Summary
Her beskriver vi en protokol til finjustering af interesseområder (ROI'er) for rumlige omikteknologier for bedre at karakterisere tumormikromiljøet og identificere specifikke cellepopulationer. For proteomics-assays kan automatiserede tilpassede protokoller guide ROI-valg, mens transkriptomics-assays kan finjusteres ved hjælp af ROI'er så små som 50 μm.
Abstract
Multiplexing muliggør vurdering af flere markører på det samme væv, samtidig med at der gives rumlig kontekst. Rumlige Omics-teknologier tillader både protein- og RNA-multiplexing ved at udnytte henholdsvis fotospaltbare oligo-mærkede antistoffer og sonder. Oligos spaltes og kvantificeres fra bestemte regioner på tværs af vævet for at belyse den underliggende biologi. Her viser undersøgelsen, at automatiserede brugerdefinerede antistofvisualiseringsprotokoller kan bruges til at guide ROI-valg i forbindelse med rumlige proteomics-assays. Denne specifikke metode viste ikke acceptabel ydeevne med rumlige transkriptomiske assays. Protokollen beskriver udviklingen af et 3-plex immunofluorescerende (IF) assay til markørvisualisering på en automatiseret platform ved hjælp af tyramidsignalforstærkning (TSA) til at forstærke fluorescerende signal fra et givet proteinmål og øge antistofpuljen at vælge imellem. Visualiseringsprotokollen blev automatiseret ved hjælp af et grundigt valideret 3-plex-assay for at sikre kvalitet og reproducerbarhed. Derudover blev udvekslingen af DAPI for SYTO-farvestoffer evalueret for at muliggøre billeddannelse af TSA-baserede IF-assays på den rumlige profileringsplatform. Derudover testede vi evnen til at vælge små ROI'er ved hjælp af det rumlige transkriptomiske assay for at muliggøre undersøgelse af meget specifikke interesseområder (f.eks. Områder beriget til en given celletype). ROI'er på 50 μm og 300 μm diameter blev indsamlet, hvilket svarer til henholdsvis ca. 15 celler og 100 celler. Prøver blev lavet i biblioteker og sekventeret for at undersøge evnen til at detektere signaler fra små ROI'er og profilspecifikke områder af vævet. Vi fastslog, at rumlige proteomics-teknologier i høj grad drager fordel af automatiserede, standardiserede protokoller til at guide ROI-valg. Selvom denne automatiserede visualiseringsprotokol ikke var kompatibel med rumlige transkriptomiske assays, var vi i stand til at teste og bekræfte, at specifikke cellepopulationer med succes kan detekteres selv i små ROI'er med standard manuel visualiseringsprotokol.
Introduction
Fremskridt inden for multiplexingteknikker fortsætter med at give bedre karakteriseringsværktøjer til mål, der er til stede i tumorer. Tumormikromiljøet (TME) er et komplekst system af tumorceller, infiltrerende immunceller og stroma, hvor rumlig information er afgørende for bedre at forstå og fortolke mekanismer for interaktion mellem biomarkører af interesse1. Med nye teknikker som GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) og 10x Visium kan flere mål detekteres og kvantificeres samtidigt inden for deres rumlige kontekst. Brugen af immunfluorescensprotokoller, der letter vævsvisualisering, kan yderligere forbedre disse teknologiers rumlige profileringskapacitet.
Den Spatial Omics-teknologi, vi fokuserede på til denne metodeudvikling, består af rumlig proteomics og transcriptomics assays, hvor oligonukleotider er bundet til antistoffer eller RNA-sonder via en UV-følsom fotospaltbar linker. Histologiske dias mærkes med disse oligo-konjugerede antistoffer eller sonder og afbildes derefter på den rumlige profileringsplatform. Dernæst vælges ROI'er i forskellige størrelser og former til belysning, og de fotospaltede oligonukleotider aspireres og opsamles i en 96-brøndplade. De fotospaltede oligonukleotider fremstilles til kvantificering med enten Nanostring nCounter-systemet eller Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (figur 1)4,5.
