Summary
여기에서는 종양 미세 환경을 더 잘 특성화하고 특정 세포 집단을 식별하기 위해 Spatial Omics 기술의 관심 영역(ROI)을 미세 조정하는 프로토콜을 설명합니다. 단백질체학 분석의 경우 자동화된 맞춤형 프로토콜이 ROI 선택을 안내할 수 있는 반면, 전사체학 분석은 50μm의 작은 ROI를 활용하여 미세 조정할 수 있습니다.
Abstract
멀티플렉싱을 사용하면 동일한 조직에서 여러 마커를 평가하는 동시에 공간적 맥락을 제공할 수 있습니다. Spatial Omics 기술은 각각 광절단 가능한 올리고 태그 항체와 프로브를 활용하여 단백질과 RNA 멀티플렉싱을 모두 가능하게 합니다. 올리고는 조직 전체의 특정 영역에서 절단되고 정량화되어 기본 생물학을 설명합니다. 여기에서 이 연구는 자동화된 맞춤형 항체 시각화 프로토콜을 활용하여 공간 단백질체학 분석과 함께 ROI 선택을 안내할 수 있음을 보여줍니다. 이 특정 방법은 공간 전사체학 분석에서 허용 가능한 성능을 나타내지 않았습니다. 이 프로토콜은 티라마이드 신호 증폭(TSA)을 사용하여 주어진 단백질 표적의 형광 신호를 증폭하고 선택할 수 있는 항체 풀을 늘리는 자동화된 플랫폼에서 마커 시각화를 위한 3-plex 면역형광(IF) 분석의 개발을 설명합니다. 시각화 프로토콜은 품질과 재현성을 보장하기 위해 철저히 검증된 3-plex 분석을 사용하여 자동화되었습니다. 또한 공간 프로파일링 플랫폼에서 TSA 기반 IF 분석의 이미징을 허용하도록 SYTO 염료에 대한 DAPI의 교환을 평가했습니다. 또한 공간 전사체학 분석을 사용하여 작은 ROI를 선택하여 매우 특정한 관심 영역(예: 주어진 세포 유형에 대해 풍부한 영역)을 조사할 수 있는 능력을 테스트했습니다. 50 μm 및 300 μm 직경의 ROI를 수집하였으며, 이는 각각 대략 15 개의 세포 및 100 개의 세포에 해당한다. 샘플을 라이브러리로 만들고 시퀀싱하여 조직의 작은 ROI 및 프로파일 특이적 영역에서 신호를 감지하는 기능을 조사했습니다. 우리는 공간 단백질체학 기술이 ROI 선택을 안내하는 자동화되고 표준화된 프로토콜의 이점을 크게 활용한다고 판단했습니다. 이 자동화된 시각화 프로토콜은 공간 전사체학 분석과 호환되지 않았지만 표준 수동 시각화 프로토콜을 사용하여 작은 ROI에서도 특정 세포 집단을 성공적으로 검출할 수 있는지 테스트하고 확인할 수 있었습니다.
Introduction
멀티플렉싱 기술의 발전은 종양에 존재하는 표적에 대해 더 나은 특성화 도구를 계속 제공합니다. 종양 미세환경(TME)은 종양 세포, 침윤 면역 세포 및 기질의 복잡한 시스템으로, 공간정보는 관심 바이오마커 간의 상호 작용 메커니즘을 더 잘 이해하고 해석하는 데 중요합니다1. GeoMx 디지털 공간 프로파일러(DSP) 및 10x Visium과 같은 새로운 기술을 통해 공간 컨텍스트 내에서 여러 대상을 동시에 감지하고 정량화할 수 있습니다. 조직 시각화를 용이하게 하는 면역형광 프로토콜을 사용하면 이러한 기술의 공간 프로파일링 기능을 더욱 향상시킬 수 있습니다.
이 방법 개발을 위해 집중한 Spatial Omics 기술은 UV 민감성 광절단 링커를 통해 올리고뉴클레오티드가 항체 또는 RNA 프로브에 부착되는 공간 단백질체학 및 전사체학 분석으로 구성됩니다. 조직학적 슬라이드는 이러한 올리고-접합된 항체 또는 프로브로 표지된 다음 공간 프로파일링 플랫폼에서 이미지화됩니다. 다음으로, 조명을 위해 다양한 크기와 모양의 ROI를 선택하고, 광절단된 올리고뉴클레오티드를 흡인하여 96웰 플레이트에 수집합니다. 광절단 올리고뉴클레오티드는 나노스트링 nCounter 시스템 또는 차세대 염기서열분석(NGS)2,3(그림 1)4,5로 정량할 수 있도록 준비됩니다.
