Summary
在这里，我们描述了一种用于微调空间组学技术感兴趣区域（ROI）的协议，以更好地表征肿瘤微环境并识别特定的细胞群。对于蛋白质组学测定，自动定制方案可以指导ROI选择，而转录组学测定可以利用小至50μm的ROI进行微调。
Abstract
多路复用可以评估同一组织上的多个标记物，同时提供空间背景。空间组学技术分别利用可光切割的寡核苷酸标记抗体和探针，实现蛋白质和RNA多重检测。从组织中的特定区域切割和定量寡核苷酸，以阐明潜在的生物学。在这里，该研究表明，自动化定制抗体可视化方案可用于结合空间蛋白质组学测定来指导ROI选择。这种特定方法在空间转录组学测定中没有显示出可接受的性能。该协议描述了在自动化平台上开发用于标记物可视化的 3 重免疫荧光 （IF） 测定，使用 tyramide 信号放大 （TSA） 来扩增来自给定蛋白质靶标的荧光信号并增加抗体库以供选择。使用经过全面验证的 3 重检测自动可视化方案，以确保质量和可重复性。此外，还评估了DAPI与SYTO染料的交换，以允许在空间分析平台上对基于TSA的IF测定进行成像。此外，我们测试了使用空间转录组学测定选择小ROI的能力，以允许研究高度特异性的兴趣区域（例如，为给定细胞类型富集的区域）。收集直径为50μm和300μm的ROI，分别对应于约15个细胞和100个细胞。将样品制成文库并进行测序，以研究检测来自小ROI和组织轮廓特定区域的信号的能力。我们确定空间蛋白质组学技术极大地受益于自动化的标准化方案，以指导ROI选择。虽然这种自动化可视化方案与空间转录组学测定不兼容，但我们能够测试并确认，使用标准的手动可视化方案即使在很小的ROI中也可以成功检测到特定的细胞群。
Introduction
多重检测技术的进步继续为肿瘤中存在的靶标提供更好的表征工具。肿瘤微环境（TME）是一个由肿瘤细胞、浸润免疫细胞和基质组成的复杂系统，其中空间信息对于更好地理解和解释感兴趣的生物标志物之间的相互作用机制至关重要1。借助GeoMx数字空间剖面仪（DSP）和10x Visium等新兴技术，可以在其空间环境中同时检测和量化多个目标。使用促进组织可视化的免疫荧光方案可以进一步提高这些技术的空间分析能力。
我们专注于该方法开发的空间组学技术包括空间蛋白质组学和转录组学测定，其中寡核苷酸通过紫外敏感光裂解接头连接到抗体或RNA探针上。用这些寡核偶联抗体或探针标记组织学载玻片，然后在空间分析平台上成像。接下来，选择不同大小和形状的ROI进行照明，并将光裂解的寡核苷酸吸出并收集在96孔板中。制备光裂解寡核苷酸，以使用纳米弦nCounter系统或下一代测序（NGS）2，3（图1）4，5进行定量。
组织内的细胞分布各不相同，使用选定的标记物和不同的ROI大小表征细胞特定位置的能力对于充分了解组织环境和识别特定特征非常重要。在这里提到的空间组学技术中，标准可视化方案使用直接偶联抗体，是一种手动方案。区分肿瘤和基质的标准标志物是泛细胞角蛋白（panCK）和CD456，7，但需要额外的标志物来靶向感兴趣的特定细胞群。此外，使用直接偶联的荧光抗体缺乏扩增，这限制了抗体选择丰富的标记物。此外，手动检测比自动化工作流程更容易变化8。因此，希望有一个可定制、自动化和放大的可视化协议来选择投资回报率。
在这里，该研究表明，对于空间蛋白质组学测定，TSA技术可用于自动化平台上的可视化协议，从而实现更具针对性和标准化的测定。此外，基于TSA的检测允许使用低表达标记物，从而扩大了可以选择用于可视化的靶标范围。使用自动化平台开发了针对panCK，FAP和抗体X的3重测定，其中panCK和FAP分别用于区分肿瘤和基质。抗体X是肿瘤中经常遇到的基质蛋白，但其生物学和对抗肿瘤免疫的影响尚不完全清楚。在富含抗体X的区域表征免疫质地可以阐明其在抗肿瘤免疫和治疗反应中的作用，以及其作为药物靶标的潜力。