Cellefordelinger varierer inden for væv, og evnen til at karakterisere specifikke placeringer af celler ved hjælp af udvalgte markører og forskellige ROI-størrelser er af stor betydning for fuldt ud at forstå vævsmiljøet og identificere specifikke træk. I den her nævnte Spatial Omics-teknologi bruger standardvisualiseringsprotokollen direkte konjugerede antistoffer og er en manuel protokol. Standardmarkørerne til at skelne mellem tumor og stroma er panCytokeratin (panCK) og CD456,7, men yderligere markører er nødvendige for at målrette mod specifikke cellepopulationer af interesse. Desuden mangler brugen af direkte konjugerede fluorescerende antistoffer amplifikation, hvilket begrænser antistofudvælgelsen til rigelige markører. Derudover er manuelle analyser underlagt større variabilitet end automatiserede arbejdsgange8. Derfor er det ønskeligt at have en tilpasselig, automatiseret og forstærket visualiseringsprotokol til ROI-valg.
Her viser undersøgelsen, at TSA-teknologi til rumlige proteomics-assays kan bruges til visualiseringsprotokoller på en automatiseret platform, hvilket resulterer i et mere målrettet og standardiseret assay. Derudover muliggør TSA-baserede assays brugen af markører med lavt udtryk, hvilket øger rækkevidden af mål, der kan vælges til visualisering. Et 3-plex assay for panCK, FAP og Antibody X blev udviklet ved hjælp af en automatiseret platform, hvor panCK og FAP blev brugt til at skelne mellem henholdsvis tumor og stroma. Antistof X er et stromalt protein, der ofte forekommer i tumorer, men dets biologi og indvirkning på antitumorimmunitet forstås ikke fuldt ud. Karakterisering af immunkonteksten i områder, der er rige på antistof X, kan belyse dets rolle i antitumorimmunitet og terapeutisk respons samt dets potentiale som lægemiddelmål.
Mens tilpassede automatiserede TSA-visualiseringspaneler viste sig at være vellykkede for rumlige proteomics-assays, kunne anvendelsen af disse assays til rumlige transkriptomics-assays ikke bekræftes. Dette skyldes sandsynligvis reagenserne og protokollen, der anvendes til de automatiserede visualiseringsprotokoller, som synes at kompromittere RNA-integriteten. At erkende, at en automatiseret mærkningsprotokol til visualiseringsmarkører kan bruges til rumlige proteomics-assays, men ikke til rumlige transkriptomics-assays, giver vigtig vejledning om Spatial Omics-teknologianalysedesign.
Derudover viser undersøgelsen, at det rumlige transkriptomiske assay kan bruges til at profilere mål i regioner så små som 50 μm i diameter eller ca. 15 celler. To ROI'er i forskellige størrelser blev udvalgt for at teste analysens evne til også at detektere transkripter i små ROI'er. For hver region af interesse blev oligoer svarende til 1.800 mRNA-mål indsamlet og lavet til biblioteker i henhold til den rumlige profileringsplatformsprotokol. Biblioteker blev individuelt indekseret, efterfølgende samlet og sekventeret. Dette gjorde det muligt at evaluere både poolingeffektivitet og evnen til at identificere specifikke cellepopulationer i små ROI'er.
Dette papir viser, at for rumlige proteomics-assays kan en automatiseret protokol til vejledning af ROI-udvælgelse på specifikke markører af interesse bruges til selektivt at målrette forhør af relevante vævsområder og karakterisere vævets rumlige miljø. Desuden demonstrerer vi, at mindre ROI'er kan bruges til rumlige transkriptomiske assays til at detektere og karakterisere specifikke cellepopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt humant væv blev erhvervet fra kommercielle biobanker eller akkrediterede vævsbanker under garanti for, at der blev opnået passende godkendelse fra Institutional Review Board og informeret samtykke.
BEMÆRK: Protokollen udføres ved hjælp af Discovery Ultra og GeoMx Digital Spatial Profiler. Se materialefortegnelsen for detaljer om reagenser, udstyr og software, der anvendes i denne protokol.
1. Automatiseret visualiseringsprotokol til rumlige proteomics-assays
- Programmér autostainer til at anvende fluorescerende visualiseringsantistoffer
- I autostainer-softwaren skal du klikke på startknappen og vælge Protokoller. Klik derefter på Opret / rediger protokoller , og vælg RUO DISCOVERY Universal som proceduren.
- Klik på Første sekvens > afparaffinisering > Depar v2. For Medium temperatur skal du vælge 72 grader C, derefter klikke på Forbehandling og vælge Cellekonditionering og CC1-reservoir. For Meget høj temperatur skal du vælge 100 grader C, derefter klikke på CC1 8 Min og fortsætte med at klikke, indtil CC1 64 Min er valgt.
- Klik på Inhibitor > DISCOVERY Inhibitor, og vælg 8 minutter for inkubationstid. Klik derefter på Antistof > høj temp Ab-inkubation; for lav temperatur skal du vælge 37 grader C; for Antistof skal du vælge antistofnummeret fra dispenseretiketten (Antistof 6 i dette eksempel); for Plus inkubationstid skal du vælge 32 minutter.