세포 분포는 조직 내에서 다양하며, 선택된 마커와 다양한 ROI 크기를 사용하여 세포의 특정 위치를 특성화하는 능력은 조직 환경을 완전히 이해하고 특정 특징을 식별하는 데 매우 중요합니다. 여기에 언급된 Spatial Omics 기술에서 표준 시각화 프로토콜은 직접 접합 항체를 사용하며 수동 프로토콜입니다. 종양과 기질을 구별하는 표준 마커는 panCytokeratin (panCK) 및 CD45 6,7이지만 관심있는 특정 세포 집단을 표적으로 삼기 위해서는 추가 마커가 필요합니다. 또한, 직접 접합된 형광 항체의 사용은 증폭이 부족하여 항체 선택을 풍부한 마커로 제한합니다. 또한 수동 분석은 자동화된 워크플로우보다 더 가변성이 있습니다8. 따라서, ROI 선택을 위한 커스터마이징, 자동화 및 증폭된 시각화 프로토콜을 갖는 것이 바람직하다.
여기에서 이 연구는 공간 단백질체학 분석의 경우 TSA 기술을 자동화된 플랫폼의 시각화 프로토콜에 사용하여 보다 표적화되고 표준화된 분석을 수행할 수 있음을 보여줍니다. 또한 TSA 기반 분석을 통해 저발현 마커를 사용할 수 있으므로 시각화를 위해 선택할 수 있는 표적의 범위가 늘어납니다. panCK, FAP 및 항체 X에 대한 3-plex 분석은 panCK 및 FAP를 사용하여 각각 종양과 기질을 구별하는 자동화 플랫폼을 사용하여 개발되었습니다. 항체 X는 종양에서 자주 발생하는 기질 단백질이지만 생물학과 항 종양 면역에 미치는 영향은 완전히 이해되지 않았습니다. 항체 X가 풍부한 영역에서 면역 질감을 특성화하면 항 종양 면역 및 치료 반응에서의 역할과 약물 표적으로서의 잠재력을 설명 할 수 있습니다.
맞춤형 자동 TSA 시각화 패널이 공간 단백질체학 분석에 성공한 것으로 입증되었지만 공간 전사체학 분석에 대한 이러한 분석의 적용은 확인할 수 없었습니다. 이는 RNA 무결성을 손상시키는 것으로 보이는 자동화된 시각화 프로토콜에 사용되는 시약과 프로토콜 때문일 가능성이 큽니다. 시각화 마커에 대한 자동 라벨링 프로토콜은 공간 단백질체학 분석에는 사용할 수 있지만 공간 전사체학 분석에는 사용할 수 없다는 사실을 인식하면 공간 오믹스 기술 분석 설계에 대한 중요한 지침을 제공합니다.
또한이 연구는 공간 전사체학 분석을 사용하여 직경이 50μm만큼 작은 영역 또는 약 15 개의 세포에서 표적을 프로파일 링 할 수 있음을 보여줍니다. 작은 ROI에서 전사체를 검출하는 분석의 능력을 테스트하기 위해 두 가지 다른 크기의 ROI가 선택되었습니다. 각 관심 영역에 대해 1,800개의 mRNA 표적에 해당하는 올리고를 수집하여 공간 프로파일링 플랫폼 프로토콜에 따라 라이브러리로 만들었습니다. 라이브러리는 개별적으로 인덱싱되고, 이후에 풀링되고, 순서가 지정되었습니다. 이를 통해 풀링 효율성과 작은 ROI에서 특정 세포 집단을 식별하는 능력을 모두 평가할 수 있었습니다.
이 논문은 공간 단백질체학 분석의 경우 관심 있는 특정 마커에 대한 ROI 선택을 안내하는 자동화된 프로토콜을 사용하여 관련 조직 영역의 질문을 선택적으로 타겟팅하고 조직의 공간 환경을 특성화할 수 있음을 보여줍니다. 또한, 특정 세포 집단을 검출하고 특성화하기 위한 공간 전사체 분석에 더 작은 ROI를 사용할 수 있음을 입증합니다.
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Protocol
모든 인체 조직은 적절한 기관 검토 위원회의 승인과 정보에 입각한 동의를 얻었다는 보증에 따라 상업용 바이오뱅크 또는 공인 조직 은행에서 획득했습니다.
참고: 프로토콜은 디스커버리 울트라 및 GeoMx 디지털 공간 프로파일러를 사용하여 수행됩니다. 이 프로토콜에 사용되는 시약, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 공간 단백질체학 분석을 위한 자동화된 시각화 프로토콜
- 형광 시각화 항체를 적용하기 위한 프로그램 자동염색기
- 오토스테이너 소프트웨어에서 홈 버튼을 클릭하고 프로토콜을 선택합니다. 그런 다음 프로토콜 만들기/편집을 클릭하고 절차로 RUO 디스커버리 유니버설 을 선택합니다.
- Depar v2> 탈파라핀화를 > 첫 번째 시퀀스를 클릭합니다. 중간 온도의 경우 72°C를 선택한 다음 전처리를 클릭하고 셀 컨디셔닝 및 CC1 저장소를 선택합니다. 매우 높은 온도의 경우 100°C를 선택한 다음 CC1 8분을 클릭하고 CC1 64분이 선택될 때까지 계속 클릭합니다.
