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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Profilage spatial de l’expression des protéines et de l’ARN dans les tissus : une approche pour affiner la microdissection virtuelle

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/62651
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 1
1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

Summary

Ici, nous décrivons un protocole de réglage fin des régions d’intérêt (ROI) pour les technologies Spatial Omics afin de mieux caractériser le microenvironnement tumoral et d’identifier des populations cellulaires spécifiques. Pour les tests protéomiques, des protocoles personnalisés automatisés peuvent guider la sélection du retour sur investissement, tandis que les tests transcriptomiques peuvent être affinés en utilisant des retours sur investissement aussi petits que 50 μm.

Abstract

Le multiplexage permet d’évaluer plusieurs marqueurs sur un même tissu tout en fournissant un contexte spatial. Les technologies Spatial Omics permettent le multiplexage des protéines et de l’ARN en exploitant respectivement les anticorps et les sondes oligo-marqués photo-clivables. Les oligos sont clivés et quantifiés à partir de régions spécifiques du tissu pour élucider la biologie sous-jacente. Ici, l’étude démontre que des protocoles automatisés de visualisation d’anticorps personnalisés peuvent être utilisés pour guider la sélection du retour sur investissement en conjonction avec les tests de protéomique spatiale. Cette méthode spécifique n’a pas montré de performances acceptables avec les tests de transcriptomique spatiale. Le protocole décrit le développement d’un test d’immunofluorescence (IF) 3-plex pour la visualisation de marqueurs sur une plate-forme automatisée, en utilisant l’amplification du signal tyramide (TSA) pour amplifier le signal fluorescent d’une cible protéique donnée et augmenter le pool d’anticorps parmi lesquels choisir. Le protocole de visualisation a été automatisé à l’aide d’un test 3-plex soigneusement validé pour assurer la qualité et la reproductibilité. En outre, l’échange de DAPI contre des colorants SYTO a été évalué pour permettre l’imagerie des tests IF basés sur TSA sur la plate-forme de profilage spatial. De plus, nous avons testé la capacité de sélectionner de petits ROI à l’aide du test de transcriptomique spatiale pour permettre l’investigation de domaines d’intérêt très spécifiques (par exemple, les zones enrichies pour un type de cellule donné). Des ROI de 50 μm et 300 μm de diamètre ont été collectés, ce qui correspond à environ 15 cellules et 100 cellules, respectivement. Les échantillons ont été transformés en bibliothèques et séquencés pour étudier la capacité de détecter les signaux provenant de petits retours sur investissement et de régions spécifiques au profil du tissu. Nous avons déterminé que les technologies de protéomique spatiale bénéficient grandement de protocoles automatisés et normalisés pour guider la sélection du retour sur investissement. Bien que ce protocole de visualisation automatisé n’était pas compatible avec les tests de transcriptomique spatiale, nous avons pu tester et confirmer que des populations cellulaires spécifiques peuvent être détectées avec succès même dans de petits retours sur investissement avec le protocole de visualisation manuelle standard.

Introduction

Les progrès des techniques de multiplexage continuent de fournir de meilleurs outils de caractérisation des cibles présentes dans les tumeurs. Le microenvironnement tumoral (TME) est un système complexe de cellules tumorales, infiltrant les cellules immunitaires, et de stroma, où l’information spatiale est essentielle pour mieux comprendre et interpréter les mécanismes d’interaction entre les biomarqueurs d’intérêt1. Avec des techniques émergentes telles que le GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) et 10x Visium, plusieurs cibles peuvent être détectées et quantifiées simultanément dans leur contexte spatial. L’utilisation de protocoles d’immunofluorescence qui facilitent la visualisation des tissus peut améliorer davantage les capacités de profilage spatial de ces technologies.

La technologie Spatial Omics sur laquelle nous nous sommes concentrés pour le développement de cette méthode consiste en des tests de protéomique spatiale et de transcriptomique où les oligonucléotides sont attachés à des anticorps ou à des sondes à ARN via un liant photoclivable sensible aux UV. Les lames histologiques sont marquées avec ces anticorps ou sondes oligo-conjugués, puis imagées sur la plateforme de profilage spatial. Ensuite, des ROI de différentes tailles et formes sont sélectionnés pour l’éclairage, et les oligonucléotides photoclivés sont aspirés et collectés dans une plaque de 96 puits. Les oligonucléotides photoclivés sont préparés pour être quantifiés soit avec le système Nanostring nCounter, soit avec le séquençage de nouvelle génération (NGS)2,3 (Figure 1)4,5.

Les distributions cellulaires varient au sein des tissus, et la capacité de caractériser des emplacements spécifiques des cellules à l’aide de marqueurs sélectionnés et de différentes tailles de retour sur investissement est d’une grande importance pour bien comprendre l’environnement tissulaire et identifier des caractéristiques spécifiques. Dans la technologie Spatial Omics mentionnée ici, le protocole de visualisation standard utilise des anticorps directement conjugués et est un protocole manuel. Les marqueurs standard pour distinguer la tumeur du stroma sont la pancytokératine (panCK) et CD456,7, mais des marqueurs supplémentaires sont nécessaires pour cibler des populations cellulaires spécifiques d’intérêt. De plus, l’utilisation d’anticorps fluorescents directement conjugués manque d’amplification, ce qui limite la sélection des anticorps à des marqueurs abondants. De plus, les tests manuels sont soumis à plus de variabilité que les flux de travail automatisés8. Par conséquent, il est souhaitable de disposer d’un protocole de visualisation personnalisable, automatisé et amplifié pour la sélection du retour sur investissement.