BEMÆRK: Denne protokol har tre forskellige antistofnumre. Det første antistof er FAP, det andet er Pan-Cytokeratin, og det tredje er Antistof X. - Klik på Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, vælg derefter Gt Ig Block for Antibody Blocking, og vælg 4 minutter for inkubationstid. Vælg derefter OMap anti-Rb HRP på Multimer HRP Reagens, og vælg 16 minutter for Inkubationstid. Klik derefter på Cy5, og vælg 0 time 8 min for lang inkubationstid.
- Klik på Dual Sequence og vælg Antistof Denaturering, vælg derefter Antistof Denature CC2-1, og for Meget høj temperatur, vælg 100 grader C. Sørg for, at inkubationstiden er 8 min. Klik derefter på DS Inhibitor og vælg Neutraliser.
- Klik på DS Antistof, og for meget lav temperatur skal du vælge 37 grader C. Vælg derefter antistofnummeret fra dispenseretiketten (Antistof 3 i dette eksempel), og vælg 32 minutter i Antistof.
- Klik på DS Multimer HRP og vælg DS Multimer HRP Blocker. Vælg derefter Gt Ig-blok for antistofblokering, og vælg 4 minutter for inkubationstid. Vælg derefter OMap anti-Ms HRP på Multimer HRP, og vælg 16 minutter for inkubationstid. Klik derefter på DS Rhodamin 6G, og for lang inkubationstid skal du vælge 0 timer 8 minutter.
- Klik på Tredobbelt plet, og vælg TS-antistofdenaturering, vælg derefter Antistofdenatur CC2-2, og vælg 100 grader C for Meget høj temperatur. Sørg for, at inkubationstiden er 8 min. Klik derefter på TS-hæmmer og vælg TS Neutraliser.
- Klik på TS-antistof, og vælg 37 grader C for meget lav temperatur. Vælg derefter antistofnummeret fra dispenseretiketten (antistof 7 i dette eksempel) i Antistof, og vælg 32 minutter for Plus inkubationstid.
- Klik på TS Multimer HRP og vælg TS Multimer HRP Blocker. Vælg derefter Gt Ig-blok for antistofblokering, og vælg 4 minutter for inkubationstid. Vælg derefter OMap anti-Rb HRP på Multimer HRP Reagens, og vælg 16 minutter for Inkubationstid. Klik derefter på TS FAM, og vælg 0 time 8 min for lang inkubationstid.
- Føj en titel til protokollen. Vælg et protokolnummer, tilføj en kommentar, og klik på Aktiv efterfulgt af Gem.
- Forbered dias, udskriv etiketter, og start autostainer-kørslen
- Bagningsleverandøren anskaffede FFPE (formalinfikserede, paraffinindlejrede) humane vævssektioner i en ovn indstillet til 70 ° C i 20-60 minutter. Mens dias bager, kan du udskrive etiketter ved at klikke på Opret etiket i autostainer-softwaren. Klik derefter på Protokoller, vælg protokolnummeret, og klik på Luk / Udskriv. Tilføj relevante oplysninger på diasetiketten, og klik på Udskriv.
- Fjern gliderne fra ovnen, og lad dem køle af til stuetemperatur (RT). Anvend de tidligere udskrevne protokoletiketter på de tilsvarende dias.
- Genopfyldelige antistofdispensere fyldes med antistoffer i henhold til det antistofetiketnummer, der er tildelt i trin 1.1. I denne protokol skal du bruge antistof 6 til FAP ved 1 μg / ml, bruge antistof 3 til pancytokeratin ved 0,1 μg / ml og bruge antistof 7 til antistof X ved 2,5 μg / ml. Hvert antistof fortyndes i det specificerede fortyndingsmiddel, og de genopfyldelige antistofdispensere klargøres.
- Saml blokering, detektion og forstærkning af fyldte reagensdispensere, der er nævnt ovenfor, og anbring dem på en reagensbakke. Indlæs dias i diasbakkerne (op til 30 dias pr. kørsel), og klik på Løb efterfulgt af Ja. Bemærk, at DAPI ikke bruges til nuklear modfarvning.
- Bekræft starten af kørslen ved at kontrollere kørselsvarigheden på autostainer-softwaren. Protokollen tager ~ 11 timer for færdiggørelse og kan køre natten over.