- 억제제 > DISCOVERY 억제제를 클릭하고 배양 시간으로 8분을 선택합니다. 그런 다음 항체 > 고온 Ab 배양; 저온의 경우 37°C를 선택합니다. 항체의 경우 디스펜서 레이블에서 항체 번호를 선택합니다(이 예에서는 항체 6). 플러스 배양 시간에서 32분을 선택합니다.
참고: 이 프로토콜에는 세 가지 다른 항체 번호가 있습니다. 첫 번째 항체는 FAP, 두 번째 항체는 범 사이토 케라틴, 세 번째 항체는 항체 X입니다. - 다량체 HRP > 다량체 HRP 차단기를 클릭한 다음 항체 차단에서 Gt Ig 차단을 선택하고 배양 시간에 4분을 선택합니다. 다음으로 다량체 HRP 시약에서 OMap 항-Rb HRP를 선택하고 배양 시간으로 16분을 선택합니다. 그런 다음 Cy5를 클릭하고 긴 배양 시간에 대해 0시간 8분을 선택합니다.
- 이중 서열을 클릭하고 항체 변성을 선택한 다음 항체 변성 CC2-1을 선택하고 매우 높은 온도의 경우 100°C를 선택합니다. 배양 시간이 8 분인지 확인하십시오. 그런 다음 DS 억제제를 클릭하고 중화를 선택합니다.
- DS 항체를 클릭하고 매우 낮은 온도의 경우 37°C를 선택합니다. 그런 다음 항체의 디스펜서 레이블(이 예에서는 항체 3)에서 항체 번호를 선택하고 플러스 배양 시간에 대해 32분을 선택합니다.
- DS 멀티머 HRP를 클릭하고 DS 멀티머 HRP 차단기를 선택합니다. 그런 다음 항체 차단에서 Gt Ig 차단을 선택하고 배양 시간으로 4분을 선택합니다. 다음으로, 다량체 HRP 시약에서 OMap 안티-MS HRP를 선택하고 배양 시간으로 16분을 선택합니다. 그런 다음 DS Rhodamine 6G를 클릭하고 긴 배양 시간에 대해 0 시간 8 분을 선택하십시오.
- 삼중 염색을 클릭하고 TS 항체 변성을 선택한 다음 항체 변성 CC2-2를 선택하고 매우 높은 온도의 경우 100°C를 선택합니다. 배양 시간이 8 분인지 확인하십시오. 그런 다음 TS 억제제를 클릭하고 TS 중화를 선택합니다.
- TS 항체를 클릭하고 매우 낮은 온도의 경우 37°C를 선택합니다. 그런 다음 항체의 디스펜서 레이블(이 예에서는 항체 7)에서 항체 번호를 선택하고 플러스 배양 시간에 대해 32분을 선택합니다.
- TS 멀티머 HRP를 클릭하고 TS 멀티머 HRP 차단기를 선택합니다. 그런 다음 항체 차단에서 Gt Ig 차단을 선택하고 배양 시간으로 4분을 선택합니다. 다음으로 다량체 HRP 시약에서 OMap 항-Rb HRP를 선택하고 배양 시간으로 16분을 선택합니다. 그런 다음 TS FAM을 클릭하고 긴 배양 시간에 대해 0시간 8분을 선택합니다.
- 프로토콜에 제목을 추가합니다. 프로토콜 번호를 선택하고 주석을 추가한 다음 활성 을 클릭한 다음 저장을 클릭합니다.
- 슬라이드 준비, 라벨 인쇄, 오토스테이너 실행 시작
- 베이킹 공급업체는 70°C로 설정된 오븐에서 20-60분 동안 FFPE(포르말린 고정, 파라핀 매립) 인체 조직 절편을 조달했습니다. 슬라이드가 베이킹되는 동안 오토스테이너 소프트웨어에서 라벨 만들기를 클릭하여 라벨 을 인쇄합니다. 그런 다음 프로토콜을 클릭하고 프로토콜 번호를 선택한 다음 닫기/인쇄를 클릭합니다. 슬라이드 레이블에 관련 정보를 추가하고 인쇄를 클릭합니다.
- 오븐에서 슬라이드를 꺼내 실온(RT)으로 식힙니다. 이전에 인쇄한 프로토콜 레이블을 해당 슬라이드에 적용합니다.
- 리필 가능한 항체 디스펜서에 단계 1.1에 할당된 항체 라벨 번호에 따라 항체를 로드합니다. 이 프로토콜에서는 1 μg/mL에서 FAP에 항체 6을 사용하고, 0.1 μg/mL에서 범사이토케라틴에 항체 3을 사용하고, 2.5 μg/mL에서 항체 X에 항체 7을 사용합니다. 지정된 희석제에 각 항체를 희석하고 리필 가능한 항체 디스펜서를 프라이밍합니다.
- 위에서 언급한 차단, 검출 및 증폭 미리 채워진 시약 디스펜서를 수집하여 시약 트레이에 놓습니다. 슬라이드 트레이에 슬라이드를 로드하고(실행당 최대 30개의 슬라이드) 실행을 클릭한 다음 예를 클릭합니다. DAPI는 핵 카운터 염색에 사용되지 않습니다.
