Summary
Burada, tümör mikro ortamını daha iyi karakterize etmek ve spesifik hücre popülasyonlarını tanımlamak için Spatial Omics teknolojileri için ilgi çekici bölgelere (ROI'ler) ince ayar yapmak için bir protokol açıklıyoruz. Proteomik testler için, otomatik özelleştirilmiş protokoller ROI seçimine rehberlik edebilirken, transkriptomik tahliller 50 μm kadar küçük ROI'ler kullanılarak ince ayarlanabilir.
Abstract
Çoklama, uzamsal bağlam sağlarken aynı doku üzerindeki birkaç belirtecin değerlendirilmesini sağlar. Uzamsal Omik teknolojileri, sırasıyla foto-bölünebilir oligo etiketli antikorlardan ve problardan yararlanarak hem protein hem de RNA çoklamasına izin verir. Oligolar, altta yatan biyolojiyi aydınlatmak için doku boyunca belirli bölgelerden ayrılır ve nicelleştirilir. Burada, çalışma, mekansal proteomik tahlillerle birlikte ROI seçimini yönlendirmek için otomatik özel antikor görselleştirme protokollerinin kullanılabileceğini göstermektedir. Bu spesifik yöntem, uzamsal transkriptomik tahlillerle kabul edilebilir bir performans göstermedi. Protokol, belirli bir protein hedefinden floresan sinyalini yükseltmek ve aralarından seçim yapabileceğiniz antikor havuzunu artırmak için tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) kullanarak, otomatik bir platformda belirteç görselleştirmesi için 3 pleks immünofloresan (IF) testinin geliştirilmesini açıklamaktadır. Görselleştirme protokolü, kalite ve tekrarlanabilirliği sağlamak için tamamen doğrulanmış bir 3-plex testi kullanılarak otomatikleştirildi. Ek olarak, DAPI'nin SYTO boyaları ile değişimi, mekansal profilleme platformunda TSA tabanlı IF tahlillerinin görüntülenmesine izin vermek için değerlendirilmiştir. Ek olarak, son derece spesifik ilgi alanlarının (örneğin, belirli bir hücre tipi için zenginleştirilmiş alanlar) araştırılmasına izin vermek için mekansal transkriptomik tahlilini kullanarak küçük ROI'leri seçme yeteneğini test ettik. Sırasıyla yaklaşık 15 hücre ve 100 hücreye karşılık gelen 50 μm ve 300 μm çapındaki ROI'ler toplandı. Örnekler kütüphaneler halinde yapıldı ve küçük ROI'lerden ve dokunun profile özgü bölgelerinden gelen sinyalleri tespit etme yeteneğini araştırmak için sıralandı. Uzamsal proteomik teknolojilerinin, yatırım getirisi seçimine rehberlik etmek için otomatik, standartlaştırılmış protokollerden yüksek oranda yararlandığını belirledik. Bu otomatik görselleştirme protokolü uzamsal transkriptomik tahlillerle uyumlu olmasa da, standart manuel görselleştirme protokolü ile belirli hücre popülasyonlarının küçük ROI'lerde bile başarıyla tespit edilebileceğini test edebildik ve doğrulayabildik.
Introduction
Çoklama tekniklerindeki ilerlemeler, tümörlerde mevcut hedefler için daha iyi karakterizasyon araçları sağlamaya devam etmektedir. Tümör mikroçevresi (TME), immün hücrelere sızan tümör hücreleri ve stromadan oluşan karmaşık bir sistemdir ve mekansal bilginin, ilgilenilen biyobelirteçler arasındaki etkileşim mekanizmalarını daha iyi anlamak ve yorumlamak için kritik öneme sahip olduğu1. GeoMx Dijital Uzamsal Profil Oluşturucu (DSP) ve 10x Visium gibi gelişmekte olan tekniklerle, birden fazla hedef uzamsal bağlamlarında aynı anda tespit edilebilir ve ölçülebilir. Doku görselleştirmeyi kolaylaştıran immünofloresan protokollerinin kullanılması, bu teknolojilerin mekansal profilleme yeteneklerini daha da geliştirebilir.
Bu yöntem geliştirme için odaklandığımız Uzamsal Omik teknolojisi, oligonükleotidlerin UV'ye duyarlı bir fotobölünebilir bağlayıcı aracılığıyla antikorlara veya RNA problarına bağlandığı mekansal proteomik ve transkriptomik tahlillerden oluşur. Histolojik slaytlar bu oligo konjuge antikorlar veya problarla etiketlenir ve daha sonra uzamsal profil oluşturma platformunda görüntülenir. Daha sonra, aydınlatma için farklı boyut ve şekillerde ROI'ler seçilir ve fotokparçalanmış oligonükleotidler aspire edilir ve 96 delikli bir plakada toplanır. Fotoyarıklanmış oligonükleotidler, Nanostring nCounter sistemi veya Yeni Nesil Dizileme (NGS)2,3 (Şekil 1)4,5 ile ölçülmek üzere hazırlanmıştır.