Ici, l’étude démontre que, pour les tests de protéomique spatiale, la technologie TSA peut être utilisée pour les protocoles de visualisation sur une plate-forme automatisée, ce qui permet un test plus ciblé et standardisé. En outre, les tests basés sur la TSA permettent l’utilisation de marqueurs à faible expression, augmentant ainsi la gamme de cibles pouvant être sélectionnées pour la visualisation. Un test 3-plex pour panCK, FAP et anticorps X a été développé à l’aide d’une plate-forme automatisée où panCK et FAP ont été utilisés pour différencier la tumeur et le stroma, respectivement. L’anticorps X est une protéine stromale fréquemment rencontrée dans les tumeurs, mais sa biologie et son impact sur l’immunité antitumorale ne sont pas entièrement compris. La caractérisation de la contexture immunitaire dans les zones riches en anticorps X peut élucider son rôle dans l’immunité antitumorale et la réponse thérapeutique, ainsi que son potentiel en tant que cible médicamenteuse.

Bien que les panels de visualisation automatisés personnalisés de la TSA se soient avérés efficaces pour les tests de protéomique spatiale, l’application de ces tests pour les tests de transcriptomique spatiale n’a pas pu être confirmée. Cela est probablement dû aux réactifs et au protocole utilisés pour les protocoles de visualisation automatisés, qui semblent compromettre l’intégrité de l’ARN. Reconnaître qu’un protocole d’étiquetage automatisé pour les marqueurs de visualisation peut être utilisé pour les tests de protéomique spatiale, mais pas pour les tests de transcriptomique spatiale, fournit des conseils importants sur les conceptions de tests de la technologie Spatial Omics.

De plus, l’étude démontre que le test de transcriptomique spatiale peut être utilisé pour profiler des cibles dans des régions aussi petites que 50 μm de diamètre, soit environ 15 cellules. Deux ROI de tailles différentes ont été sélectionnés pour tester la capacité du test à détecter également les transcrits dans les petits ROI. Pour chaque région d’intérêt, des oligos correspondant à 1 800 cibles d’ARNm ont été collectés et transformés en bibliothèques selon le protocole de la plateforme de profilage spatial. Les bibliothèques ont été indexées individuellement, puis regroupées et séquencées. Cela a permis d’évaluer à la fois l’efficacité de la mise en commun et la capacité d’identifier des populations cellulaires spécifiques dans de petits retours sur investissement.

Cet article montre que pour les tests de protéomique spatiale, un protocole automatisé pour guider la sélection du retour sur investissement sur des marqueurs d’intérêt spécifiques peut être utilisé pour cibler sélectivement l’interrogation des zones tissulaires pertinentes et caractériser l’environnement spatial du tissu. De plus, nous démontrons que des retours sur investissement plus petits peuvent être utilisés pour les tests transcriptomiques spatiaux afin de détecter et de caractériser des populations cellulaires spécifiques.

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Protocol

Tous les tissus humains ont été acquis auprès de biobanques commerciales ou de banques de tissus accréditées sous garantie que l’approbation appropriée du comité d’examen institutionnel et le consentement éclairé ont été obtenus.

REMARQUE : Le protocole est exécuté à l’aide de Discovery Ultra et de GeoMx Digital Spatial Profiler. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur les réactifs, l’équipement et les logiciels utilisés dans ce protocole.