虽然定制的自动化TSA可视化组合被证明在空间蛋白质组学测定中是成功的，但无法确认这些测定在空间转录组学测定中的应用。这很可能是由于用于自动可视化方案的试剂和方案，这似乎损害了RNA的完整性。认识到可视化标记物的自动标记方案可用于空间蛋白质组学测定，但不能用于空间转录组学测定，这为空间组学技术测定设计提供了重要指导。
此外，该研究表明，空间转录组学测定可用于分析直径小至50μm或约15个细胞的区域的靶标。选择两种不同大小的ROI来测试该测定在小ROI中检测转录本的能力。对于每个感兴趣的区域，收集对应于1，800个mRNA靶标的寡核苷酸，并根据空间分析平台协议将其制成文库。对文库进行单独索引，随后进行合并和排序。这允许评估池化效率和在小ROI中识别特定细胞群的能力。
本文表明，对于空间蛋白质组学测定，可以使用一种自动化协议来指导对感兴趣的特定标记物进行ROI选择，以选择性地靶向相关组织区域的询问并表征组织的空间环境。此外，我们证明较小的ROI可用于空间转录组学测定，以检测和表征特定的细胞群。
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Protocol
所有人体组织均从商业生物库或经认可的组织库获得，并保证获得机构审查委员会的适当批准和知情同意。
注意：该协议是使用Discovery Ultra和GeoMx数字空间剖面仪执行的。有关本协议中使用的试剂、设备和软件的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 空间蛋白质组学测定的自动化可视化协议
- 对自动染色器进行编程以应用荧光可视化抗体
- 在自动染色器软件中，单击主页按钮并选择 协议。然后，单击创建 /编辑协议 并选择 RUO 发现通用 作为过程。
- 单击第一个序列>脱蜡> Depar v2。对于介质温度，选择 72 摄氏度，然后单击预处理并选择细胞调理和 CC1 储液槽。对于极高温，选择 100 摄氏度，然后单击 CC1 8 分钟并继续单击，直到选择 CC1 64 分钟。
- 单击 抑制剂>发现抑制剂，对于 孵育时间，选择 8 分钟。然后，点击 抗体>高温抗体孵育;对于 低温，选择 37 摄氏度;对于 抗体，从分配器标签中选择抗体编号（本例中为抗体 6 ）;对于 Plus 孵育时间，选择 32 分钟。
注意：此协议有三种不同的抗体编号。第一种抗体是FAP，第二种是泛细胞角蛋白，第三种是抗体X。 - 单击多聚体 HRP >多聚体 HRP 阻滞剂，然后对于抗体阻断，选择 Gt Ig 阻断，对于孵育时间，选择 4 分钟。接下来，在多聚体 HRP 试剂上，选择 OMap 抗 Rb HRP，对于孵育时间，选择 16 分钟。然后，单击Cy5，对于长孵育时间，选择0小时8分钟。
- 单击“ 双序列 ”并选择“抗体变性”，然后选择 “抗体变性 CC2-1”，对于 “非常高的温度”，选择“ 100°C”。确保孵育时间为8分钟。接下来，单击DS 抑制剂 并选择 中和。
- 单击 DS 抗体，对于极低温度，选择 37 摄氏度。然后，在抗体中，从分配器标签中选择抗体编号（本例中为抗体 3），对于加孵育时间，选择 32 分钟。
- 单击 DS 多聚体 HRP，然后选择 DS 多聚体 HRP 阻滞剂。然后，对于抗体封闭，选择Gt Ig封闭，对于孵育时间，选择4分钟。接下来，在多聚体 HRP 试剂上，选择 OMap 抗 MS HRP，对于孵育时间，选择 16 分钟。然后，单击DS罗丹明6G，对于长孵育时间，选择0小时8分钟。
- 单击“三重染色”并选择“TS 抗体变性”，然后选择“抗体变性 CC2-2”，对于“非常高的温度”，请选择“100°C”。确保孵育时间为8分钟。接下来，单击TS抑制剂并选择TS中和。