Hücre dağılımları dokular içinde değişir ve seçilen belirteçleri ve farklı ROI boyutlarını kullanarak hücrelerin belirli yerlerini karakterize etme yeteneği, doku ortamını tam olarak anlamak ve belirli özellikleri tanımlamak için büyük önem taşır. Burada bahsedilen Uzamsal Omik teknolojisinde, standart görselleştirme protokolü doğrudan konjuge antikorlar kullanır ve manuel bir protokoldür. Tümör ve stroma arasında ayrım yapmak için standart belirteçler panSitokeratin (panCK) ve CD45 6,7'dir, ancak ilgilenilen spesifik hücre popülasyonlarını hedeflemek için ek belirteçler gereklidir. Ayrıca, doğrudan konjuge floresan antikorların kullanımı, antikor seçimini bol miktarda belirteçle sınırlayan amplifikasyondan yoksundur. Ek olarak, manuel analizler otomatik iş akışlarından daha fazla değişkenliğe tabidir8. Bu nedenle, yatırım getirisi seçimi için özelleştirilebilir, otomatikleştirilmiş ve güçlendirilmiş bir görselleştirme protokolüne sahip olmak istenir.
Burada, çalışma, mekansal proteomik tahliller için, TSA teknolojisinin otomatik bir platformda görselleştirme protokolleri için kullanılabileceğini ve bunun sonucunda daha hedefli ve standartlaştırılmış bir tahlil ile sonuçlanabileceğini göstermektedir. Ek olarak, TSA tabanlı analizler, görselleştirme için seçilebilecek hedef aralığını artırarak düşük ifade eden belirteçlerin kullanılmasını sağlar. PanCK, FAP ve Antikor X için 3 pleks testi, sırasıyla tümör ve stroma arasında ayrım yapmak için panCK ve FAP'ın kullanıldığı otomatik bir platform kullanılarak geliştirilmiştir. Antikor X, tümörlerde sıklıkla karşılaşılan stromal bir proteindir, ancak biyolojisi ve anti-tümör bağışıklığı üzerindeki etkisi tam olarak anlaşılamamıştır. Antikor X bakımından zengin alanlarda immün bağlamın karakterize edilmesi, anti-tümör bağışıklığı ve terapötik yanıttaki rolünü ve ayrıca bir ilaç hedefi olarak potansiyelini açıklığa kavuşturabilir.
Özelleştirilmiş otomatik TSA görselleştirme panellerinin mekansal proteomik tahliller için başarılı olduğu kanıtlanırken, bu testlerin mekansal transkriptomik tahliller için uygulanması doğrulanamamıştır. Bu büyük olasılıkla, RNA bütünlüğünü tehlikeye atıyor gibi görünen reaktifler ve otomatik görselleştirme protokolleri için kullanılan protokolden kaynaklanmaktadır. Görselleştirme belirteçleri için otomatik bir etiketleme protokolünün uzamsal proteomik tahliller için kullanılabileceğini, ancak mekansal transkriptomik tahlilleri için kullanılamayacağını kabul etmek, Uzamsal Omik teknolojisi tahlil tasarımları hakkında önemli bir rehberlik sağlar.
Ek olarak, çalışma, uzamsal transkriptomik testinin, çapı 50 μm kadar küçük olan bölgelerdeki veya yaklaşık 15 hücredeki hedeflerin profilini çıkarmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Tahlilin küçük yatırım getirilerindeki transkriptleri de tespit etme yeteneğini test etmek için iki farklı boyutlu yatırım getirisi seçildi. İlgilenilen her bölge için, 1.800 mRNA hedefine karşılık gelen oligolar toplandı ve mekansal profilleme platformu protokolüne göre kütüphaneler haline getirildi. Kütüphaneler ayrı ayrı dizine eklendi, daha sonra havuza alındı ve sıralandı. Bu, hem havuzlama verimliliğinin hem de küçük ROI'lerde spesifik hücre popülasyonlarını tanımlama yeteneğinin değerlendirilmesine izin verdi.
Bu makale, uzamsal proteomik tahliller için, ilgili doku alanlarının sorgulanmasını seçici olarak hedeflemek ve dokunun mekansal ortamını karakterize etmek için belirli belirteçler üzerinde ROI seçimine rehberlik etmek için otomatik bir protokolün kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, spesifik hücre popülasyonlarını tespit etmek ve karakterize etmek için mekansal transkriptomik testler için daha küçük ROI'lerin kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm insan dokuları, ticari biyobankalardan veya akredite doku bankalarından, uygun Kurumsal İnceleme Kurulu onayı ve bilgilendirilmiş onam alındığı garantisi altında edinilmiştir.
NOT: Protokol, Discovery Ultra ve GeoMx Dijital Uzamsal Profil Oluşturucu kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokolde kullanılan reaktifler, ekipman ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Uzamsal proteomik testler için otomatik görselleştirme protokolü
- Floresan görselleştirme antikorlarını uygulamak için otomatik boyayı programlayın
- Otomatik boyama yazılımında, ana sayfa düğmesine tıklayın ve Protokoller'i seçin. Ardından, Protokoller Oluştur/Düzenle'ye tıklayın ve prosedür olarak RUO DISCOVERY Universal'ı seçin.
- Depar v2'> Birinci Sıra > Deparafinizasyon'a tıklayın. Orta Sıcaklık için 72 ° C'yi seçin, ardından Ön İşlem'e tıklayın ve Hücre Koşullandırma ve CC1 Rezervuarı'nı seçin. Çok Yüksek Sıcaklık için 100 ° C'yi seçin, ardından CC1 8 Dk'ya tıklayın ve CC1 64 Min seçilene kadar tıklamaya devam edin.
