. Использование небольших ROI 50 мкм позволяет исследователю получать данные о конкретных областях, что позволяет более подробно считывать выбранные клетки или области, представляющие интерес. Ограничения выбора небольших ROI заключаются в том, что количество присутствующих ячеек может быть недостаточно обильным, чтобы получить значения счетчика, которые можно отличить от фона. Одним из вариантов является выбор чистых клеточных популяций для захвата менее обильных целей. Однако выбор ROI для отдельных ячеек ограничен высоким отношением сигнал/шум15. Кроме того, важно учитывать размеры ROI для подготовки библиотеки, если в одном эксперименте собираются ROI разного размера. Если размеры ROI значительно различаются, может быть полезно объединить ROI в соответствии с их размерами и создать отдельные библиотеки, чтобы предотвратить чрезмерное представление больших ROI в одной библиотеке. Это также гарантирует, что каждый ROI получит достаточное покрытие последовательности в соответствии с его размером.
Другие факторы, которые следует учитывать при проведении экспериментов Spatial Omics, заключаются в том, что данные могут показывать вариации из-за изменчивости слайд-слайда, а более низкое выражение определенных целей может вызвать фоновые и различия в значениях корреляции. При планировании экспериментов и оценке данных необходимо учитывать адекватные методы контроля и нормализации. Для пространственных протеомических анализов на nCounter нормализация до целей ведения хозяйства или отрицательного контроля IgG является предпочтительным методом в соответствии с внутренним опытом и рекомендациями поставщиков, где корреляция между целями домашнего хозяйства или с отрицательным контролем IgG должна быть оценена16. Однако, в зависимости от используемых тканей, наилучшая нормализация должна быть определена для каждого исследования17,18. Например, в литературе говорится, что для исследований пространственной омики рака молочной железы GAPDH, который обычно используется для нормализации до домашних целей, был менее конкордантным, чем S6 и Histone19. Таким образом, S6 и гистон были рекомендуемыми целями для нормализации в тканях рака молочной железы19.
Для анализа пространственной транскриптомики необходимо определить стратегии нормализации в зависимости от дизайна исследования (например, типы тканей и выбор ROI). Некоторые стратегии, которые используются в RNA-Seq, такие как нормализация верхнего четвертиля или усеченного среднего значения M (TMM), могут быть применены для нормализации секвенированных данных19,20.
Пространственные транскриптомические анализы предоставляют информацию о тысячах мишеней и становятся все более часто используемыми для изучения всего транскриптома, где конкретные компартменты TME выбираются и анализируются в сочетании с одноядерным RNA-seq20 или одноклеточным секвенированием РНК21. Мы продемонстрировали, что протоколы визуализации для управления выбором ROI для оценки пространственного распределения целей могут быть автоматизированы для пространственных протеомических анализов, но не для пространственных транскриптомических анализов. Кроме того, мы представляем, что ROI размером до 50 мкм может быть выбран, чтобы обеспечить более глубокое исследование конкретной области ткани. Будущие применения этой технологии улучшат понимание микроокружения опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Вероника Ибарра-Лопес, Сангита Джаякар, Йецин Анджела Янг, Зора Модрусан и Сандра Рост являются сотрудниками и акционерами Genentech, входящей в группу Roche. Другие компании, входящие в состав Рош, производят реагенты и инструменты, используемые в этой рукописи. Сиара Мартин является штатным сотрудником NanoString Technologies Inc, которая производит реагенты и инструменты, используемые в этой рукописи.
Acknowledgments
Авторы признают Томаса Ву за обработку файлов NGS. Мы благодарим Джеймса Зиай за обсуждение результатов и рецензирование рукописей, а также Мередит Триплет и Рэйчел Тейлор за внутреннюю редакцию рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