1. Protocole de visualisation automatisé pour les essais de protéomique spatiale

  1. Programmer l’autocoloration pour appliquer des anticorps de visualisation fluorescente
    1. Dans le logiciel autostainer, cliquez sur le bouton d’accueil et choisissez Protocoles. Ensuite, cliquez sur Créer / Modifier des protocoles et sélectionnez RUO DISCOVERY Universal comme procédure.
    2. Cliquez sur Première séquence > Déparaffinisation > Depar v2. Pour Température moyenne, choisissez 72 °C, puis cliquez sur Prétraitement et sélectionnez Conditionnement cellulaire et réservoir CC1. Pour Very High Temperature, choisissez 100 °C, puis cliquez sur CC1 8 min et continuez à cliquer jusqu’à ce que CC1 64 Min soit sélectionné.
    3. Cliquez sur Inhibiteur > Inhibiteur DISCOVERY, et pour Temps d’incubation, choisissez 8 minutes. Ensuite, cliquez sur Antibody > High Temp Ab Incubation; pour les basses températures, choisissez 37 ° C; pour Anticorps, choisissez le numéro d’anticorps sur l’étiquette du distributeur (Anticorps 6 dans cet exemple); pour Plus le temps d’incubation, sélectionnez 32 minutes.
      REMARQUE: Ce protocole a trois numéros d’anticorps différents. Le premier anticorps est la PAF, le second est la pancytokératine et le troisième est l’anticorps X.
    4. Cliquez sur Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, puis pour Antibody Blocking, choisissez Gt Ig Block, et pour Incubation Time, choisissez 4 minutes. Ensuite, sur Multimer HRP Reagent, sélectionnez OMap anti-Rb HRP, et pour Incubation Time (Temps d’incubation), choisissez 16 minutes (Temps d’incubation). Ensuite, cliquez sur Cy5, et pour Long temps d’incubation, choisissez 0 h 8 min.
    5. Cliquez sur Dual Sequence (Séquence double ) et choisissez Antibody Denaturation (Dénaturation des anticorps), puis sélectionnez Antibody Denature CC2-1, et pour Very High Temperature (Très haute température), choisissez 100 °C. Assurez-vous que le temps d’incubation est de 8 min. Ensuite, cliquez sur Inhibiteur de DS et sélectionnez Neutraliser.
    6. Cliquez sur Anticorps DS, et pour très basse température, choisissez 37 ° C. Ensuite, dans Anticorps, choisissez le numéro d’anticorps sur l’étiquette du distributeur (Anticorps 3 dans cet exemple), et pour Plus Incubation Time, sélectionnez 32 minutes.
    7. Cliquez sur DS Multimer HRP et choisissez DS Multimer HRP Blocker. Ensuite, pour Blocage des anticorps, sélectionnez Gt Ig Block, et pour Durée d’incubation, choisissez 4 minutes. Ensuite, sur Multimer HRP Reagent, sélectionnez OMap anti-Ms HRP, et pour Incubation Time, choisissez 16 minutes. Ensuite, cliquez sur DS Rhodamine 6G, et pour un long temps d’incubation, choisissez 0 h 8 min.
    8. Cliquez sur Triple Stain et sélectionnez TS Antibody Denaturation, puis sélectionnez Antibody Denature CC2-2, et pour Very High Temperature, sélectionnez 100 °C. Assurez-vous que le temps d’incubation est de 8 min. Ensuite, cliquez sur TS Inhibitor et sélectionnez TS Neutralize.
    9. Cliquez sur TS Antibody, et pour Very Low Temperature, sélectionnez 37 °C. Ensuite, dans Anticorps, sélectionnez le numéro d’anticorps sur l’étiquette du distributeur (Anticorps 7 dans cet exemple), et pour Plus Incubation Time, sélectionnez 32 minutes.
    10. Cliquez sur TS Multimer HRP et choisissez TS Multimer HRP Blocker. Ensuite, pour Blocage des anticorps, sélectionnez Gt Ig Block, et pour Durée d’incubation, choisissez 4 minutes. Ensuite, sur Multimer HRP Reagent, sélectionnez OMap anti-Rb HRP, et pour Incubation Time (Temps d’incubation), choisissez 16 minutes (Temps d’incubation). Ensuite, cliquez sur TS FAM, et pour Long Incubation Time, choisissez 0 Hr 8 Min.
    11. Ajoutez un titre au protocole. Sélectionnez un numéro de protocole, ajoutez un commentaire et cliquez sur Actif suivi de Enregistrer.
  2. Préparer des diapositives, imprimer des étiquettes et démarrer l’exécution de la coloration automatique
    1. Le vendeur de pâtisserie s’est procuré des coupes de tissus humains FFPE (fixées au formol, incorporées à la paraffine) dans un four réglé à 70 °C pendant 20 à 60 minutes. Pendant la cuisson des diapositives, imprimez les étiquettes en cliquant sur Créer une étiquette dans le logiciel de coloration automatique. Ensuite, cliquez sur Protocoles, sélectionnez le numéro de protocole, puis cliquez sur Fermer/Imprimer. Ajoutez les informations pertinentes sur l’étiquette de la diapositive et cliquez sur Imprimer.
    2. Retirez les lames du four et laissez-les refroidir à température ambiante (RT). Appliquez les étiquettes de protocole précédemment imprimées aux diapositives correspondantes.
    3. Charger les distributeurs d’anticorps rechargeables avec des anticorps conformément au numéro d’étiquette d’anticorps attribué à l’étape 1.1. Dans ce protocole, utilisez l’anticorps 6 pour la PAF à 1 μg/mL, utilisez l’anticorps 3 pour la pancytokératine à 0,1 μg/mL et utilisez l’anticorps 7 pour l’anticorps X à 2,5 μg/mL. Diluer chaque anticorps dans le diluant spécifié et amorcer les distributeurs d’anticorps rechargeables.
    4. Rassemblez les distributeurs de réactifs préremplis de blocage, de détection et d’amplification mentionnés ci-dessus et placez-les sur un plateau de réactifs. Chargez les diapositives dans les bacs de diapositives (jusqu’à 30 diapositives par exécution) et cliquez sur En cours d’exécution suivi de Oui. Notez que DAPI n’est pas utilisé pour la contre-coloration nucléaire.
    5. Confirmez le début de l’exécution en vérifiant la durée de l’exécution sur le logiciel autostainer. Le protocole prend ~11 h pour être complété et peut fonctionner pendant la nuit.
    6. Le lendemain, assurez-vous que la course est terminée en observant les voyants clignotants verts sur les fentes du plateau coulissant. Ensuite, retirez les lames de l’instrument et rincez-les vigoureusement dans 1x tampon de réaction jusqu’à ce que la solution liquide de couvercle soit complètement retirée.
  3. Protocole de plateforme de profilage spatial pour le test protéomique
    1. Suivez le protocole de protéomique spatiale indiqué dans la note ci-dessous. Incluez les modifications suivantes au protocole pour activer la procédure d’étiquetage automatique 3-plex.
    2. Effectuez les étapes 1.2.1-1.2.6 la veille du début du protocole de protéomique spatiale et passez directement à l’étape de récupération de l’antigène du protocole de protéomique spatiale après avoir effectué l’étape 1.2.6. Omettez la procédure de visualisation décrite dans le protocole de protéomique de profilage spatial.
    3. Remplacez SYTO 13 par SYTO 64 à 5000 nM pour permettre l’intégration des fluorophores. Diluer SYTO 64 dans 1x TBS et incuber dans une chambre d’humidité pendant 15 min.
    4. Lors de la configuration des paramètres de numérisation dans la plate-forme de profilage spatial, sélectionnez les filtres et les canaux de mise au point en fonction des fluorophores utilisés dans le panneau de visualisation pour permettre l’intégration 3-plex. Utilisez FITC pour DISCOVERY FAM et réglez l’exposition à 200 ms, utilisez Cy3 pour DISCOVERY Rhodamine 6G et réglez l’exposition à 200 ms, utilisez Texas Red pour SYTO 64 et réglez l’exposition à 50 ms (spécifiez ceci comme canal de mise au point), et enfin, utilisez Cy5 pour DISCOVERY Cy5, réglez l’exposition à 200 ms, et enregistrer les modifications.
      REMARQUE: Les instructions détaillées du protocole de protéomique de profilage spatial se trouvent sur l’onglet Support du site officiel en sélectionnant Documentation > Manuels de l’utilisateur. Ici, recherchez le protocole protéique pour nCounter en utilisant Bond RX.