- 오토스테이너 소프트웨어에서 실행 시간을 확인하여 실행 시작을 확인합니다. 프로토콜은 완료하는 데 ~11시간이 걸리며 밤새 실행할 수 있습니다.
- 다음 날, 슬라이드 트레이 슬롯에서 녹색으로 깜박이는 표시등을 관찰하여 실행 완료를 확인하십시오. 그런 다음 기기에서 슬라이드를 꺼내고 액체 커버슬립 용액이 완전히 제거될 때까지 1x 반응 버퍼에서 슬라이드를 세게 헹굽니다.
- 단백질체학 분석을 위한 공간 프로파일링 플랫폼 프로토콜
- 아래 메모에 표시된 공간 단백질체학 프로토콜을 따르십시오. 3-plex 자동 레이블 지정 절차를 활성화하기 위해 프로토콜에 다음 변경 사항을 포함합니다.
- 공간 단백질체학 프로토콜을 시작하기 전날 1.2.1-1.2.6단계를 수행하고 1.2.6단계를 수행한 후 공간 단백질체학 프로토콜의 항원 검색 단계로 바로 이동합니다. 공간 프로파일링 단백질체학 프로토콜에 설명된 시각화 절차를 생략합니다.
- 형광단 통합을 가능하게 하기 위해 5000nM에서 SYTO 13을 SYTO 64로 대체하십시오. SYTO 64를 1x TBS로 희석하고 습도 챔버에서 15분 동안 배양합니다.
- 공간 프로파일링 플랫폼에서 스캔 매개변수를 설정할 때 시각화 패널에 사용된 형광단에 따라 필터와 초점 채널을 선택하여 3-plex 통합을 허용합니다. 디스커버리 FAM 에 FITC를 사용하고 노출을 200ms로 설정하고, 디스커버리 로 다민 6G 에 Cy3를 사용하고 노출을 200ms로 설정하고, SYTO 64 에 텍사스 레드를 사용하고 노출을 50ms로 설정하고(초점 채널로 지정), 마지막으로 디스커버리 Cy5에 Cy5를 사용하고 노출을 200ms로 설정하고, 변경 사항을 저장합니다.
참고: 공간 프로파일링 단백질체학 프로토콜에 대한 자세한 지침은 공식 웹사이트 지원 탭에서 문서 > 사용자 설명서를 선택하여 찾을 수 있습니다. 여기에서 본드 RX를 사용하여 nCounter에 대한 단백질 프로토콜을 찾으십시오.
2. 공간 전사체학 분석을 위한 ROI 선택
- FFPE 셀 펠릿 섹션을 70°C로 설정된 오븐에서 20-60분 동안 굽습니다. 아래 참고에 표시된 공간 프로파일링 플랫폼 NGS 프로토콜을 따르고 공간 프로파일링 플랫폼에서 슬라이드를 스캔하여 50μm 및 300μm 크기를 선택합니다. 공간 전사체학 분석에 대해 다음 권장 사항이 강조 표시됩니다.
- 라이브러리를 준비할 때 다양한 크기의 ROI를 선택한 경우 비슷한 크기의 ROI를 함께 모아 크기당 하나의 라이브러리를 만듭니다. 이는 크기의 편향 없이 모든 ROI에 대해 충분한 시퀀싱 깊이가 달성되도록 하기 위한 것입니다.
참고: 공간 프로파일링 플랫폼에 대한 자세한 지침은 공식 웹사이트 지원 탭에서 문서 > 사용자 설명서를 선택하여 찾을 수 있습니다. 여기에서 Bond RX를 사용하는 NGS 애플리케이션을 위한 RNA 프로토콜을 찾으십시오.
- 라이브러리를 준비할 때 다양한 크기의 ROI를 선택한 경우 비슷한 크기의 ROI를 함께 모아 크기당 하나의 라이브러리를 만듭니다. 이는 크기의 편향 없이 모든 ROI에 대해 충분한 시퀀싱 깊이가 달성되도록 하기 위한 것입니다.
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Representative Results
ROI 선택을 안내하는 자동화된 시각화 프로토콜
이 백서에서는 자동화된 맞춤형 TSA 기반 IF 프로토콜을 사용하여 조직을 시각화하고 특정 ROI를 선택하는 방법을 소개합니다. 흑색종과 인간 정상 피부를 대조군 조직으로 사용하는 시각화 패널 개발은 에피토프 안정성 테스트, 마커 강도의 미세 조정 및 대조군을 배제한 출혈 평가로 구성되었습니다. 항체의 에피토프 안정성이 반복적인 용리 단계에 의해 영향을 받는지 시험하기 위해, FAP 및 항체 X 신호를 3-플렉스의 각 위치에서 표지한 후 정성적으로 평가하였다. 항체 X 신호는 모든 위치에서 일관되게 유지된 반면, FAP 신호 강도는 1회 용리 후 감소했습니다(그림 2). 이전의 내부 연구에 따르면 panCK 에피토프는 3-plex 분석 전반에 걸쳐 안정적입니다. 따라서, FAP는 3-플렉스에서 1번째 위치에, panCK는 2번째에, 항체 X는 3번째위치에 위치하도록 선택되었다. FAP 신호는 항체 X 및 panCK에 비해 전반적으로 약했기 때문에, FAP는 더 밝은 형광단인 Cy5와 쌍을 이뤘다.