- Den næste dag skal du sikre kørslen ved at observere grønne blinkende lys på glidebakkesporene. Tag derefter diasene af instrumentet og skyl diasene kraftigt i 1x reaktionsbuffer, indtil væskedækselopløsningen er helt fjernet.
- Rumlig profileringsplatformprotokol til proteomics-assay
- Følg den rumlige proteomics-protokol, der er angivet i nedenstående note. Medtag følgende ændringer af protokollen for at aktivere den automatiske mærkningsprocedure 3-plex.
- Udfør trin 1.2.1-1.2.6 dagen før start af protokollen for rumlig proteomik, og gå direkte til antigenhentningstrinnet i protokollen for rumlig proteomik efter udførelse af trin 1.2.6. Udelad visualiseringsproceduren, der er beskrevet i protokollen for proteomics til rumlig profilering.
- Udskift SYTO 13 med SYTO 64 ved 5000 nM for at muliggøre fluoroforintegration. Fortynd SYTO 64 i 1x TBS og inkuber i et fugtighedskammer i 15 min.
- Når du konfigurerer scanningsparametrene i den rumlige profileringsplatform, skal du vælge filtre og fokuseringskanaler i henhold til de fluoroforer, der bruges i visualiseringspanelet, for at tillade 3-plex-integration. Brug FITC til DISCOVERY FAM og indstil eksponeringen til 200 ms, brug Cy3 til DISCOVERY Rhodamin 6G og indstil eksponeringen til 200 ms, brug Texas Red til SYTO 64 og indstil eksponeringen til 50 ms (angiv dette som fokuskanal), og til sidst skal du bruge Cy5 til DISCOVERY Cy5, indstille eksponeringen til 200 ms, og gemme ændringer.
BEMÆRK: Detaljerede instruktioner i proteomics-protokollen til rumlig profilering findes på den officielle fane Support på webstedet ved at vælge Dokumentation > brugervejledninger. Her skal du kigge efter proteinprotokollen til nCounter ved hjælp af Bond RX.
2. ROI-udvælgelse til rumlige transkriptomiske assays
- Bag FFPE-cellepillesektioner i en ovn indstillet til 70 °C i 20-60 min. Følg NGS-protokollen for rumlig profileringsplatform, der er angivet i noten nedenfor, og scan dias på den rumlige profileringsplatform, vælg størrelser på 50 μm og 300 μm. Følgende anbefaling fremhæves for den rumlige transkriptomiske analyse:
- Hvis der blev valgt forskellige størrelser ROI'er, når du forbereder biblioteket, skal du samle ROI'er af samme størrelse for at oprette et bibliotek pr. Størrelse. Dette er for at sikre, at der opnås tilstrækkelige sekventeringsdybder for alle ROI'er uden bias fra størrelse.
BEMÆRK: Detaljerede instruktioner om den rumlige profileringsplatform findes på den officielle hjemmeside Supportfanen ved at vælge Dokumentation > Brugermanualer. Her skal du kigge efter RNA-protokollen til NGS-applikationer ved hjælp af Bond RX.
- Hvis der blev valgt forskellige størrelser ROI'er, når du forbereder biblioteket, skal du samle ROI'er af samme størrelse for at oprette et bibliotek pr. Størrelse. Dette er for at sikre, at der opnås tilstrækkelige sekventeringsdybder for alle ROI'er uden bias fra størrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Automatiseret visualiseringsprotokol til vejledning af ROI-valg
I dette papir præsenterer vi brugen af en automatiseret, brugerdefineret TSA-baseret IF-protokol til at visualisere vævet og vælge specifikke ROI'er. Udvikling af visualiseringspanel ved hjælp af melanom og normal hud som kontrolvæv bestod af epitopstabilitetstest, finjustering af markørintensiteter og gennemblødningsvurdering gennem udeladelseskontrol. For at teste, om antistoffernes epitopstabilitet påvirkes af gentagne elueringstrin, blev FAP- og antistof X-signaler kvalitativt vurderet efter mærkning i hver position af 3-plex. Antistof X-signalet forblev konsistent i alle positioner, mens FAP-signalintensiteten faldt efter en eluering (figur 2). Tidligere interne undersøgelser viste, at panCK-epitopen er stabil gennem et 3-plex-assay. Derfor blev FAP valgt til at være i 1. position i 3-plex, panCK blev placeret i 2. og antistof X i 3. position. Da FAP-signalet generelt var svagere sammenlignet med antistof X og panCK, blev FAP parret med den lysere fluorofor, Cy5.