2. Sélection du retour sur investissement pour les tests de transcriptomique spatiale

  1. Cuire les sections de granulés de cellules FFPE dans un four réglé à 70 °C pendant 20-60 min. Suivez le protocole NGS de la plate-forme de profilage spatial indiqué dans la note ci-dessous et numérisez les diapositives sur la plate-forme de profilage spatial, en sélectionnant des tailles de 50 μm et 300 μm. La recommandation suivante est mise en évidence pour le test de transcriptomique spatiale :
    1. Lors de la préparation de la bibliothèque, si différentes tailles de retour sur investissement ont été sélectionnées, regroupez des retours sur investissement de tailles similaires pour créer une bibliothèque par taille. Cela permet de s’assurer que des profondeurs de séquençage suffisantes sont atteintes pour tous les retours sur investissement sans biais de taille.
      REMARQUE: Les instructions détaillées de la plate-forme de profilage spatial se trouvent sur l’onglet Support du site officiel en sélectionnant Documentation > Manuels de l’utilisateur. Ici, recherchez le protocole ARN pour les applications NGS utilisant Bond RX.

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Representative Results

Protocole de visualisation automatisé pour guider la sélection du retour sur investissement
Dans cet article, nous présentons l’utilisation d’un protocole IF automatisé et personnalisé basé sur TSA pour visualiser le tissu et sélectionner des retours sur investissement spécifiques. L’élaboration d’un panel de visualisation utilisant le mélanome et la peau normale humaine comme tissus témoins consistait en des tests de stabilité des épitopes, un réglage fin de l’intensité des marqueurs et une évaluation des saignements par le biais de contrôles de non-utilisation. Pour tester si la stabilité des épitopes des anticorps est affectée par des étapes d’élution répétitives, les signaux FAP et Anticorps X ont été évalués qualitativement après marquage dans chaque position du 3-plex. Le signal d’anticorps X est resté constant dans toutes les positions, tandis que l’intensité du signal FAP a diminué après une élution (Figure 2). Des études internes antérieures ont montré que l’épitope panCK est stable tout au long d’un test 3-plex. Par conséquent, FAP a été choisi pour être en 1ère position dans le 3-plex, panCK a été placé dans le 2ème et l’anticorps X dans la 3èmeposition. Étant donné que le signal FAP était globalement plus faible que celui de l’anticorps X et du panCK, la FAP a été associée au fluorophore plus brillant, Cy5.

Le 3-plex automatisé a été optimisé avec des commandes de sortie de sortie, où chaque marqueur a été omis du protocole 3-plex une fois pour confirmer qu’il n’y avait pas de purge dans les canaux voisins (Figure 3).