자동화된 3-plex는 인접 채널로의 블리드스루가 없음을 확인하기 위해 3-plex 프로토콜에서 각 마커를 한 번 생략한 Leave one out 컨트롤로 최적화되었습니다(그림 3).
자동 염색 플랫폼에 사용된 형광단을 공간 프로파일링 플랫폼에서 테스트하여 필터가 3-plex 시각화 패널의 TSA 형광단과 호환되는지 확인했습니다. 3-plex 프로토콜은 FITC, Cy3 및 Cy5를 사용하고 DAPI 채널은 공간 프로파일링 플랫폼에서 UV 절단에 사용되기 때문에 텍사스 레드 채널의 핵 카운터스테인을 사용해야 했습니다. 두 가지 다른 핵 염료 인 SYTO 59와 SYTO 64가 테스트되었으며 염료는 결장 조직에서 뚜렷한 핵 신호를 보여주었습니다. 그러나 SYTO 59는 Cy5 채널에서 일부 블리드스루 신호를 표시한 반면 Cy5 채널은 SYTO 64를 사용할 때 깨끗했습니다(그림 4). 따라서 SYTO 64는 핵 탐지에 선호되는 선택이었습니다.
SYTO 64의 추가 테스트에서 이 염료는 광경화되지 않았으며 이미징 중에 빠르게 광표백되는 것으로 나타났습니다. 신호가 표백되면 이미징 시스템은 비특이적 신호로 해석될 수 있는 배경에 초점을 맞춥니다(그림 5). 신호 강도를 높이기 위해 핵 염료의 농도를 높이면 이 문제를 최소화하는 데 도움이 되었습니다.
직접 접합된 항체를 사용하는 panCK/CD45 수동 시각화 프로토콜로 표지된 조직을 panCK/FAP/항체 X 자동 맞춤형 시각화 프로토콜로 표지된 조직과 비교했습니다. 두 프로토콜 모두 공통 마커로 panCK를 공유하며 신호는 두 프로토콜 간에 비슷했습니다(그림 6).
수정된 시각화 프로토콜이 업스트림 공간 단백질체학 분석에 영향을 미치지 않도록 panCK/CD45 수동 시각화 프로토콜을 사용할 때 공간 프로파일링 플랫폼 수집 및 계수 플랫폼 처리 후 얻은 계수 값을 비교했습니다. 이것은 직접 접합 항체 또는 TSA를 사용하는 3-plex 자동 맞춤형 시각화 프로토콜을 사용합니다. 4개의 대장암(CRC) 조직을 공간 단백질체학 분석과 함께 panCK/CD45 수동 시각화 프로토콜 또는 3-plex 자동 맞춤형 시각화 프로토콜로 표지했습니다. 각 프로토콜에 대해 유사한 ROI가 선택되었고, 해당 ROI의 카운트 데이터는 S6 및 Histone에 대한 하우스키핑 정규화를 사용하여 비교되었습니다. log2 히트맵(그림 7A)에 표시된 바와 같이 이러한 ROI 간에 유사한 경향이 관찰되었으며, 공간 단백질체학 분석에 포함된 모든 마커에 대해 Spearman R 값은 0.88이었습니다(그림 7B). 분석에 사용된 31개의 항체 중 23개의 항체는 0.5 이상의 Spearman R 값을 가졌다.
공간 단백질체학과 전사체 프로토콜이 다르기 때문에 자동화된 시각화 프로토콜이 공간 전사체학 분석에도 적용될 수 있는지 평가했습니다. 자동화된 시각화 프로토콜은 RNA 검출 전에 IHC 분석을 수행해야 하는 반면, 원래 수동 프로토콜은 시각화 프로토콜을 적용하기 전에 RNA를 먼저 검출합니다. 3-plex 자동 시각화 프로토콜은 공간 전사체학 분석과 함께 CK/CD45 수동 시각화 프로토콜과 나란히 테스트되었습니다. 공간 프로파일링 소프트웨어에서 정규화된 3-plex 자동 시각화 프로토콜 Quartile 3 count(Q3)에 대한 시퀀싱 데이터는 CK/CD45 수동 시각화 프로토콜(그림 8A)과 비교할 때 더 낮은 값을 나타냈으며, 이는 0.15의 낮은 Spearman R 값에도 반영됩니다(그림 8B). 또한 3-plex 시각화 자동화 프로토콜을 사용할 때 동적 범위의 손실이 관찰되었습니다(그림 8C).