Den automatiserede 3-plex blev optimeret med leave one out-kontroller, hvor hver markør blev udeladt fra 3-plex-protokollen én gang for at bekræfte, at der ikke var nogen gennemblødning i nabokanaler (figur 3).
De fluoroforer, der blev brugt på den automatiserede farvningsplatform, blev testet på den rumlige profileringsplatform for at bekræfte, at filtrene er kompatible med TSA-fluoroforerne i 3-plex-visualiseringspanelet. Da 3-plex-protokollen bruger FITC, Cy3 og Cy5, og DAPI-kanalen bruges til UV-spaltning på den rumlige profileringsplatform, måtte der bruges en nuklear modfarve i Texas Red-kanalen. To forskellige nukleare farvestoffer, SYTO 59 og SYTO 64, blev testet, og farvestofferne viste et tydeligt nukleart signal i tyktarmsvæv. SYTO 59 viste dog også noget bleedthrough-signal i Cy5-kanalen, mens Cy5-kanalen var ren, når du brugte SYTO 64 (figur 4). Derfor var SYTO 64 det foretrukne valg til nuklear detektion.
Yderligere test af SYTO 64 viste, at dette farvestof ikke var fototabelt og fotoblecheret hurtigt under billeddannelse. Når signalet er bleget, fokuserer billeddannelsessystemet på baggrunden, hvilket kan fortolkes som et ikke-specifikt signal (figur 5). Forøgelse af koncentrationen af det nukleare farvestof for at øge signalintensiteten hjalp med at minimere dette problem.
Væv mærket med panCK / CD45 manuel visualiseringsprotokol, der bruger direkte konjugerede antistoffer, blev sammenlignet med væv mærket med panCK / FAP / Antibody X automatiseret brugerdefineret visualiseringsprotokol. Begge protokoller deler panCK som en fælles markør, og signalet var sammenligneligt mellem de to protokoller (figur 6).
For at sikre, at en modificeret visualiseringsprotokol ikke har nogen indflydelse på det opstrøms rumlige proteomics-assay, sammenlignede vi de tælleværdier, der blev opnået efter indsamling af Spatial Profiling Platform og Counting Platform-behandling, når vi brugte den manuelle visualiseringsprotokol panCK/CD45. Dette bruger direkte konjugerede antistoffer eller den 3-plex automatiserede brugerdefinerede visualiseringsprotokol, der bruger TSA. Fire kolorektal cancer (CRC) væv blev mærket med panCK / CD45 manuel visualiseringsprotokol eller 3-plex automatiseret brugerdefineret visualiseringsprotokol i kombination med den rumlige proteomics-analyse. Lignende ROI'er blev valgt for hver protokol, og tælledata for de tilsvarende ROI'er blev sammenlignet ved hjælp af husholdningsnormalisering for S6 og Histone. Lignende tendenser blev observeret mellem disse ROI'er som vist i log2-varmekortet (figur 7A) med en Spearman R-værdi på 0,88 for alle markører, der er inkluderet i det rumlige proteomics-assay (figur 7B). Af de 31 antistoffer, der blev anvendt i analyserne, havde 23 antistoffer en Spearman R-værdi, der var højere end eller lig med 0,5.
Da rumlig proteomik og transkriptomiske protokoller er forskellige, vurderede vi, om den automatiserede visualiseringsprotokol også kunne anvendes på rumlige transkriptomiske assays. Den automatiserede visualiseringsprotokol kræver, at IHC-assayet udføres før RNA-detektion, mens den oprindelige manuelle protokol registrerer RNA først, før visualiseringsprotokollen anvendes. Den automatiserede visualiseringsprotokol 3-plex blev testet side om side med CK/CD45 manuel visualiseringsprotokol i kombination med det rumlige transkriptomiske assay. Sekventeringsdata for den 3-plex automatiserede visualiseringsprotokol Quartile 3 count (Q3), normaliseret på den rumlige profileringssoftware, præsenterede lavere værdier sammenlignet med CK/CD45 manuel visualiseringsprotokol (figur 8A), hvilket også afspejles af de lave Spearman R-værdier på 0,15 (figur 8B). Der blev også observeret et tab af dynamisk område ved brug af den automatiserede protokol med 3-plex visualisering (figur 8C).
Dette tab af tællinger med den automatiserede visualiseringsprotokol indikerer, at denne protokol kompromitterer RNA-integriteten, og at detektering af RNA'et inden udførelse af visualiseringsanalysen er nødvendig for at bevare RNA-kvaliteten. Da dette automatiserede visualiseringspanel kræver, at proteindelen udføres før RNA-detektion, er denne protokol ikke egnet til RNA-assays.