Les fluorophores utilisés sur la plate-forme de coloration automatisée ont été testés sur la plate-forme de profilage spatial pour confirmer que les filtres sont compatibles avec les fluorophores TSA dans le panneau de visualisation 3-plex. Étant donné que le protocole 3-plex utilise FITC, Cy3 et Cy5, et que le canal DAPI est utilisé pour le clivage UV sur la plate-forme de profilage spatial, une contre-coloration nucléaire dans le canal Texas Red a dû être utilisée. Deux colorants nucléaires différents, SYTO 59 et SYTO 64, ont été testés, et les colorants ont montré un signal nucléaire distinct dans les tissus du côlon. Cependant, SYTO 59 affichait également un signal de purge dans le canal Cy5 alors que le canal Cy5 était propre lors de l’utilisation de SYTO 64 (Figure 4). Par conséquent, SYTO 64 était le choix préféré pour la détection nucléaire.

D’autres tests de SYTO 64 ont montré que ce colorant n’était pas phototable et photoblanchi rapidement pendant l’imagerie. Une fois le signal blanchi, le système d’imagerie se concentre sur l’arrière-plan, ce qui pourrait être interprété comme un signal non spécifique (Figure 5). L’augmentation de la concentration du colorant nucléaire pour augmenter l’intensité du signal a permis de minimiser ce problème.

Les tissus marqués avec le protocole de visualisation manuelle panCK/CD45, qui utilise des anticorps directement conjugués, ont été comparés aux tissus marqués avec le protocole de visualisation personnalisée automatisé panCK/FAP/Antibody X. Les deux protocoles partagent panCK comme marqueur commun, et le signal était comparable entre les deux protocoles (Figure 6).

Pour nous assurer qu’un protocole de visualisation modifié n’a pas d’impact sur le test de protéomique spatiale en amont, nous avons comparé les valeurs de comptage obtenues après la collecte de la plate-forme de profilage spatial et le traitement de la plate-forme de comptage lors de l’utilisation du protocole de visualisation manuelle panCK/CD45. Cela utilise des anticorps directement conjugués ou le protocole de visualisation personnalisé automatisé 3-plex, qui utilise TSA. Quatre tissus du cancer colorectal (CCR) ont été marqués avec le protocole de visualisation manuelle panCK/CD45 ou le protocole de visualisation personnalisée automatisé 3-plex en combinaison avec le test de protéomique spatiale. Des RCI similaires ont été choisis pour chaque protocole, et les données de comptage des ROI correspondants ont été comparées à l’aide de la normalisation de l’entretien pour S6 et Histone. Des tendances similaires ont été observées entre ces RCI, comme le montre la carte thermique log2 (figure 7A), avec une valeur R de Spearman de 0,88 pour tous les marqueurs inclus dans le test de protéomique spatiale (figure 7B). Sur les 31 anticorps utilisés dans les essais, 23 anticorps avaient une valeur Spearman R supérieure ou égale à 0,5.

Comme la protéomique spatiale et les protocoles transcriptomiques diffèrent, nous avons évalué si le protocole de visualisation automatisé pouvait également être appliqué aux tests de transcriptomique spatiale. Le protocole de visualisation automatisé exige que le test IHC soit effectué avant la détection de l’ARN, tandis que le protocole manuel original détecte d’abord l’ARN avant d’appliquer le protocole de visualisation. Le protocole de visualisation automatisé 3-plex a été testé côte à côte avec le protocole de visualisation manuelle CK/CD45 en combinaison avec le test de transcriptomique spatiale. Les données de séquençage pour le protocole de visualisation automatisé 3-plex Le dénombrement du quartile 3 (Q3), normalisées sur le logiciel de profilage spatial, présentaient des valeurs inférieures à celles du protocole de visualisation manuelle CK/CD45 (figure 8A), ce qui est également reflété par les faibles valeurs R de Spearman de 0,15 (figure 8B). De plus, une perte de plage dynamique a été observée lors de l’utilisation du protocole automatisé de visualisation 3-plex (Figure 8C).

Cette perte de numération avec le protocole de visualisation automatisé indique que ce protocole compromet l’intégrité de l’ARN et que la détection de l’ARN avant d’effectuer le test de visualisation est nécessaire pour conserver la qualité de l’ARN. Étant donné que ce panneau de visualisation automatisé nécessite que la partie protéique soit effectuée avant la détection de l’ARN, ce protocole ne convient pas aux tests d’ARN.

Taille de la sélection du retour sur investissement dans les tests de transcriptomique spatiale
Pour mieux comprendre l’impact de la taille du retour sur investissement sur la production de données d’ARN, les comptes d’ARN de différentes tailles de retour sur investissement ont été comparés. Le test de transcriptomique spatiale a été réalisé sur des lignées cellulaires SUDHL1 et JURKAT afin de minimiser les différences inhérentes aux tissus. Des ROI circulaires de 50 μm et 300 μm de diamètre ont été sélectionnés et comparés les uns aux autres à l’aide de la normalisation Q3 sur le logiciel de profilage spatial. Le nombre d’ARN pour des cibles sélectionnées sur différentes lignées cellulaires était comparable entre les deux tailles de retour sur investissement après normalisation (Figure 9A,B).