- 单击TS抗体，对于极低温度，选择37°C。然后，在抗体中，从分配器标签中选择抗体编号（本例中为抗体 7），对于加孵育时间，选择 32 分钟。
- 单击 TS 多聚体 HRP，然后选择 TS 多聚体 HRP 阻滞剂。 然后，对于抗体封闭，选择Gt Ig封闭，对于孵育时间，选择4分钟。接下来，在多聚体 HRP 试剂上，选择 OMap 抗 Rb HRP，对于孵育时间，选择 16 分钟。然后，单击TS FAM，对于长孵育时间，选择0小时8分钟。
- 向协议添加标题。选择一个协议编号，添加注释，然后单击活动，然后单击保存。
- 准备载玻片、打印标签并开始自动染色机运行
- 烘烤供应商采购的FFPE（福尔马林固定，石蜡嵌入）人体组织切片在设置为70°C的烤箱中20-60分钟。在烘焙载玻片时，通过单击自动染色器软件中的“创建标签”来打印标签。接下来，单击协议，选择协议编号，然后单击关闭/打印。在幻灯片标签上添加相关信息，然后单击打印。
- 从烤箱中取出载玻片，让它们冷却至室温 （RT）。将先前打印的方案标签应用于相应的幻灯片。
- 根据步骤1.1中分配的抗体标签编号，在可再填充的抗体分配器中装入抗体。在该协议中，使用抗体 6 用于 1 μg/mL 的 FAP，使用抗体 3 用于 0.1 μg/mL 的泛细胞角蛋白，并使用抗体 7 用于 2.5 μg/mL 的抗体 X。在指定的稀释剂中稀释每种抗体，并在可再填充的抗体分配器中灌注。
- 收集上述封闭、检测和扩增预填充试剂分配器，并将其放在试剂托盘上。在载玻片托盘中加载载玻片（每次运行最多 30 张载玻片），然后单击“ 正在运行 ”，然后单击 “是”。请注意，DAPI 不用于核复染。
- 通过检查自动染色器软件上的运行持续时间来确认运行开始。该协议需要~11小时才能完成，并且可以在一夜之间运行。
- 第二天，通过观察滑盘插槽上的绿色闪烁灯来确保运行完成。然后，将载玻片从仪器上取下，并在1x反应缓冲液中用力冲洗载玻片，直到液体盖玻片溶液完全去除。
- 用于蛋白质组学测定的空间分析平台协议
- 遵循以下注释中指示的空间蛋白质组学协议。包括对协议的以下更改，以启用 3-plex 自动标记过程。
- 在开始空间蛋白质组学方案的前一天执行步骤1.2.1-1.2.6，并在执行步骤1.2.6后直接进入空间蛋白质组学方案的抗原修复步骤。省略空间剖析蛋白质组学协议中概述的可视化过程。
- 在 5000 nM 下用 SYTO 64 替换 SYTO 13，以实现荧光团整合。在1x TBS中稀释SYTO 64，并在湿度室中孵育15分钟。
- 在空间分析平台中设置扫描参数时，请根据可视化面板中使用的荧光团选择滤光片和聚焦通道，以实现三重集成。将 FITC 用于 DISCOVERY FAM 并将曝光设置为 200 毫秒，将曝光设置为 200 毫秒，将 Cy3 用于 DISCOVERY 罗丹明 6G 并将曝光设置为 200 毫秒，对 SYTO 64 使用 Texas Red 并将曝光设置为 50 毫秒（指定此作为焦点通道），最后，将 Cy5 用于 DISCOVERY Cy5，将曝光设置为 200 毫秒， 并保存更改。
注意：空间剖析蛋白质组学协议的详细说明可在官方网站支持选项卡中找到，方法是选择 文档>用户手册。在这里，寻找使用键 RX 的 nCounter 蛋白质协议。
2. 空间转录组学测定的ROI选择
- 在设置为70°C的烤箱中烘烤FFPE细胞颗粒切片20-60分钟。遵循下面注释中指示的空间分析平台NGS协议，并在空间分析平台上扫描载玻片，选择50 μm和300 μm的尺寸。对于空间转录组学测定，突出显示了以下建议：
- 准备库时，如果选择了各种大小的 ROI，请将相似大小的 ROI 汇集在一起，使每个大小对应一个库。这是为了确保为所有ROI实现足够的测序深度，而不会因大小而产生偏差。