자동화된 시각화 프로토콜로 카운트가 손실되면 이 프로토콜이 RNA 무결성을 손상시키고 RNA 품질을 보존하기 위해 시각화 분석을 수행하기 전에 RNA를 검출해야 함을 나타냅니다. 이 자동화된 시각화 패널은 RNA 검출 전에 단백질 부분을 수행해야 하기 때문에 이 프로토콜은 RNA 분석에 적합하지 않습니다.
공간 전사체학 분석에서 ROI 선택의 크기
ROI 크기가 RNA 데이터 출력에 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위해 다양한 크기의 ROI의 RNA 수를 비교했습니다. 공간 전사체학 분석은 조직에 내재된 차이를 최소화하기 위해 SUDHL1 및 JURKAT 세포주에서 수행되었습니다. 50μm 및 300μm 직경의 원형 ROI를 선택하고 공간 프로파일링 소프트웨어에서 Q3 정규화를 사용하여 서로 비교했습니다. 다른 세포주에서 선택된 표적에 대한 RNA 수는 정규화 후 두 ROI 크기 간에 비교되었습니다(그림 9A,B).
그림 1: 디지털 공간 프로파일링 워크플로. (A) 슬라이드는 시각화 마커뿐만 아니라 항체 (공간 단백질체학 분석) 또는 프로브 (공간 전사체학 분석)로 표지됩니다. (B) 슬라이드는 공간 프로파일링 플랫폼에 배치되어 ROI를 이미지화하고 선택합니다. (c) 올리고를 UV 광에 의해 절단하고 96-웰 플레이트에 수집한다. 이 프로세스는 선택한 모든 ROI에 대해 반복됩니다. (D) 샘플이 처리되고 카운팅 플랫폼 또는 시퀀서를 사용하여 데이터가 생성됩니다. 이 수치는 Nanostring 기술 웹 사이트 4,5에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 에피토프 안정성. (A-C) 항체 X 및 (D-F) FAP는 각각 인간 정상 피부 및 흑색종에서 시험하였다. 3 플렉스의 (A, D) 1st, (B, E) 2nd 및 (C, F) 3번째 위치에있는 각 마커. 항체 X는 모든 위치에서 안정한 반면, (D) FAP는 (E-F) 1회 및 2회 용출 후 각각 감소하는 신호전달 강도를 나타낸다. 항체 X는 녹색, FAP는 빨간색, DAPI는 회색입니다. 스케일 바는 200μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 인간 췌장 조직에 대한 3-plex 자동 맞춤형 시각화 프로토콜에 대한 컨트롤 하나만 생략합니다. 모든 이미지에서 항체 X는 녹색, panCK는 청록색, FAP는 빨간색으로 표시됩니다. 첫 번째 행은 (A) FITC에서 (B) 항체 X, Cy3에서 (C) panCK 및 Cy5에서 (D) FAP에 대한 (A) 3-플렉스 및 단일 채널을 보여줍니다. 제2 행은 각각의 마커에 대한 (E) 항체 X 및 (F-H) 단일 채널에 대한 대조군 3-플렉스 아웃을 남겨두고 나타낸다. 세 번째 행은 각 마커에 대한 (I) panCK 및 (J-L) 단일 채널에 대한 하나의 아웃 컨트롤 3-플렉스를 남겨 둡니다. 네 번째 행은 각 마커에 대한 (M) FAP 및 (N-P) 단일 채널에 대한 리노원 아웃 컨트롤 3-플렉스를 나타낸다. 시험시 (F) FAP가 없는 (F), panCK가 없는 (K) 및 항체 X가 없는 (P) 시험시 상응하는 채널에서 신호 부족으로 나타난 바와 같이 임의의 리워드 아웃 대조군에서 블리드스루가 관찰되지 않았다. 스케일 바는 500 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: SYTO 염료 테스트. 텍사스 레드 채널은 (A) SYTO 59에 대한 콜론의 핵 신호를 (B) Cy5 채널 (빨간색)으로 블리드 스루하여 표시합니다. 텍사스 레드 채널은 (E) Cy5 채널로의 블리드스루 없이 (D) SYTO 64에 대한 콜론에서의 핵 신호를 나타낸다. 콜론의 텍사스 레드 및 Cy5 채널이 함께 표시되어 SYTO 59의 블리드스루 (C) 및 SYTO 64의 블리드스루 없음(F)을 표시합니다. 스케일 바는 50 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: SYTO 64 광안정성. SYTO 64로 표지 된 결장 샘플 (A) 광퇴색 전 및 후 (B). 이미지 B는 핵 신호 손실 후 더 잘 보이는 비특이적 신호를 보여줍니다. 스케일 바는 50 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: panCK 라벨링 비교 . (A) panCK/CD45 수동 시각화 프로토콜 및 (B) panCK/FAP/항체 X 자동 시각화 프로토콜을 사용하는 대장암(CRC) 샘플의 panCK 신호. 두 프로토콜 간에 panCK 신호의 차이는 관찰되지 않았다. 