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail de profilage spatial numérique. (A) Les lames sont marquées avec des anticorps (test de protéomique spatiale) ou des sondes (test de transcriptomique spatiale) ainsi que des marqueurs de visualisation. (B) Les diapositives sont placées sur la plate-forme de profilage spatial pour imager et sélectionner les ROI. (C) Les oligos sont clivés par la lumière UV et collectés dans une plaque de 96 puits. Ce processus est répété pour chaque retour sur investissement sélectionné. (D) Les échantillons sont traités et les données sont générées à l’aide de la plate-forme de comptage ou d’un séquenceur. Ce chiffre a été modifié à partir du site Web de Nanostring technologies 4,5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Stabilité de l’épitope. (A-C) Anticorps X et (D-F) FAP testés sur la peau humaine normale et le mélanome, respectivement. Chaque marqueur dans la (A,D) 1ère, (B,E) 2ème, et (C,F) 3èmeposition d’un 3-plex. L’anticorps X est stable dans toutes les positions, tandis que (D) FAP montre une intensité de signalisation décroissante après (E-F) une et deux élutions, respectivement. Anticorps X en vert, FAP en rouge, DAPI en gris. Les barres d’échelle sont à 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Laissez de côté les commandes pour le protocole de visualisation personnalisé automatisé 3-plex sur les tissus du pancréas humain. Pour toutes les images, l’anticorps X est représenté en vert, panCK en cyan et FAP en rouge. La première rangée montre les canaux (A) 3-plex et simples pour (B) l’anticorps X dans FITC, (C) panCK dans Cy3 et (D) FAP dans Cy5. La deuxième rangée montre le contrôle de sortie 3-plex pour (E) l’anticorps X et (F-H) les canaux simples pour chaque marqueur. La troisième rangée montre le contrôle de sortie 3-plex pour (I) panCK et (J-L) les canaux simples pour chaque marqueur. La quatrième ligne montre le contrôle de sortie 3-plex pour (M) FAP et (N-P) les canaux simples pour chaque marqueur. Aucun saignement n’a été observé dans aucun des témoins de sortie comme l’indique l’absence de signal dans les canaux correspondants lors du test (F) sans FAP, (K) sans panCK et (P) sans anticorps X. Les barres d’échelle sont à 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Test de colorant SYTO. Le canal Texas Red affiche le signal nucléaire en Colon pour (A) SYTO 59 avec un saignement dans le canal (B) Cy5 (rouge). Le canal Texas Red montre le signal nucléaire en Colon pour (D) SYTO 64 sans purge dans le canal (E) Cy5. Les canaux Texas Red et Cy5 en Colon affichés ensemble pour montrer (C) le saignement de SYTO 59 et (F) aucun saignement pour SYTO 64. Les barres d’échelle sont à 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Photostabilité du SYTO 64. Échantillons du côlon marqués avec SYTO 64 (A) avant et (B) après photoblanchiment. L’image B montre le signal non spécifique qui devient plus visible après la perte du signal nucléaire. Les barres d’échelle sont à 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Comparaison du marquage panCK. signal panCK sur des échantillons de cancer colorectal (CRC) avec (A) le protocole de visualisation manuelle panCK/CD45 et (B) le protocole de visualisation automatisée panCK/FAP/Antibody X. Aucune différence dans le signal panCK n’a été observée entre les deux protocoles. Les barres d’échelle sont à 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Comparaison des valeurs de comptage pour le test de protéomique spatiale à l’aide de deux protocoles de visualisation différents sur des RCI similaires de quatre tissus CRC. (A) Carte thermique logarithmique 2 de tous les marqueurs inclus dans l’essai de protéomique spatiale comparant le protocole manuel panCK/CD45 (noir) au protocole 3-plex automatisé (gris). (B) La corrélation de Spearman logarithmique 2 pour tous les marqueurs présente une valeur R de 0,88. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide du logiciel GraphPad Prism 7 ou du langage de programmation Python. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Comparaison des valeurs de comptage pour l’essai de transcriptomique spatiale à l’aide de deux protocoles de visualisation différents. (A) Carte thermique logarithmique 2 des cibles sélectionnées incluses dans l’essai de transcriptomique spatiale comparant le protocole manuel panCK/CD45 (noir) au protocole automatisé 3-plex (gris). (B) La corrélation de Spearman logarithmique 2 pour tous les marqueurs présente une valeur R de 0,15. (C) La moyenne (bleu) et l’écart-type où la plage dynamique est perdue dans le protocole automatisé 3-plex. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide du logiciel GraphPad Prism 7 ou du langage de programmation Python. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Comparaison des valeurs de numération de l’ARN pour le test de transcriptomique spatiale sur pastilles cellulaires. Des résultats comparables ont été observés pour des ROI de 50 μm (noir) et 300 μm (gris) de diamètre pour des cibles sélectionnées sur des lignées cellulaires SUDHL1 et (B) JURKAT. Aucune différence significative n’a été observée en utilisant le test t. Moyenne et écart-type indiqués pour n = 3 ROI par taille. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide du logiciel GraphPad Prism 7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