注意：有关空间剖析平台的详细说明，请参阅官方网站“支持”选项卡，方法是选择 “文档>用户手册”。在这里，寻找使用键 RX 的 NGS 应用的 RNA 协议。
- 准备库时，如果选择了各种大小的 ROI，请将相似大小的 ROI 汇集在一起，使每个大小对应一个库。这是为了确保为所有ROI实现足够的测序深度，而不会因大小而产生偏差。
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Representative Results
自动可视化协议，指导投资回报率选择
在本文中，我们介绍了使用基于TSA的自动化定制IF协议来可视化组织并选择特定的ROI。使用黑色素瘤和人类正常皮肤作为对照组织的可视化面板开发包括表位稳定性测试、标记强度的微调以及通过遗漏一个对照进行的出血评估。为了测试抗体的表位稳定性是否受到重复洗脱步骤的影响，在3重的每个位置标记后，对FAP和抗体X信号进行了定性评估。抗体X信号在所有位置保持一致，而洗脱一次后FAP信号强度下降（图2）。先前的内部研究表明，panCK表位在整个3重测定中是稳定的。因此，FAP被选在3-plex的第1位， panCK被放置在第2位，抗体X被选在3位。 由于与抗体X和panCK相比，FAP信号总体上较弱，因此FAP与更亮的荧光团Cy5配对。
自动 3 重通过省略一个输出对照进行了优化，其中每个标记从 3-plex 协议中省略一次，以确认没有渗入相邻通道（图 3）。
自动染色平台上使用的荧光团在空间分析平台上进行了测试，以确认滤光片与3重可视化面板中的TSA荧光团兼容。由于 3 重协议使用 FITC、Cy3 和 Cy5，并且 DAPI 通道用于空间剖面平台上的紫外线切割，因此必须在德克萨斯红通道中使用核复染。测试了两种不同的核染料SYTO 59和SYTO 64，染料在结肠组织中显示出明显的核信号。但是，使用 SYTO 64 时，SYTO 59 在 Cy5 通道中也显示了一些出血信号，而 Cy5 通道是干净的（图 4）。因此，SYTO 64是核探测的首选。
SYTO 64的进一步测试表明，这种染料不具有光稳定性，并且在成像过程中会迅速进行光漂白。一旦信号漂白，成像系统就会聚焦在背景上，这可以解释为非特异性信号（图5）。增加核染料的浓度以增加信号强度有助于最大限度地减少这个问题。
将使用直接偶联抗体的panCK/CD45手动可视化方案标记的组织与使用panCK/FAP/Antibody X自动定制可视化方案标记的组织进行比较。两种协议共享panCK作为公共标记，并且两种协议之间的信号相当（图6）。
为了确保修改后的可视化方案对上游空间蛋白质组学测定没有影响，我们比较了使用 panCK/CD45 手动可视化协议时空间分析平台收集和计数平台处理后获得的计数值。这使用直接偶联抗体或使用 TSA 的 3-plex 自动自定义可视化方案。用panCK/CD45手动可视化方案或3-plex自动定制可视化方案结合空间蛋白质组学测定标记四种结直肠癌（CRC）组织。为每个方案选择相似的ROI，并使用S6和组蛋白的内务归一化比较相应ROI的计数数据。如log2热图（图7A）所示，在这些ROI之间观察到了类似的趋势，空间蛋白质组学测定中包含的所有标记物的Spearman R值为0.88（图7B）。在测定中使用的31种抗体中，23种抗体的Spearman R值高于或等于0.5。
由于空间蛋白质组学和转录组学方案不同，我们评估了自动可视化方案是否也可以应用于空间转录组学测定。自动可视化方案要求在RNA检测之前进行IHC测定，而原始的手动方案在应用可视化方案之前先检测RNA。3-plex自动可视化方案与CK/CD45手动可视化方案结合空间转录组学测定并排测试。与 CK/CD45 手动可视化协议相比，在空间分析软件上归一化的 3 重自动可视化协议四分位数 3 计数 （Q3） 的测序数据呈现的值较低（图 8A），这也反映在 0.15 的低 Spearman R 值上（图 8B）。此外，使用3重可视化自动化协议时观察到动态范围损失（图8C）。