- İnhibitör > DISCOVERY İnhibitörü'ne tıklayın ve Kuluçka süresi için 8 Dakika'yı seçin. Ardından, Yüksek Sıcaklık Ab İnkübasyonu > Antikor'a tıklayın; Düşük Sıcaklık için 37 ° C'yi seçin; Antikor için, dağıtıcı etiketinden antikor numarasını seçin (bu örnekte Antikor 6); Artı Kuluçka Süresi için 32 Dakika'yı seçin.
NOT: Bu protokolün üç farklı antikor numarası vardır. İlk antikor FAP, ikincisi Pan-Sitokeratin ve üçüncüsü Antikor X'tir. - Multimer HRP > Multimer HRP Bloker'a tıklayın, ardından Antikor Blokajı için Gt Ig Bloğu'nu seçin ve Kuluçka Süresi için 4 Dakika'yı seçin. Ardından, Multimer HRP Reaktifi'nde OMap anti-Rb HRP'yi seçin ve Kuluçka Süresi için 16 Dakika'yı seçin. Ardından, Cy5'e tıklayın ve Uzun Kuluçka Süresi için 0 Saat 8 Dakika'yı seçin.
- Çift Sıralı'ya tıklayın ve Antikor Denatürasyonu'nu seçin, ardından Antikor Denatürasyonu CC2-1'i seçin ve Çok Yüksek Sıcaklık için 100 ° C'yi seçin. Kuluçka süresinin 8 dakika olduğundan emin olun. Ardından, DS İnhibitörü'ne tıklayın ve Nötralize Et'i seçin.
- DS Antikoru'na tıklayın ve Çok Düşük Sıcaklık için 37 ° C'yi seçin. Ardından, Antikor'da, dağıtıcı etiketinden (bu örnekte Antikor 3) antikor numarasını seçin ve Artı Kuluçka Süresi için 32 Dakika'yı seçin.
- DS Multimer HRP'ye tıklayın ve DS Multimer HRP Engelleyici'yi seçin. Ardından, Antikor Bloke Etme için Gt Ig Bloğu'nu seçin ve Kuluçka Süresi için 4 Dakika'yı seçin. Ardından, Multimer HRP Reaktifi'nde OMap anti-Ms HRP'yi seçin ve Kuluçka Süresi için 16 Dakika'yı seçin. Ardından, DS Rhodamine 6G'ye tıklayın ve Uzun Kuluçka Süresi için 0 Saat 8 Dakika'yı seçin.
- Üçlü Leke'ye tıklayın ve TS Antikor Denatürasyonu'nu seçin, ardından Antikor Denatürasyonu CC2-2'yi seçin ve Çok Yüksek Sıcaklık için 100 ° C'yi seçin. Kuluçka süresinin 8 dakika olduğundan emin olun. Ardından, TS İnhibitörü'ne tıklayın ve TS Nötralize Et'i seçin.
- TS Antikoru'na tıklayın ve Çok Düşük Sıcaklık için 37 ° C'yi seçin. Ardından, Antikor'da, dağıtıcı etiketinden (bu örnekte Antikor 7) antikor numarasını seçin ve Artı Kuluçka Süresi için 32 Dakika'yı seçin.
- TS Multimer HRP'ye tıklayın ve TS Multimer HRP Engelleyici'yi seçin. Ardından, Antikor Bloke Etme için Gt Ig Bloğu'nu seçin ve Kuluçka Süresi için 4 Dakika'yı seçin. Ardından, Multimer HRP Reaktifi'nde OMap anti-Rb HRP'yi seçin ve Kuluçka Süresi için 16 Dakika'yı seçin. Ardından, TS FAM'a tıklayın ve Uzun Kuluçka Süresi için 0 Saat 8 Dakika'yı seçin.
- Protokole bir başlık ekleyin. Bir protokol numarası seçin, bir yorum ekleyin ve Etkin'e ve ardından Kaydet'e tıklayın.
- Slaytları hazırlama, etiketleri yazdırma ve otomatik boyama çalıştırmayı başlatma
- Fırın satıcısı, FFPE (Formalin sabit, parafin gömülü) insan dokusu kesitlerini 20-60 dakika boyunca 70 ° C'ye ayarlanmış bir fırında tedarik etti. Slaytlar pişirilirken, otomatik boyama yazılımında Etiket Oluştur'u tıklatarak etiketleri yazdırın. Ardından, Protokoller'e tıklayın, protokol numarasını seçin ve Kapat / Yazdır'a tıklayın. Slayt etiketine ilgili bilgileri ekleyin ve Yazdır'a tıklayın.
- Kızakları fırından çıkarın ve oda sıcaklığına (RT) soğumaya bırakın. Önceden yazdırılmış protokol etiketlerini ilgili slaytlara uygulayın.
- Yeniden doldurulabilir antikor dağıtıcılarını, adım 1.1'de atanan antikor etiket numarasına göre antikorlarla yükleyin. Bu protokolde, 1 μg / mL'de FAP için Antikor 6, 0.1 μg / mL'de Pan-Sitokeratin için Antikor 3 kullanın ve 2.5 μg / mL'de Antikor X için Antikor 7 kullanın. Her bir antikoru belirtilen seyrelticide seyreltin ve yeniden doldurulabilir antikor dağıtıcılarını astarlayın.