스케일 바는 200μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 4개의 CRC 조직의 유사한 ROI에 대한 두 가지 다른 시각화 프로토콜을 사용한 공간 단백질체학 분석의 카운트 값 비교. (A) 수동 panCK/CD45 프로토콜(검은색)과 자동화된 3-plex 프로토콜(회색)을 비교하는 공간 단백질체학 분석에 포함된 모든 마커의 로그 2 히트맵. (b) 모든 마커에 대한 로그 2 스피어맨 상관관계는 0.88의 R 값을 제시한다. 통계 분석은 GraphPad Prism 7 소프트웨어 또는 Python 프로그래밍 언어를 사용하여 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 두 가지 다른 시각화 프로토콜을 사용한 공간 전사체학 분석에 대한 카운트 값 비교. (A) 수동 panCK/CD45 프로토콜(검은색)과 3-plex 자동 프로토콜(회색)을 비교하는 공간 전사체학 분석에 포함된 선택된 표적의 로그 2 히트맵. (b) 모든 마커에 대한 로그 2 스피어맨 상관관계는 0.15의 R 값을 제시한다. (C) 3-plex 자동화 프로토콜에서 동적 범위가 손실되는 평균(파란색) 및 표준 편차. 통계 분석은 GraphPad Prism 7 소프트웨어 또는 Python 프로그래밍 언어를 사용하여 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 세포 펠릿에 대한 공간 전사체학 분석을 위한 RNA 카운트 값 비교. (A) SUDHL1 및 (B) JURKAT 세포주에서 선택된 표적에 대해 50μm (검은색) 및 300μm(회색) 직경 ROI에 대해 비교 가능한 결과가 관찰되었습니다. t-검정을 사용한 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 크기당 n = 3개의 ROI에 대해 표시된 평균 및 표준 편차. 통계 분석은 GraphPad Prism 7 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
현재까지, 수동 프로토콜에서 직접 접합된 형광 항체는 공간 단백질체학 또는 공간 전사체학 분석(9,10)을 위한 시각화 패널로서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 직접 접합된 형광 항체의 사용은 덜 풍부한 마커에 대해 도전적일 수 있으며, 적합한 항체의 선택을 제한할 수 있다. 이 프로토콜은 공간 단백질체학 분석을 지원하기 위해 TSA 기술을 사용하는 자동화된 염색 플랫폼에서 시각화 마커의 라벨링을 자동화할 수 있음을 보여줍니다. 이를 통해 시각화 패널의 사용자 정의에 더 많은 유연성을 허용하여 조직의 특정 영역에서 관련 생물학적 데이터를 보다 표적화된 ROI 선택 및 획득할 수 있습니다. TSA 기술은 또한 낮은 존재비 마커의 시각화를 허용하여 잠재적으로 적합한 항체의 수를 증가시킵니다. 또한 시각화 프로토콜의 자동화는 라벨링 절차의 재현성과 품질을 보장합니다.
3-plex IF 분석을 개발하려면 적절한 대조 조직에서 마커/형광단 신호 강도를 신중하게 평가해야 합니다. 최상의 신호 대 잡음비를 얻기 위해 항체 농도를 적정하는 것이 권장되며, 이는 인접 채널로의 블리드 스루를 최소화하는 데 도움이됩니다. 더욱이, 각각의 관심 마커에 대한 에피토프 안정성은 에피토프가 반복된 용리 단계에 의해 영향을 받지 않는 것을 보장하기 위해 시험되어야 한다. 패널에서 항체의 순서가 확인되면 분석을 미세 조정하여 하나를 제외하고 대조군을 사용해야 합니다. 여기서 패널에서 특정 마커를 생략하고 획득 한 이미지의 해당 채널을 블리드 스루 및 누화에 대해 검토합니다.
TSA 기반 분석은 공간 프로파일링 플랫폼에서 이미지화할 수 있으며 DAPI 대안은 핵 염색에 사용해야 합니다. 우리는 SYTO 염료를 테스트하고 어떤 SYTO 염료를 사용할지 결정할 때 인접 채널로의 블리드 스루를 피하기 위해 신호를 신중하게 평가해야한다고 결정했습니다. SYTO 염료 사용의 또 다른 한계는 SYTO 64 및 SYTO 83 (내부 데이터)과 같은 일부 SYTO 염료가 포토 블리시드를 더 빨리 방출하여 핵 정량화에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 따라서 염색 된 슬라이드의 빛 노출은 가능한 한 피해야합니다. 다른 그룹은 SYTO 1311,12의 사용을 보여 주었는데, 이는 더 많은 광 테이블 (내부 데이터)이며 관심있는 마커가 선택한 핵 염료와 호환되는 형광단에 할당되는 한 패널에서 사용할 수 있습니다.