自动可视化方案的这种计数损失表明该协议损害了RNA的完整性，并且在执行可视化测定之前检测RNA对于保持RNA质量是必要的。由于该自动可视化组合要求在RNA检测之前执行蛋白质部分，因此该协议不适用于RNA测定。
空间转录组学测定中ROI选择的大小
为了更好地了解ROI大小对RNA数据输出的影响，比较了不同大小ROI的RNA计数。对SUDHL1和JURKAT细胞系进行空间转录组学测定，以最大程度地减少组织固有的差异。选择直径为50 μm和300 μm的圆形ROI，并使用空间剖析软件上的Q3归一化相互比较。归一化后，不同细胞系上选定靶标的RNA计数在两种ROI大小之间相当（图9A，B）。
图 1：数字空间剖析工作流。 （A）载玻片用抗体（空间蛋白质组学测定）或探针（空间转录组学测定）以及可视化标记标记。（B） 将幻灯片放置在空间剖析平台上，以成像并选择 ROI。（C）寡核苷酸被紫外线切割并收集在96孔板中。对选定的每个 ROI 重复此过程。（D）处理样品，并使用计数平台或测序仪生成数据。该图已修改自纳米弦技术网站4，5。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：表位稳定性。（A-C）抗体X和（D-F）FAP分别在人类正常皮肤和黑色素瘤上测试。每个标记在 （A，D） 1st、（B，E） 2nd和 （C，F） 3 的 3rd 位置。抗体X在所有位置都稳定，而（D）FAP分别在（E-F）一次和两次洗脱后显示信号强度降低。抗体X为绿色，FAP为红色，DAPI为灰色。比例尺为 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：省略人胰腺组织 3-plex 自动自定义可视化方案的一个对照。对于所有图像，抗体X以绿色表示，panCK以青色表示，FAP以红色表示。第一行显示了 FITC 中的 （B） 抗体 X、Cy3 中的 （C） panCK 和 Cy5 中的 （D） FAP 的 （A） 3 重和单通道。第二行显示了 （E） 抗体 X 的留出对照 3 重和 （F-H） 每个标记物的单个通道。第三行显示了 （I） panCK 的留出一个控制 3 重和 （J-L） 每个标记的单通道。第四行显示了 （M） FAP 的留出一个控制 3 重和 （N-P） 每个标记的单通道。在任何留一出对照中均未观察到渗漏，如在测试（F）没有FAP，（K）没有panCK，（P）没有抗体X时，相应通道中缺乏信号。 比例尺为500μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：SYTO 染料测试。 德克萨斯红通道以结肠显示 （A） SYTO 59 的核信号，并渗入 （B） Cy5 通道（红色）。德克萨斯红通道显示（D）SYTO 64的冒号核信号，没有渗入（E）Cy5通道。科隆中的德克萨斯红和 Cy5 通道一起显示，以显示 SYTO 59 的 （C） 出血和 SYTO 64 的 （F） 无出血。比例尺为 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：SYTO 64 光稳定性。 在光漂白之前和之后用SYTO 64（A）标记的结肠样品。图像B显示了核信号丢失后变得更加明显的非特异性信号。比例尺为 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：panCK 标记的比较。 