- Yukarıda belirtilen blokaj, algılama ve amplifikasyon önceden doldurulmuş reaktif dağıtıcılarını toplayın ve bunları bir reaktif tepsisine yerleştirin. Slayt tepsilerine slaytları yükleyin (çalıştırma başına en fazla 30 slayt) ve Çalışıyor'a ve ardından Evet'e tıklayın. DAPI'nin nükleer karşı boyama için kullanılmadığını unutmayın.
- Otomatik boyama yazılımındaki çalışma süresini kontrol ederek çalıştırmanın başlangıcını onaylayın. Protokolün tamamlanması ~ 11 saat sürer ve gece boyunca çalışabilir.
- Ertesi gün, slayt tepsisi yuvalarındaki yeşil yanıp sönen ışıkları gözlemleyerek çalıştırmanın tamamlanmasını sağlayın. Ardından, kızakları cihazdan çıkarın ve sıvı kapak kayma çözeltisi tamamen çıkarılana kadar slaytları 1x Reaksiyon Tamponunda kuvvetlice durulayın.
- Proteomik tahlil için mekansal profilleme platformu protokolü
- Aşağıdaki notta belirtilen uzamsal proteomik protokolü takip edin. 3-plex otomatik etiketleme prosedürünü etkinleştirmek için protokolde aşağıdaki değişiklikleri ekleyin.
- Uzamsal proteomik protokolüne başlamadan bir gün önce 1.2.1-1.2.6 adımlarını uygulayın ve adım 1.2.6'yı uyguladıktan sonra doğrudan uzamsal proteomik protokolün antijen alma adımına geçin. Uzamsal profil oluşturma proteomik protokolünde özetlenen görselleştirme prosedürünü atlayın.
- Florofor entegrasyonunu sağlamak için SYTO 13'ü 5000 nM'de SYTO 64 ile değiştirin. SYTO 64'ü 1x TBS'de seyreltin ve 15 dakika boyunca bir nem odasında inkübe edin.
- Uzamsal profil oluşturma platformunda tarama parametrelerini ayarlarken, 3 katlı entegrasyona izin vermek için görselleştirme panelinde kullanılan floroforlara göre filtreleri ve odaklama kanallarını seçin. DISCOVERY FAM için FITC kullanın ve pozlamayı 200 ms'ye ayarlayın, DISCOVERY Rhodamine 6G için Cy3 kullanın ve pozlamayı 200 ms'ye ayarlayın, SYTO 64 için Texas Red kullanın ve pozlamayı 50 ms'ye ayarlayın (bunu odak kanalı olarak belirtin) ve son olarak, DISCOVERY Cy5 için Cy5'i kullanın, pozlamayı 200 ms'ye ayarlayın, tıklayın ve değişiklikleri kaydedin.
NOT: Uzamsal profil oluşturma proteomik protokolünün ayrıntılı talimatları, resmi web sitesi Destek sekmesinde Dokümantasyon > Kullanım Kılavuzları seçilerek bulunabilir. Burada, Bond RX kullanarak nCounter için protein protokolünü arayın.
2. Uzamsal transkriptomik tahliller için ROI seçimi
- FFPE hücreli pelet kesitlerini 70 °C'ye ayarlanmış bir fırında 20-60 dakika pişirin. Aşağıdaki notta belirtilen uzamsal profil oluşturma platformu NGS protokolünü izleyin ve 50 μm ve 300 μm boyutlarını seçerek uzamsal profil oluşturma platformundaki slaytları tarayın. Uzamsal transkriptomik testi için aşağıdaki öneri vurgulanmıştır:
- Kitaplığı hazırlarken, çeşitli YG boyutları seçilmişse, boyut başına bir kitaplık oluşturmak için benzer boyutlardaki YG'leri bir araya getirin. Bu, boyuttan sapma olmadan tüm yatırım getirileri için yeterli sıralama derinliklerinin elde edilmesini sağlamak içindir.
NOT: Uzamsal profil oluşturma platformunun ayrıntılı talimatları, resmi web sitesi Destek sekmesinde Dokümantasyon > Kullanım Kılavuzları seçilerek bulunabilir. Burada, Bond RX kullanan NGS uygulamaları için RNA protokolünü arayın.
- Kitaplığı hazırlarken, çeşitli YG boyutları seçilmişse, boyut başına bir kitaplık oluşturmak için benzer boyutlardaki YG'leri bir araya getirin. Bu, boyuttan sapma olmadan tüm yatırım getirileri için yeterli sıralama derinliklerinin elde edilmesini sağlamak içindir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yatırım getirisi seçimini yönlendirmek için otomatik görselleştirme protokolü
Bu yazıda, dokuyu görselleştirmek ve belirli ROI'ları seçmek için otomatik, özel TSA tabanlı bir IF protokolünün kullanımını sunuyoruz. Kontrol dokuları olarak melanom ve insan normal derisini kullanarak görselleştirme paneli gelişimi, epitop stabilite testi, belirteç yoğunluklarının ince ayarlanması ve bir tanesini dışarıda bırakarak kanama değerlendirmesinden oluşuyordu. Antikorların epitop stabilitesinin tekrarlayan elüsyon adımlarından etkilenip etkilenmediğini test etmek için, FAP ve Antikor X sinyalleri, 3-pleksin her pozisyonunda etiketlendikten sonra kalitatif olarak değerlendirildi. Antikor X sinyali tüm pozisyonlarda tutarlı kalırken, FAP sinyal yoğunluğu bir elüsyondan sonra azaldı (Şekil 2). Önceki iç çalışmalar, panCK epitopunun 3 pleks tahlil boyunca stabil olduğunu göstermiştir. Bu nedenle FAP 3-pleks içinde 1. sırada, panCK 2. ve Antikor X 3. pozisyonda olmak üzere seçildi. FAP sinyali, Antikor X ve panCK'ye kıyasla genel olarak daha zayıf olduğundan, FAP daha parlak florofor Cy5 ile eşleştirildi.