Størrelse af ROI-valg i rumlige transkriptomiske assays
For bedre at forstå virkningen af ROI-størrelse på RNA-dataoutput blev RNA-tællinger af forskellige størrelser ROI'er sammenlignet. Det rumlige transkriptomiske assay blev udført på SUDHL1- og JURKAT-cellelinjer for at minimere forskelle, der er forbundet med væv. Cirkulære ROI'er på 50 μm og 300 μm diameter blev valgt og sammenlignet med hinanden ved hjælp af Q3-normalisering på den rumlige profileringssoftware. RNA-tal for udvalgte mål på forskellige cellelinjer var sammenlignelige mellem de to ROI-størrelser efter normalisering (figur 9A, B).
Figur 1: Arbejdsproces for digital rumlig profilering. (A) Dias er mærket med antistoffer (rumlig proteomics assay) eller sonder (spatial transcriptomics assay) samt visualiseringsmarkører. (B) Dias placeres på den rumlige profileringsplatform for at afbilde og vælge ROI'er. (C) Oligos spaltes af UV-lys og opsamles i en plade med 96 brønde. Denne proces gentages for hvert valgt investeringsafkast. D) Prøverne behandles, og data genereres ved hjælp af tælleplatformen eller en sequencer. Dette tal er blevet ændret fra Nanostring technologies hjemmeside 4,5. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Epitopstabilitet. (A-C) Antistof X og (D-F) FAP testet på henholdsvis normal hud og melanom hos mennesker. Hver markør i (A,D) 1st, (B,E) 2nd og (C,F) 3. position af en 3-plex. Antistof X er stabilt i alle positioner, mens (D) FAP viser faldende signalintensitet efter (E-F) henholdsvis en og to elueringer. Antistof X i grønt, FAP i rødt, DAPI i gråt. Skalabjælker er på 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Udelad one out-kontroller til den 3-plex automatiserede brugerdefinerede visualiseringsprotokol på humant bugspytkirtelvæv. For alle billeder er Antistof X afbildet i grønt, panCK i cyan og FAP i rødt. Den første række viser (A) 3-plex og de enkelte kanaler for (B) antistof X i FITC, (C) panCK i Cy3 og (D) FAP i Cy5. Den anden række viser leave one out-kontrollen 3-plex for (E) antistof X og (F-H) de enkelte kanaler for hver markør. Den tredje række viser leave one out-kontrollen 3-plex for (I) panCK og (J-L) de enkelte kanaler for hver markør. Den fjerde række viser den udeladte kontrol 3-plex for (M) FAP og (N-P) de enkelte kanaler for hver markør. Der blev ikke observeret nogen blødning i nogen af de udeladte kontrolelementer som angivet ved manglende signal i de tilsvarende kanaler, når de blev testet (F) uden FAP, (K) uden panCK og (P) uden antistof X. Vægtstænger er på 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Test af SYTO-farvestof. Texas Red kanal viser det nukleare signal i Colon for (A) SYTO 59 med gennemblødning i (B) Cy5 kanal (rød). Texas Red-kanalen viser det nukleare signal i Colon for (D) SYTO 64 uden gennemblødning i (E) Cy5-kanalen. Texas Red og Cy5 kanaler i Colon vises sammen for at vise (C) gennemblødning af SYTO 59 og (F) ingen gennemblødning for SYTO 64. Vægtstænger er på 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: SYTO 64 fotostabilitet. Tyktarmsprøver mærket med SYTO 64 (A) før og (B) efter fotoblegning. Billede B viser det ikke-specifikke signal, der bliver mere synligt efter tab af nukleart signal. Vægtstænger er på 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Sammenligning af panCK-mærkning . panCK-signal på kolorektal cancer (CRC) prøver med (A) panCK / CD45 manuel visualiseringsprotokol og (B) panCK / FAP / Antistof X automatiseret visualiseringsprotokol. Der blev ikke observeret forskelle i panCK-signalet mellem de to protokoller. Skalabjælker er på 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Sammenligning af tælleværdier for det rumlige proteomics-assay ved hjælp af to forskellige visualiseringsprotokoller på lignende ROI'er af fire CRC-væv. (A) Log 2 Varmekort over alle markører, der er inkluderet i det rumlige proteomics-assay, der sammenligner den manuelle panCK/CD45-protokol (sort) med den automatiserede 3-plex-protokol (grå). (B) Log 2 Spearman-korrelation for alle markørerne præsenterer en R-værdi på 0,88. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 7 Software eller med Python programmeringssprog. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Sammenligning af tælleværdier for det rumlige transkriptomiske assay ved hjælp af to forskellige visualiseringsprotokoller. (A) Log 2 Heatmap over udvalgte mål inkluderet i det rumlige transkriptomics-assay, der sammenligner den manuelle panCK/CD45-protokol (sort) med den automatiserede 3-plex-protokol (grå). (B) Log 2 Spearman-korrelation for alle markørerne præsenterer en R-værdi på 0,15. (C) Den gennemsnitlige (blå) afvigelse og standardafvigelsen, hvor dynamikområdet går tabt i den automatiserede 3-plex-protokol. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 7 Software eller med Python programmeringssprog. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Sammenligning af RNA-talværdier for det rumlige transkriptomiske assay på cellepellets. Sammenlignelige resultater blev observeret for 50 μm (sort) og 300 μm (grå) diameter ROI'er for udvalgte mål på (A) SUDHL1 og (B) JURKAT-cellelinjer. Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel ved anvendelse af t-test. Middelværdi og standardafvigelse vist for n = 3 ROI'er pr. størrelse. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 7 Software. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til dato anvendes direkte konjugerede fluorescerende antistoffer i en manuel protokol mest som visualiseringspaneler til rumlig proteomics eller spatial transcriptomics assays 9,10. Brugen af direkte konjugerede fluorescerende antistoffer kan dog være udfordrende for mindre rigelige markører, hvilket begrænser udvælgelsen af egnede antistoffer. Denne protokol viser, at mærkning af visualiseringsmarkører kan automatiseres på en automatiseret farvningsplatform ved hjælp af TSA-teknologier til understøttelse af rumlige proteomics-assays. Dette giver mulighed for mere fleksibilitet i tilpasningen af visualiseringspaneler, hvilket muliggør en mere målrettet ROI-udvælgelse og erhvervelse af relevante biologiske data fra specifikke områder af et væv. TSA-teknologi tillader også visualisering af markører med lav overflod og øger derved antallet af potentielle egnede antistoffer. Derudover sikrer automatisering af visualiseringsprotokollen reproducerbarhed og kvalitet af mærkningsproceduren.
Udvikling af et 3-plex IF-assay kræver omhyggelig vurdering af markør-/fluoroforsignalintensiteter på passende kontrolvæv. Det anbefales at titrere antistofkoncentrationer for at opnå det bedste signal-støj-forhold, hvilket vil bidrage til at minimere gennemblødning i tilstødende kanaler. Desuden bør epitopstabiliteten for hver markør af interesse testes for at sikre, at epitopen ikke påvirkes af gentagne elueringstrin. Når rækkefølgen af antistoffer i panelet er bekræftet, skal analysen finjusteres ved hjælp af leave one out-kontroller. Her udelades en bestemt markør i panelet, og den tilsvarende kanal i det erhvervede billede gennemgås for gennemblødning og krydstale.
Det blev vist her, at TSA-baserede assays kan afbildes på den rumlige profileringsplatform, og at DAPI-alternativer skal bruges til nuklear farvning. Vi testede SYTO-farvestoffer og fastslog, at når vi beslutter, hvilket SYTO-farvestof der skal bruges, skal signalet vurderes nøje for at undgå gennemblødning i tilstødende kanaler. En anden begrænsning af brugen af SYTO-farvestoffer er, at nogle SYTO-farvestoffer fotobleges hurtigere, såsom SYTO 64 og SYTO 83 (interne data), hvilket kan påvirke nuklear kvantificering. Derfor bør lyseksponering af de farvede dias undgås så meget som muligt. Andre grupper har vist brugen af SYTO 1311,12, som er mere fototabel (interne data) og kunne bruges i et panel, så længe markørerne af interesse tildeles fluoroforer, der er kompatible med det valgte nukleare farvestof.
Mens automatiserede TSA-baserede fluorescerende assays fungerede godt til visualisering i kombination med rumlige proteomics-assays, blev det her fastslået, at kombination af en 3-plex automatiseret visualiseringsprotokol med en rumlig transkriptomics-protokol resulterede i tab af dynamisk område, hvilket kunne skyldes de hårdere protokolbetingelser for tilføjelse af ekstra antigenhentning / elueringstrin, der kan påvirke RNA-integritet. Derfor bør 3-plex automatiseret visualiseringsprotokol kun tilpasses til proteomics-assays, hvilket er en begrænsning og kræver alternative visualiseringsmetoder til RNA-baserede assays. Som et alternativ til visualisering af samme dias kunne serielle sektioner farvet med interessemarkører overlejres for at lette ROI-valg13. Derudover beskriver litteraturen brugen af in situ-hybridisering på tilstødende dias for at guide ROI-valg14. Disse tilgange kan imidlertid begrænses af vævstilgængelighed, sektion-til-sektion-variabilitet og celle-til-celle-registreringer.