À ce jour, les anticorps fluorescents directement conjugués dans un protocole manuel sont le plus souvent utilisés comme panneaux de visualisation pour la protéomique spatiale ou les tests de transcriptomiquespatiale 9,10. Cependant, l’utilisation d’anticorps fluorescents directement conjugués peut être difficile pour les marqueurs moins abondants, ce qui limite la sélection d’anticorps appropriés. Ce protocole montre que l’étiquetage des marqueurs de visualisation peut être automatisé sur une plate-forme de coloration automatisée utilisant les technologies TSA pour prendre en charge les tests de protéomique spatiale. Cela permet une plus grande flexibilité dans la personnalisation des panneaux de visualisation, ce qui permet une sélection plus ciblée du retour sur investissement et l’acquisition de données biologiques pertinentes à partir de zones spécifiques d’un tissu. La technologie TSA permet également de visualiser des marqueurs de faible abondance et augmente ainsi le nombre d’anticorps potentiels appropriés. De plus, l’automatisation du protocole de visualisation garantit la reproductibilité et la qualité de la procédure d’étiquetage.

La mise au point d’un test IF 3-plex nécessite une évaluation minutieuse de l’intensité du signal marqueur/fluorophore sur les tissus témoins appropriés. Il est recommandé de titrer les concentrations d’anticorps pour obtenir le meilleur rapport signal sur bruit, ce qui aidera à minimiser les saignements dans les canaux adjacents. De plus, la stabilité de l’épitope pour chaque marqueur d’intérêt doit être testée pour s’assurer que l’épitope n’est pas affecté par des étapes d’élution répétées. Une fois que l’ordre des anticorps dans le panel est confirmé, le test doit être affiné à l’aide de témoins de non-réponse. Ici, un marqueur spécifique est omis dans le panneau et le canal correspondant dans l’image acquise est examiné pour le fond perdu et la diaphonie.

Il a été montré ici que les tests basés sur la TSA peuvent être imagés sur la plate-forme de profilage spatial et que des alternatives DAPI doivent être utilisées pour la coloration nucléaire. Nous avons testé les colorants SYTO et déterminé que lorsque nous décidons du colorant SYTO à utiliser, le signal doit être soigneusement évalué pour éviter de saigner dans les canaux adjacents. Une autre limitation de l’utilisation des colorants SYTO est que certains colorants SYTO photoblanchissent plus rapidement, tels que SYTO 64 et SYTO 83 (données internes), ce qui pourrait affecter la quantification nucléaire. Par conséquent, l’exposition à la lumière des lames colorées doit être évitée autant que possible. D’autres groupes ont montré l’utilisation de SYTO 1311,12, qui est plus photostable (données internes) et pourrait être utilisé dans un panel tant que les marqueurs d’intérêt sont attribués aux fluorophores compatibles avec le colorant nucléaire de choix.

Bien que les tests fluorescents automatisés basés sur la TSA aient bien fonctionné pour la visualisation en combinaison avec les tests de protéomique spatiale, il a été déterminé ici que la combinaison d’un protocole de visualisation automatisé 3-plex avec un protocole de transcriptomique spatiale entraînait une perte de plage dynamique, ce qui pourrait être dû aux conditions de protocole plus sévères de l’ajout d’étapes supplémentaires de récupération / élution d’antigènes qui pourraient affecter l’intégrité de l’ARN. Par conséquent, le protocole de visualisation automatisé 3-plex ne devrait être adapté que pour les tests protéomiques, ce qui est une limitation et nécessite des approches de visualisation alternatives pour les tests basés sur l’ARN. Comme alternative à la visualisation de même diapositive, les sections de série colorées avec des marqueurs d’intérêt pourraient être superposées pour faciliter la sélection du retour sur investissement13. De plus, la littérature décrit l’utilisation de l’hybridation in situ sur des lames adjacentes pour guider la sélection du retour sur investissement14. Cependant, ces approches pourraient être limitées par la disponibilité des tissus, la variabilité d’une section à l’autre et les enregistrements de cellule à cellule.

Nous avons également testé la facilité d’utilisation de différentes tailles de retour sur investissement pour les tests de transcriptomique spatiale. L’utilisation de petits ROI de 50 μm permet au chercheur d’acquérir des données de régions spécifiques permettant une lecture plus détaillée de cellules ou de zones d’intérêt sélectionnées. Les limites de la sélection de petits retours sur investissement sont que le nombre de cellules présentes peut ne pas être assez abondant pour obtenir des valeurs de comptage qui peuvent être distinguées de l’arrière-plan. Une option consiste à sélectionner des populations de cellules pures pour capturer des cibles moins abondantes. Cependant, la sélection du retour sur investissement pour les cellules individuelles est limitée par un rapport signal sur bruit élevé15. En outre, il est important de prendre en compte les tailles de retour sur investissement pour la préparation de la bibliothèque si des retours sur investissement de différentes tailles sont collectés dans une seule expérience. Si les tailles de retour sur investissement diffèrent considérablement, il peut être avantageux de regrouper les retours sur investissement en fonction de leurs tailles et de construire des bibliothèques distinctes pour éviter que les retours sur investissement importants ne soient surreprésentés dans une bibliothèque. Cela garantira également que chaque retour sur investissement bénéficiera d’une couverture de séquençage suffisante en fonction de sa taille.