Otomatik 3-plex, komşu kanallara kanama olmadığını doğrulamak için her bir işaretleyicinin 3-plex protokolünden bir kez çıkarıldığı bir tane dışarıda bırakma kontrolleri ile optimize edildi (Şekil 3).
Otomatik boyama platformunda kullanılan floroforlar, filtrelerin 3 katlı görselleştirme panelindeki TSA floroforlarıyla uyumlu olduğunu doğrulamak için uzamsal profil oluşturma platformunda test edilmiştir. 3-plex protokolü FITC, Cy3 ve Cy5 kullandığından ve DAPI kanalı mekansal profilleme platformunda UV bölünmesi için kullanıldığından, Teksas Kırmızı kanalında nükleer bir karşı leke kullanılması gerekiyordu. İki farklı nükleer boya, SYTO 59 ve SYTO 64 test edildi ve boyalar kolon dokularında belirgin bir nükleer sinyal gösterdi. Bununla birlikte, SYTO 59, SYTO 64 kullanılırken Cy5 kanalı temizken, Cy5 kanalında bir miktar kanama sinyali de gösterdi (Şekil 4). Bu nedenle, SYTO 64 nükleer algılama için tercih edilen seçimdi.
SYTO 64'ün daha ileri testleri, bu boyanın fotoğraflanabilir olmadığını ve görüntüleme sırasında hızlı bir şekilde fotobeyazlatıldığını gösterdi. Sinyal ağartıldıktan sonra, görüntüleme sistemi spesifik olmayan bir sinyal olarak yorumlanabilecek arka plana odaklanır (Şekil 5). Sinyal yoğunluğunu artırmak için nükleer boya konsantrasyonunun arttırılması bu sorunu en aza indirmeye yardımcı oldu.
Doğrudan konjuge antikorlar kullanan panCK / CD45 manuel görselleştirme protokolü ile etiketlenmiş dokular, panCK / FAP / Antikor X otomatik özel görselleştirme protokolü ile etiketlenmiş dokularla karşılaştırıldı. Her iki protokol de panCK'yi ortak bir belirteç olarak paylaşır ve sinyal iki protokol arasında karşılaştırılabilirdi (Şekil 6).
Değiştirilmiş bir görselleştirme protokolünün yukarı akış uzamsal proteomik testi üzerinde hiçbir etkisi olmadığından emin olmak için, panCK/CD45 manuel görselleştirme protokolünü kullanırken Uzamsal Profil Oluşturma Platformu koleksiyonu ve Sayım Platformu işlemesinden sonra elde edilen sayım değerlerini karşılaştırdık. Bu, doğrudan konjuge antikorları veya TSA'yı kullanan 3-plex otomatik özel görselleştirme protokolünü kullanır. Dört kolorektal kanser (CRC) dokusu, mekansal proteomik tahlil ile birlikte panCK / CD45 manuel görselleştirme protokolü veya 3-plex otomatik özel görselleştirme protokolü ile etiketlendi. Her protokol için benzer yatırım getirileri seçildi ve karşılık gelen yatırım getirilerinin sayım verileri, S6 ve Histone için temizlik normalizasyonu kullanılarak karşılaştırıldı. Bu ROI'ler arasında, log2 ısı haritasında (Şekil 7A) gösterildiği gibi, uzamsal proteomik tahlilde yer alan tüm belirteçler için 0.88'lik bir Spearman R değeri ile benzer eğilimler gözlenmiştir (Şekil 7B). Tahlillerde kullanılan 31 antikordan 23 antikorun Spearman R değeri 0.5'ten yüksek veya ona eşitti.
Uzamsal proteomik ve transkriptomik protokoller farklı olduğundan, otomatik görselleştirme protokolünün mekansal transkriptomik tahlillerine de uygulanıp uygulanamayacağını değerlendirdik. Otomatik görselleştirme protokolü, RNA tespitinden önce IHC testinin yapılmasını gerektirirken, orijinal manuel protokol, görselleştirme protokolünü uygulamadan önce RNA'yı algılar. 3-plex otomatik görselleştirme protokolü, mekansal transkriptomik testi ile birlikte CK / CD45 manuel görselleştirme protokolü ile yan yana test edilmiştir. Uzamsal profil oluşturma yazılımında normalleştirilen 3 katlı otomatik görselleştirme protokolü Çeyrek 3 sayısı (Q3) için sıralama verileri, 0,15'lik düşük Spearman R değerleriyle de yansıtılan CK/CD45 manuel görselleştirme protokolüne (Şekil 8A) kıyasla daha düşük değerler sunmuştur (Şekil 8B). Ayrıca, 3-plex görselleştirme otomatik protokolü kullanılırken dinamik aralık kaybı gözlenmiştir (Şekil 8C).
Otomatik görselleştirme protokolü ile yapılan bu sayım kaybı, bu protokolün RNA bütünlüğünü tehlikeye attığını ve RNA kalitesini korumak için görselleştirme tahlili yapmadan önce RNA'nın tespit edilmesinin gerekli olduğunu gösterir. Bu otomatik görselleştirme paneli, protein kısmının RNA tespitinden önce yapılmasını gerektirdiğinden, bu protokol RNA tahlilleri için uygun değildir.