结直肠癌 （CRC） 样本上的 panCK 信号与 （A） panCK/CD45 手动可视化协议和 （B） panCK/FAP/抗体 X 自动可视化协议。两种方案之间的panCK信号没有差异。比例尺为 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：使用两种不同的可视化方案在四个 CRC 组织的相似 ROI 上比较空间蛋白质组学测定的计数值。 （A） 日志 2 空间蛋白质组学测定中包含的所有标记物的热图，将手动 panCK/CD45 方案（黑色）与自动 3 重方案（灰色）进行比较。（B） 所有标记的对数 2 斯皮尔曼相关性显示 R 值为 0.88。使用GraphPad Prism 7软件或Python编程语言进行统计分析。请点击此处查看此图的大图。
图 8：使用两种不同可视化方案的空间转录组学测定的计数值比较。 （A） 日志 2 空间转录组学测定中包含的选定靶标的热图，将手动 panCK/CD45 方案（黑色）与 3 重自动方案（灰色）进行比较。（B） 所有标记的对数 2 斯皮尔曼相关性显示 R 值为 0.15。（C） 3-plex 自动协议中动态范围丢失的平均值（蓝色）和标准偏差。使用GraphPad Prism 7软件或Python编程语言进行统计分析。请点击此处查看此图的大图。
图 9：细胞沉淀上空间转录组学测定的 RNA 计数值比较。 在（A）SUDHL1和（B）JURKAT细胞系上，对于选定靶标，观察到50 μm（黑色）和300 μm（灰色）直径ROI的可比结果。使用t检验未观察到显著差异。显示的平均值和标准偏差为 n = 每个大小 3 个 ROI。使用GraphPad Prism 7软件进行统计分析。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
迄今为止，手动方案中的直接偶联荧光抗体最常用作空间蛋白质组学或空间转录组学测定的可视化面板9，10。然而，对于丰度较低的标志物，使用直接偶联的荧光抗体可能具有挑战性，从而限制了合适抗体的选择。该协议表明，可视化标记物的标记可以在使用TSA技术的自动染色平台上自动进行，以支持空间蛋白质组学测定。这为可视化面板的定制提供了更大的灵活性，从而可以更有针对性的ROI选择和从组织的特定区域获取相关生物数据。TSA技术还允许低丰度标记物的可视化，从而增加潜在合适抗体的数量。此外，可视化方案的自动化确保了标记程序的可重复性和质量。
开发 3 重 IF 检测需要仔细评估适当对照组织的标志物/荧光团信号强度。建议滴定抗体浓度以获得最佳信噪比，这将有助于最大限度地减少渗入相邻通道。此外，应测试每个目标标记物的表位稳定性，以确保表位不受重复洗脱步骤的影响。一旦确认了面板中抗体的顺序，就需要使用省略一个对照对测定进行微调。在这里，面板中省略了特定的标记，并检查采集图像中的相应通道是否存在渗漏和串扰。
这里显示，基于TSA的测定可以在空间分析平台上成像，并且需要使用DAPI替代品进行核染色。我们测试了SYTO染料，并确定在决定使用哪种SYTO染料时，需要仔细评估信号以避免渗入相邻通道。使用SYTO染料的另一个限制是一些SYTO染料光漂白速度更快，例如SYTO 64和SYTO 83（内部数据），这可能会影响核定量。因此，应尽可能避免染色载玻片的光照。其他小组已经展示了SYTO 1311，12的使用，它具有更高的光稳定性（内部数据），只要将感兴趣的标记分配给与所选核染料相容的荧光团，就可以在面板中使用。