D’autres facteurs à prendre en compte lors de la réalisation d’expériences Spatial Omics sont que les données pourraient montrer des variations dues à la variabilité d’une diapositive à l’autre, et une expression plus faible de certaines cibles peut faire apparaître le contexte et les différences dans les valeurs de corrélation. Des contrôles adéquats et des approches de normalisation doivent être envisagés lors de la planification des expériences et de l’évaluation des données. Pour les tests de protéomique spatiale sur nCounter, la normalisation des objectifs d’entretien ou des IgG de contrôle négatif sont les méthodes préférées selon l’expérience interne et les recommandations des fournisseurs où la corrélation entre les objectifs d’entretien ou les IgG témoins négatifs doit être évaluée16. Cependant, en fonction des tissus utilisés, la meilleure normalisation doit être définie pour chaque étude17,18. Par exemple, la littérature indique que pour les études spatiales omiques sur le cancer du sein, GAPDH, qui est couramment utilisé pour normaliser les objectifs d’entretien, a été moins concordant que S6 et Histone19. Par conséquent, S6 et Histone ont été les cibles d’entretien recommandées pour la normalisation dans les tissus cancéreux du sein19.

Pour les tests de transcriptomique spatiale, les stratégies de normalisation doivent être définies en fonction de la conception de l’étude (p. ex., les types de tissus et la sélection du retour sur investissement). Certaines stratégies utilisées dans le séquençage de l’ARN, telles que la normalisation du quartile supérieur ou de la moyenne tronquée des valeurs M (TMM), pourraient être appliquées pour normaliser les données séquencées19,20.

Les tests de transcriptomique spatiale fournissent des informations sur des milliers de cibles et sont de plus en plus couramment utilisés pour explorer l’ensemble du transcriptome, où des compartiments TME spécifiques sont sélectionnés et analysés en conjonction avec le séquençage de l’ARN20 à noyau unique ou de l’ARN unicellulaire21. Nous avons démontré que les protocoles de visualisation pour guider la sélection du retour sur investissement afin d’évaluer la distribution spatiale des cibles pouvaient être automatisés pour les tests de protéomique spatiale, mais pas pour les tests de transcriptomique spatiale. De plus, nous présentons que des ROI aussi petits que 50 μm peuvent être sélectionnés pour permettre une étude plus approfondie d’une région tissulaire particulière. Les applications futures de cette technologie amélioreront la compréhension du microenvironnement tumoral.

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Disclosures

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan et Sandra Rost sont des employées et actionnaires de Genentech, membre du groupe Roche. D’autres sociétés qui font partie de Roche produisent des réactifs et des instruments utilisés dans ce manuscrit. Ciara Martin est une employée à temps plein de NanoString Technologies Inc, qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans ce manuscrit.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Thomas Wu pour le traitement des fichiers NGS. Nous remercions James Ziai pour les discussions sur les résultats et la révision des manuscrits, ainsi que Meredith Triplet et Rachel Taylor pour la révision interne du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris buffered saline (TBS) Cell Signaling Technologies 12498S Diluted to 1x TBS in DEPC treated water
Antibody X (not disclosed) antibody blinded due to confidentiality
DEPC-treated water ThermoFisher AM9922 Another can be used
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) Ventana 950-500
DISCOVERY Cy5 Kit Ventana 760-238 Referred as Cy5
DISCOVERY FAM Kit Ventana 760-243 Referred as FAM
DISCOVERY Goat Ig Block Ventana 760-6008 Referred as Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP Ventana 760-4310 Referred as OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP Ventana 760-4311 Referred as OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G Kit Ventana 760-244 Referred as Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System Ventana 05 987 750 001 / N750-DISU-FS Referred as autostainer on the manuscript
FAP [EPR20021] Antibody Abcam Ab207178
GeoMx Digital Spatial Profiler NanoString GMX-DSP-1Y Referred as spatial profiling platform on the manuscript
Humidity chamber Simport M920-2 Another can be used
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody Abcam Ab27988
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Python Python Statistical analysis
Reaction Buffer (10x) Ventana 950-300
Statistical analysis software GraphPad Prism 7 Statistical analysis
SYTO 64 ThermoFisher S11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana 950-223
Ventana Antibody Diluent with Casein Ventana 760-219 Referred as specified diluent on the manuscript
Ventana Primary antibody dispenser Ventana Catalog number depends on dispenser number

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References

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Cancer Research numéro 185 multiplexage ARN protéine cibles automatisation ROI visualisation anticorps sondes protéomique transcriptomique
Profilage spatial de l’expression des protéines et de l’ARN dans les tissus : une approche pour affiner la microdissection virtuelle
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Ibarra-Lopez, V., Jayakar, S., Yang, Y. A., Martin, C., Modrusan, Z., Rost, S. Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection. J. Vis. Exp. (185), e62651, doi:10.3791/62651 (2022).

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