Uzamsal transkriptomik tahlillerde ROI seçiminin boyutu
ROI boyutunun RNA veri çıktısı üzerindeki etkisini daha iyi anlamak için, farklı büyüklükteki ROI'lerin RNA sayıları karşılaştırılmıştır. Uzamsal transkriptomik testi, dokulara özgü farklılıkları en aza indirmek için SUDHL1 ve JURKAT hücre hatları üzerinde gerçekleştirildi. 50 μm ve 300 μm çapındaki dairesel ROI'ler seçildi ve mekansal profil oluşturma yazılımında Q3 normalizasyonu kullanılarak birbirleriyle karşılaştırıldı. Farklı hücre hatlarında seçilen hedefler için RNA sayımları, normalizasyondan sonra iki ROI boyutu arasında karşılaştırılabilirdi (Şekil 9A, B).
Şekil 1: Dijital Uzamsal Profil Oluşturma iş akışı. (A) Slaytlar, antikorlar (uzamsal proteomik tahlil) veya problar (uzamsal transkriptomik tahlil) ve görselleştirme belirteçleri ile etiketlenir. (B) Slaytlar, YG'leri görüntülemek ve seçmek için uzamsal profil oluşturma platformuna yerleştirilir. (C) Oligolar UV ışığı ile yarılır ve 96 delikli bir plakada toplanır. Bu işlem, seçilen her yatırım getirisi için tekrarlanır. (D) Numuneler işlenir ve veriler sayım platformu veya bir sıralayıcı kullanılarak oluşturulur. Bu rakam Nanostring technologies web sitesi 4,5'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Epitop kararlılığı. (A-C) Antikor X ve (D-F) FAP sırasıyla insan normal derisi ve melanom üzerinde test edilmiştir. Her bir işaretleyici (A,D) 1st, (B,E) 2nd ve (C,F) 3nc pozisyonlarında 3-plex. Antikor X tüm pozisyonlarda stabildir, (D) FAP ise sırasıyla (E-F) bir ve iki salınımdan sonra azalan sinyal yoğunluğu gösterir. Yeşil renkte X antikoru, kırmızı renkte FAP, gri renkte DAPI. Ölçek çubukları 200 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İnsan pankreas dokuları üzerindeki 3 pleks otomatik özel görselleştirme protokolü için kontrollerden birini dışarıda bırakın. Tüm görüntüler için, Antikor X yeşil, panCK camgöbeği ve FAP kırmızı renkte tasvir edilmiştir. İlk satır, FITC'de (B) Antikor X, Cy3'te (C) panCK ve Cy5'te (D) FAP için (A) 3-plex ve tek kanalları gösterir. İkinci satır, (E) Antikor X ve (F-H) her bir belirteç için tek kanallar için bir tane dışarıda bırak kontrol 3-pleksini gösterir. Üçüncü satır, (I) panCK için bir tane dışarıda bırak kontrol 3-pleks ve (J-L) her işaretleyici için tek kanalları gösterir. Dördüncü satır, (M) FAP için bir tane dışarıda bırak kontrol 3-pleks ve (N-P) her işaretleyici için tek kanalları gösterir. Test edildiğinde (F) FAP olmadan, (K) panCK olmadan ve (P) Antikor X olmadan ilgili kanallardaki sinyal eksikliği ile belirtildiği gibi bir dışarı bırakma kontrollerinin hiçbirinde kanama gözlenmemiştir. ölçek çubukları 500 μm'dedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: SYTO boya testi. Texas Red kanalı, (A) SYTO 59 için Kolon içindeki nükleer sinyali, (B) Cy5 kanalına (kırmızı) kanama ile gösterir. Texas Red kanalı, (E) Cy5 kanalına kanamadan (D) SYTO 64 için Kolon'daki nükleer sinyali gösterir. Colon'daki Texas Red ve Cy5 kanalları, (C) SYTO 59'un kanamasını ve (F) SYTO 64 için kanama olmadığını göstermek için birlikte görüntülendi. Ölçek çubukları 50 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 5: SYTO 64 fotostabilitesi. Fotobeyazlatmadan önce ve sonra SYTO 64 (A) ile etiketlenmiş kolon örnekleri. Resim B, nükleer sinyal kaybından sonra daha görünür hale gelen spesifik olmayan sinyali göstermektedir. Ölçek çubukları 50 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Kolorektal kanser (CRC) örneklerinde panCK etiketlemesinin (A) panCK/CD45 manuel görselleştirme protokolü ve (B) panCK/FAP/Antikor X otomatik görselleştirme protokolü ile karşılaştırılması. İki protokol arasında panCK sinyalinde herhangi bir fark gözlenmedi. Ölçek çubukları 200 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Dört CRC dokusunun benzer ROI'leri üzerinde iki farklı görselleştirme protokolü kullanılarak uzamsal proteomik testi için sayım değerlerinin karşılaştırılması . (A) Log 2 Uzamsal proteomik tahlilde yer alan tüm belirteçlerin manuel panCK / CD45 protokolünü (siyah) otomatik 3-plex protokolü (gri) ile karşılaştıran ısı haritası. (B) Log 2 Tüm belirteçler için Spearman korelasyonu 0,88'lik bir R değeri sunar. İstatistiksel analiz GraphPad Prism 7 Yazılımı kullanılarak veya Python programlama dili ile yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: İki farklı görselleştirme protokolü kullanılarak uzamsal transkriptomik testi için sayım değerlerinin karşılaştırılması . (A) Log 2 Manuel panCK/CD45 protokolünü (siyah) 3-plex otomatik protokolle (gri) karşılaştıran uzamsal transkriptomik tahliline dahil edilen