虽然基于TSA的自动化荧光测定与空间蛋白质组学测定相结合适用于可视化，但这里确定将3-plex自动可视化方案与空间转录组学方案相结合会导致动态范围的损失，这可能是由于添加可能影响RNA完整性的额外抗原修复/洗脱步骤的更苛刻的方案条件。因此，3-plex自动可视化方案应仅适用于蛋白质组学测定，这是一个局限性，需要基于RNA的测定的替代可视化方法。作为同载玻片可视化的替代方法，可以叠加涂有感兴趣标记的连续切片，以方便ROI的选择13。此外，文献描述了在相邻载玻片上使用 原位 杂交来指导ROI选择14。然而，这些方法可能会受到组织可用性、节间变异性和细胞间登记的限制。
我们还测试了不同ROI大小对空间转录组学测定的可用性。使用50μm的小ROI使研究人员能够获取特定区域的数据，从而更详细地读取选定的细胞或感兴趣的区域。选择小ROI的局限性在于，存在的细胞数量可能不够丰富，无法获得可以从背景中区分的计数值。一种选择是选择纯细胞群来捕获丰度较低的靶标。然而，单电池的ROI选择受到高信噪比15的限制。此外，如果在单个实验中收集不同大小的ROI，则考虑文库制备的ROI大小非常重要。如果 ROI 大小差异很大，则根据其大小汇集 ROI 并构建单独的库以防止在一个库中过度表示较大的 ROI 可能是有益的。这也将确保每个ROI将根据其大小获得足够的测序覆盖率。
执行空间组学实验时要考虑的其他因素是，由于幻灯片之间的可变性，数据可能会显示变化，并且某些目标的较低表达可能会导致背景和相关值的差异。在规划实验和评估数据时，需要考虑适当的控制和规范化方法。对于nCounter上的空间蛋白质组学测定，根据内部经验和供应商建议，归一化为管家靶标或阴性对照IgG是首选方法，其中需要评估管家靶标或阴性对照IgG之间的相关性16。然而，根据所使用的组织，需要为每项研究定义最佳标准化17，18。例如，文献指出，对于乳腺癌空间组学研究，通常用于规范化为管家目标的GAPDH不如S6和组蛋白19一致。因此，S6和组蛋白一直是乳腺癌组织正常化的推荐管家靶标19。
对于空间转录组学测定，需要根据研究设计（例如，组织类型和ROI选择）定义标准化策略。RNA-Seq中使用的一些策略，例如上四分位数或修剪的M值平均值（TMM）归一化，可以应用于标准化测序数据19，20。
空间转录组学测定提供数千个靶标的信息，并且越来越常用于探索整个转录组，其中特定的TME区室与单核RNA-seq20 或单细胞RNA测序21一起选择和分析。我们证明了指导ROI选择以评估靶标空间分布的可视化协议可以自动化用于空间蛋白质组学测定，但不能用于空间转录组学测定。此外，我们还提出，可以选择小至50μm的ROI，以便对特定组织区域进行更深入的研究。该技术的未来应用将提高对肿瘤微环境的理解。
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Disclosures
Veronica Ibarra-Lopez，Sangeeta Jayakar，Yeqing Angela Yang，Zora Modrusan和Sandra Rost是罗氏集团成员Genentech的员工和股东。罗氏旗下的其他公司生产本手稿中使用的试剂和仪器。Ciara Martin是NanoString Technologies Inc的全职员工，该公司生产本手稿中使用的试剂和仪器。
Acknowledgments
作者承认Thomas Wu处理NGS文件。我们感谢James Ziai的结果讨论和稿件审查，以及Meredith Triplet和Rachel Taylor的内部稿件修订。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
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- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
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