자동화된 TSA 기반 형광 분석은 공간 단백질체학 분석과 함께 시각화에 적합했지만, 3-plex 자동 시각화 프로토콜과 공간 전사체학 프로토콜을 결합하면 RNA 무결성에 영향을 미칠 수 있는 추가 항원 검색/용리 단계를 추가하는 더 가혹한 프로토콜 조건으로 인해 동적 범위가 손실될 수 있습니다. 따라서 3-plex 자동 시각화 프로토콜은 단백질체학 분석에만 적용되어야 하며, 이는 한계이며 RNA 기반 분석을 위한 대체 시각화 접근 방식이 필요합니다. 동일-슬라이드 시각화에 대한 대안으로서, 관심 마커로 염색된 연속 섹션이 오버레이되어 ROI 선택(13)을 용이하게 할 수 있다. 또한, 상기 문헌은 ROI 선택(14)을 안내하기 위해 인접한 슬라이드 상의 계내 혼성화의 사용을 기술한다. 그러나 이러한 접근법은 조직 가용성, 섹션 간 가변성 및 세포 간 등록에 의해 제한 될 수 있습니다.
또한 공간 전사체학 분석에 대한 다양한 ROI 크기의 유용성을 테스트했습니다. 50μm의 작은 ROI를 사용하면 연구원이 특정 영역의 데이터를 획득하여 선택한 세포 또는 관심 영역을 보다 자세히 판독할 수 있습니다. 작은 ROI를 선택할 때의 한계는 존재하는 셀 수가 배경과 구별할 수 있는 카운트 값을 얻을 만큼 충분히 풍부하지 않을 수 있다는 것입니다. 한 가지 옵션은 덜 풍부한 표적을 포획하기 위해 순수 세포 집단을 선택하는 것입니다. 그러나, 단일 셀에 대한 ROI 선택은 높은 신호 대 잡음비(15)에 의해 제한된다. 또한 단일 실험에서 다양한 크기의 ROI를 수집하는 경우 라이브러리 준비를 위한 ROI 크기를 고려하는 것이 중요합니다. ROI 크기가 크게 다른 경우 크기에 따라 ROI를 풀링하고 별도의 라이브러리를 구성하여 큰 ROI가 하나의 라이브러리에서 과도하게 표현되는 것을 방지하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 이렇게 하면 각 ROI가 크기에 따라 충분한 시퀀싱 범위를 얻을 수 있습니다.
Spatial Omics 실험을 수행할 때 고려해야 할 다른 요소는 데이터가 슬라이드 간 변동성으로 인한 변동을 보일 수 있고 특정 대상의 발현이 낮으면 배경 및 상관 관계 값의 차이가 발생할 수 있다는 것입니다. 실험을 계획하고 데이터를 평가할 때 적절한 통제 및 정규화 접근 방식을 고려해야 합니다. nCounter에 대한 공간 단백질체학 분석의 경우, 하우스키핑 타겟 또는 음성 대조군 IgGs 간의 상관관계를 평가해야 하는 내부 경험 및 공급업체 권장 사항에 따라 하우스키핑 타겟 또는 음성 대조군 IgG로 정규화하는 것이 선호되는 방법입니다16. 그러나 사용 된 조직에 따라 모든 연구17,18에 대해 최상의 정규화를 정의해야합니다. 예를 들어, 문헌에 따르면 유방암 공간 오믹스 연구의 경우 하우스키핑 목표로 정규화하는 데 일반적으로 사용되는 GAPDH가 S6 및 Histone19보다 덜 일치했습니다. 따라서, S6 및 히스톤은 유방암 조직19에서 정상화를 위해 권장되는 하우스키핑 표적이 되었다.
공간 전사체학 분석의 경우 연구 설계(예: 조직 유형 및 ROI 선택)에 따라 정규화 전략을 정의해야 합니다. 상사분위수 또는 M 값의 절사 평균(TMM) 정규화와 같은 RNA-Seq에 사용되는 일부 전략은 시퀀스 데이터(19,20)를 정규화하는 데 적용될 수 있습니다.
공간 전사체학 분석은 수천 개의 표적에 대한 정보를 제공하며 특정 TME 구획이 단일 핵 RNA-seq20 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱21과 함께 선택 및 분석되는 전체 전사체를 탐색하는 데 점점 더 일반적으로 사용되고 있습니다. 우리는 표적의 공간 분포를 평가하기 위해 ROI 선택을 안내하는 시각화 프로토콜이 공간 단백질체학 분석에는 자동화될 수 있지만 공간 전사체학 분석에는 자동화되지 않을 수 있음을 입증했습니다. 또한 특정 조직 영역에 대한 보다 심층적인 조사가 가능하도록 50μm만큼 작은 ROI를 선택할 수 있습니다. 이 기술의 향후 적용은 종양 미세 환경에 대한 이해를 향상시킬 것입니다.
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Disclosures
Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan, Sandra Rost는 Roche Group의 일원 인 Genentech의 직원이자 주주입니다. Roche의 일부인 다른 회사는이 원고에 사용 된 시약과 도구를 생산합니다. Ciara Martin은 이 원고에 사용된 시약과 기기를 생산하는 NanoString Technologies Inc의 정규직 직원입니다.
Acknowledgments
저자는 NGS 파일을 처리 한 Thomas Wu를 인정합니다. 결과 토론과 원고 검토에 대해 James Ziai와 내부 원고 수정을 위해 Meredith Triplet과 Rachel Taylor에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
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