seçili hedeflerin ısı haritası. (B) Log 2 Tüm belirteçler için Spearman korelasyonu 0,15'lik bir R değeri sunar. (C) 3 katlı otomatik protokolde dinamik aralığın kaybolduğu ortalama (mavi) ve standart sapma. İstatistiksel analiz GraphPad Prism 7 Yazılımı kullanılarak veya Python programlama dili ile yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Hücre peletleri üzerindeki uzamsal transkriptomik tahlil için RNA sayım değerlerinin karşılaştırılması. (A) SUDHL1 ve (B) JURKAT hücre hatları üzerinde seçilen hedefler için 50 μm (siyah) ve 300 μm (gri) çaplı ROI'ler için karşılaştırılabilir sonuçlar gözlenmiştir. T-testi kullanılarak anlamlı bir fark gözlenmedi. N = boyut başına 3 YG için gösterilen ortalama ve standart sapma. İstatistiksel analiz GraphPad Prism 7 Yazılımı kullanılarak yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bugüne kadar, manuel bir protokolde doğrudan konjuge floresan antikorlar en yaygın olarak uzamsal proteomik veya uzamsal transkriptomik tahlilleri için görselleştirme panelleri olarak kullanılmaktadır 9,10. Bununla birlikte, doğrudan konjuge floresan antikorların kullanımı, daha az miktarda belirteçler için zorlayıcı olabilir ve uygun antikorların seçimini sınırlayabilir. Bu protokol, görselleştirme belirteçlerinin etiketlenmesinin, mekansal proteomik tahlilleri desteklemek için TSA teknolojileri kullanılarak otomatik bir boyama platformunda otomatikleştirilebileceğini göstermektedir. Bu, görselleştirme panellerinin özelleştirilmesinde daha fazla esneklik sağlar, bu da daha hedefli bir yatırım getirisi seçimi ve bir dokunun belirli alanlarından ilgili biyolojik verilerin alınmasını sağlar. TSA teknolojisi ayrıca düşük bolluk belirteçlerinin görselleştirilmesine izin verir ve böylece potansiyel uygun antikorların sayısını arttırır. Ek olarak, görselleştirme protokolünün otomasyonu, etiketleme prosedürünün tekrarlanabilirliğini ve kalitesini sağlar.
3-pleks IF testinin geliştirilmesi, uygun kontrol dokularındaki markör/florofor sinyal yoğunluklarının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirir. En iyi sinyal-gürültü oranını elde etmek için antikor konsantrasyonlarının titre edilmesi önerilir, bu da bitişik kanallara kanamayı en aza indirmeye yardımcı olur. Ayrıca, epitopun tekrarlanan elüsyon adımlarından etkilenmediğinden emin olmak için ilgilenilen her belirteç için epitop stabilitesi test edilmelidir. Paneldeki antikorların sırası onaylandıktan sonra, tahlilin bir tane dışarıda bırakma kontrolleri kullanılarak ince ayarlanması gerekir. Burada, panelde belirli bir işaretleyici atlanır ve elde edilen görüntüdeki karşılık gelen kanal, taşma ve çapraz konuşma için gözden geçirilir.
Burada, TSA tabanlı testlerin mekansal profilleme platformunda görüntülenebileceği ve nükleer boyama için DAPI alternatiflerinin kullanılması gerektiği gösterilmiştir. SYTO boyalarını test ettik ve hangi SYTO boyasının kullanılacağına karar verirken, bitişik kanallara kanamayı önlemek için sinyalin dikkatlice değerlendirilmesi gerektiğini belirledik. SYTO boyalarının kullanımının bir başka sınırlaması, nükleer nicelemeyi etkileyebilecek SYTO 64 ve SYTO 83 (dahili veriler) gibi bazı SYTO boyalarının fotobeyazlatıcıyı daha hızlı yıkamasıdır. Bu nedenle lekeli slaytların ışığa maruz kalmasından mümkün olduğunca kaçınılmalıdır. Diğer gruplar, daha fotoğraflanabilir (dahili veriler) olan ve ilgili belirteçler tercih edilen nükleer boya ile uyumlu floroforlara atandığı sürece bir panelde kullanılabilecek olan SYTO 13 11,12'nin kullanımını göstermiştir.
Otomatik TSA tabanlı floresan testleri, mekansal proteomik tahlillerle birlikte görselleştirme için iyi çalışırken, burada 3 pleks otomatik görselleştirme protokolünü mekansal bir transkriptomik protokolle birleştirmenin, RNA bütünlüğünü etkileyebilecek ekstra antijen alma / elüsyon adımları eklemenin daha sert protokol koşullarından kaynaklanabilecek dinamik aralık kaybına neden olabileceği belirlenmiştir. Bu nedenle, 3-plex otomatik görselleştirme protokolü sadece proteomik testler için uyarlanmalıdır, bu bir sınırlamadır ve RNA tabanlı tahliller için alternatif görselleştirme yaklaşımları gerektirir. Aynı slayt görselleştirmeye alternatif olarak, yatırım getirisi seçimini kolaylaştırmak için ilgi çekici belirteçlerle boyanmış seri bölümler üst üste bindirilebilir13. Ek olarak, literatür, ROI seçimi14'ü yönlendirmek için bitişik slaytlarda in situ hibridizasyonun kullanımını açıklamaktadır. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar doku mevcudiyeti, bölümden bölüme değişkenlik ve hücreden hücreye kayıtlarla sınırlı olabilir.