Vi testede også anvendeligheden af forskellige ROI-størrelser til rumlige transkriptomiske assays. Ved hjælp af små ROI'er på 50 μm kan forskeren erhverve data fra specifikke regioner, hvilket muliggør en mere detaljeret aflæsning af udvalgte celler eller interesseområder. Begrænsninger ved at vælge små ROI'er er, at antallet af celler, der er til stede, muligvis ikke er rigeligt nok til at få tælleværdier, der kan skelnes fra baggrunden. En mulighed er at vælge rene cellepopulationer for at fange mindre rigelige mål. Valg af investeringsafkast for enkeltceller er dog begrænset af et højt signal/støj-forhold15. Desuden er det vigtigt at overveje ROI-størrelser til biblioteksforberedelse, hvis ROI'er i forskellige størrelser indsamles i et enkelt eksperiment. Hvis ROI-størrelser afviger betydeligt, kan det være en fordel at samle ROI'er i henhold til deres størrelser og konstruere separate biblioteker for at forhindre, at store ROI'er bliver overrepræsenteret i ét bibliotek. Dette vil også sikre, at hvert investeringsafkast får tilstrækkelig sekventeringsdækning i henhold til dets størrelse.
Andre faktorer, der skal overvejes, når du udfører Spatial Omics-eksperimenter, er, at dataene kan vise variationer på grund af slide-to-slide-variabilitet, og lavere udtryk for visse mål kan frembringe baggrund og forskelle i korrelationsværdier. Passende kontrol- og normaliseringsmetoder skal overvejes ved planlægning af eksperimenter og evaluering af data. For rumlige proteomics-assays på nCounter er normalisering til husholdningsmål eller til negative kontrol-IgG'er de foretrukne metoder i henhold til interne erfaringer og leverandøranbefalinger, hvor korrelationen mellem husholdningsmålene eller til de negative kontrol-IgG'er skal evalueres16. Afhængigt af det anvendte væv skal den bedste normalisering dog defineres for hver undersøgelse17,18. For eksempel siger litteraturen, at for brystkræft Spatial Omics-undersøgelser har GAPDH, som almindeligvis bruges til normalisering til husholdningsmål, været mindre overensstemmende end S6 og Histone19. Derfor har S6 og Histone været de anbefalede husholdningsmål for normalisering i brystkræftvæv19.
For rumlige transkriptomiske assays skal normaliseringsstrategier defineres afhængigt af undersøgelsesdesignet (f.eks. Vævstyper og ROI-udvælgelse). Nogle strategier, der anvendes i RNA-Seq, såsom øvre kvartil eller trimmet gennemsnit af M-værdier (TMM) normalisering, kunne anvendes til at normalisere sekventerede data19,20.
Rumlige transkriptomiske assays giver information om tusindvis af mål og bliver mere almindeligt anvendt til at udforske hele transkriptomet, hvor specifikke TME-rum vælges og analyseres i forbindelse med enkeltkerne RNA-seq20 eller enkeltcellet RNA-sekventering21. Vi demonstrerede, at visualiseringsprotokoller til at guide ROI-valg til vurdering af den rumlige fordeling af mål kunne automatiseres til rumlige proteomics-assays, men ikke til rumlige transkriptomiske assays. Derudover præsenterer vi, at ROI'er så små som 50 μm kan vælges for at muliggøre en mere dybtgående undersøgelse af en bestemt vævsregion. Fremtidige anvendelser af denne teknologi vil forbedre forståelsen af tumormikromiljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan og Sandra Rost er ansatte og aktionærer i Genentech, et medlem af Roche Group. Andre virksomheder, der er en del af Roche, producerer reagenser og instrumenter, der anvendes i dette manuskript. Ciara Martin er fuldtidsansat hos NanoString Technologies Inc, som producerer reagenser og instrumenter, der anvendes i dette manuskript.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Thomas Wu for behandling af NGS-filer. Vi takker James Ziai for resultaterne, diskussionerne og manuskriptgennemgangen og Meredith Triplet og Rachel Taylor for intern manuskriptrevision.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