Ayrıca, mekansal transkriptomik tahlilleri için farklı ROI boyutlarının kullanılabilirliğini de test ettik. 50 μm'lik küçük yatırım getirilerinin kullanılması, araştırmacının seçilen hücrelerin veya ilgi alanlarının daha ayrıntılı bir şekilde okunmasına izin veren belirli bölgelerin verilerini elde etmesini sağlar. Küçük YG'leri seçmenin sınırlamaları, mevcut hücre sayısının, arka plandan ayırt edilebilecek sayım değerlerini elde etmek için yeterince bol olmayabileceğidir. Bir seçenek, daha az miktarda bulunan hedefleri yakalamak için saf hücre popülasyonlarını seçmektir. Bununla birlikte, tek hücreler için ROI seçimi, yüksek sinyal-gürültü oranı15 ile sınırlıdır. Ayrıca, farklı büyüklükteki YG'ler tek bir deneyde toplanıyorsa, kütüphane hazırlığı için YG boyutlarını dikkate almak önemlidir. YG boyutları önemli ölçüde farklılık gösteriyorsa, YG'leri boyutlarına göre bir araya getirmek ve büyük YG'lerin tek bir kitaplıkta aşırı temsil edilmesini önlemek için ayrı kitaplıklar oluşturmak yararlı olabilir. Bu aynı zamanda her ROI'nin büyüklüğüne göre yeterli sıralama kapsamı almasını sağlayacaktır.
Uzamsal Omik deneyleri gerçekleştirirken göz önünde bulundurulması gereken diğer faktörler, verilerin slayttan slayta değişkenlik nedeniyle varyasyonlar gösterebilmesi ve belirli hedeflerin daha düşük ifadesinin arka plan ve korelasyon değerlerindeki farklılıkları ortaya çıkarabilmesidir. Deneyler planlanırken ve veriler değerlendirilirken yeterli kontroller ve normalleştirme yaklaşımları göz önünde bulundurulmalıdır. nCounter üzerindeki mekansal proteomik testler için, kat hizmetleri hedeflerine veya negatif kontrol IgG'lerine normalleştirme, kat hizmetleri hedefleri veya negatif kontrol IgG'ler arasındaki korelasyonun değerlendirilmesi gereken dahili deneyime ve satıcı tavsiyelerine göre tercih edilen yöntemlerdir16. Bununla birlikte, kullanılan dokulara bağlı olarak, her çalışma için en iyi normalizasyonun tanımlanması gerekir17,18. Örneğin, literatür, meme kanseri Mekansal Omik çalışmaları için, temizlik hedeflerine normalleştirmek için yaygın olarak kullanılan GAPDH'nin S6 ve Histone19'dan daha az uyumlu olduğunu belirtmektedir. Bu nedenle, S6 ve Histone, meme kanseri dokularında normalleşme için önerilen temizlik hedefleri olmuştur19.
Uzamsal transkriptomik tahliller için, çalışma tasarımına bağlı olarak normalizasyon stratejilerinin tanımlanması gerekir (örneğin, doku tipleri ve ROI seçimi). RNA-Seq'te kullanılan üst çeyrek veya kesilmiş ortalama M değerleri (TMM) normalizasyonu gibi bazı stratejiler, sıralı verilerinormalleştirmek için uygulanabilir 19,20.
Uzamsal transkriptomik tahliller binlerce hedef hakkında bilgi sağlar ve spesifik TME bölmelerinin tek çekirdekli RNA-seq20 veya tek hücreli RNA dizilimi21 ile birlikte seçildiği ve analiz edildiği tüm transkriptomu keşfetmek için daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Hedeflerin mekansal dağılımını değerlendirmek için ROI seçimine rehberlik edecek görselleştirme protokollerinin, mekansal proteomik tahliller için otomatikleştirilebileceğini, ancak mekansal transkriptomik tahlilleri için otomatikleştirilemeyeceğini gösterdik. Ek olarak, belirli bir doku bölgesinin daha derinlemesine araştırılmasına izin vermek için 50 μm kadar küçük yatırım getirilerinin seçilebileceğini sunuyoruz. Bu teknolojinin gelecekteki uygulamaları, tümör mikro çevresinin anlaşılmasını geliştirecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrus ve Sandra Rost, Roche Grubu'nun bir üyesi olan Genentech'in çalışanları ve hissedarlarıdır. Roche'un bir parçası olan diğer şirketler, bu makalede kullanılan reaktifler ve aletler üretmektedir. Ciara Martin, bu makalede kullanılan reaktifleri ve aletleri üreten NanoString Technologies Inc.'in tam zamanlı bir çalışanıdır.
Acknowledgments
Yazarlar, Thomas Wu'yu NGS dosyalarını işlediği için kabul ediyor. Sonuç tartışmaları ve makale incelemesi için James Ziai'ye ve iç makale revizyonu için Meredith Triplet ve Rachel Taylor'a teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
