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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Räumliches Profiling der Protein- und RNA-Expression im Gewebe: Ein Ansatz zur Feinabstimmung der virtuellen Mikrodissektion

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/62651
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 1
1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Feinabstimmung von Regions of Interest (ROIs) für Spatial Omics-Technologien, um die Tumormikroumgebung besser zu charakterisieren und spezifische Zellpopulationen zu identifizieren. Für Proteomik-Assays können automatisierte, angepasste Protokolle die ROI-Auswahl leiten, während Transkriptomik-Assays mit ROIs von nur 50 μm fein abgestimmt werden können.

Abstract

Multiplexing ermöglicht die Beurteilung mehrerer Marker auf demselben Gewebe bei gleichzeitiger Bereitstellung eines räumlichen Kontextes. Spatial Omics-Technologien ermöglichen sowohl Protein- als auch RNA-Multiplexing, indem sie photospaltbare oligomarkierte Antikörper bzw. Sonden nutzen. Oligos werden aus bestimmten Regionen des Gewebes gespalten und quantifiziert, um die zugrunde liegende Biologie aufzuklären. Hier zeigt die Studie, dass automatisierte benutzerdefinierte Antikörper-Visualisierungsprotokolle verwendet werden können, um die ROI-Auswahl in Verbindung mit räumlichen Proteomik-Assays zu steuern. Diese spezifische Methode zeigte keine akzeptable Leistung bei räumlichen Transkriptomik-Assays. Das Protokoll beschreibt die Entwicklung eines 3-Plex-Immunfluoreszenz-Assays (IF) für die Markervisualisierung auf einer automatisierten Plattform unter Verwendung von Tyramid-Signalamplifikation (TSA), um das Fluoreszenzsignal von einem bestimmten Proteinziel zu verstärken und den Antikörperpool zur Auswahl zu erhöhen. Das Visualisierungsprotokoll wurde mit einem gründlich validierten 3-Plex-Assay automatisiert, um Qualität und Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Darüber hinaus wurde der Austausch von DAPI gegen SYTO-Farbstoffe evaluiert, um die Bildgebung von TSA-basierten IF-Assays auf der räumlichen Profilierungsplattform zu ermöglichen. Darüber hinaus testeten wir die Fähigkeit, kleine ROIs mit dem räumlichen Transkriptomik-Assay auszuwählen, um die Untersuchung hochspezifischer Interessengebiete zu ermöglichen (z. B. Bereiche, die für einen bestimmten Zelltyp angereichert sind). Es wurden ROIs von 50 μm und 300 μm Durchmesser gesammelt, was etwa 15 Zellen bzw. 100 Zellen entspricht. Die Proben wurden in Bibliotheken umgewandelt und sequenziert, um die Fähigkeit zu untersuchen, Signale von kleinen ROIs und profilspezifischen Regionen des Gewebes zu erkennen. Wir haben festgestellt, dass räumliche Proteomik-Technologien stark von automatisierten, standardisierten Protokollen profitieren, um die ROI-Auswahl zu steuern. Obwohl dieses automatisierte Visualisierungsprotokoll nicht mit räumlichen Transkriptomik-Assays kompatibel war, konnten wir testen und bestätigen, dass bestimmte Zellpopulationen auch bei kleinen ROIs mit dem standardmäßigen manuellen Visualisierungsprotokoll erfolgreich nachgewiesen werden können.

Introduction

Fortschritte in Multiplexing-Techniken bieten weiterhin bessere Charakterisierungswerkzeuge für Targets in Tumoren. Die Tumormikroumgebung (TME) ist ein komplexes System aus Tumorzellen, infiltrierenden Immunzellen und Stroma, in dem räumliche Informationen entscheidend sind, um die Interaktionsmechanismen zwischen Biomarkern von Interesse besser zu verstehen und zu interpretieren1. Mit neuen Techniken wie dem GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) und 10x Visium können mehrere Ziele gleichzeitig in ihrem räumlichen Kontext erkannt und quantifiziert werden. Die Verwendung von Immunfluoreszenzprotokollen, die die Visualisierung von Gewebe erleichtern, kann die räumlichen Profilierungsfähigkeiten dieser Technologien weiter verbessern.

Die Spatial Omics-Technologie, auf die wir uns für diese Methodenentwicklung konzentriert haben, besteht aus räumlichen Proteomik- und Transkriptomik-Assays, bei denen Oligonukleotide über einen UV-empfindlichen photospaltbaren Linker an Antikörper oder RNA-Sonden gebunden werden. Histologische Objektträger werden mit diesen oligokonjugierten Antikörpern oder Sonden markiert und dann auf der räumlichen Profilierungsplattform abgebildet. Als nächstes werden ROIs unterschiedlicher Größe und Form für die Beleuchtung ausgewählt, und die photogespaltenen Oligonukleotide werden abgesaugt und in einer 96-Well-Platte gesammelt. Die photogespaltenen Oligonukleotide können entweder mit dem Nanostring nCounter-System oder mit Next Generation Sequencing (NGS)2,3 quantifiziert werden (Abbildung 1)4,5.

Die Zellverteilungen variieren innerhalb von Geweben, und die Fähigkeit, bestimmte Positionen von Zellen mit ausgewählten Markern und unterschiedlichen ROI-Größen zu charakterisieren, ist von großer Bedeutung, um die Gewebeumgebung vollständig zu verstehen und spezifische Merkmale zu identifizieren. In der hier erwähnten Spatial Omics-Technologie verwendet das Standard-Visualisierungsprotokoll direkt konjugierte Antikörper und ist ein manuelles Protokoll. Die Standardmarker zur Unterscheidung zwischen Tumor und Stroma sind panCytokeratin (panCK) und CD456,7, aber zusätzliche Marker sind notwendig, um spezifische Zellpopulationen von Interesse anzusprechen. Darüber hinaus fehlt der Verwendung von direkt konjugierten fluoreszierenden Antikörpern die Amplifikation, was die Antikörperselektion auf reichlich vorhandene Marker beschränkt. Darüber hinaus unterliegen manuelle Assays einer größeren Variabilität als automatisierte Workflows8. Daher ist es wünschenswert, ein anpassbares, automatisiertes und erweitertes Visualisierungsprotokoll für die ROI-Auswahl zu haben.

Hier zeigt die Studie, dass die TSA-Technologie für räumliche Proteomik-Assays für Visualisierungsprotokolle auf einer automatisierten Plattform verwendet werden kann, was zu einem gezielteren und standardisierteren Assay führt. Darüber hinaus ermöglichen TSA-basierte Assays die Verwendung von Markern mit geringer Expression, wodurch der Bereich der Ziele, die für die Visualisierung ausgewählt werden können, erweitert wird. Ein 3-Plex-Assay für panCK, FAP und Antikörper X wurde unter Verwendung einer automatisierten Plattform entwickelt, auf der panCK und FAP zur Unterscheidung zwischen Tumor und Stroma verwendet wurden. Antikörper X ist ein Stromaprotein, das häufig in Tumoren vorkommt, aber seine Biologie und sein Einfluss auf die Anti-Tumor-Immunität sind nicht vollständig verstanden. Die Charakterisierung des Immunkontexts in Gebieten, die reich an Antikörper X sind, kann seine Rolle bei der Antitumorimmunität und der therapeutischen Reaktion sowie sein Potenzial als Wirkstoffziel aufklären.

Während sich kundenspezifische automatisierte TSA-Visualisierungspanels für räumliche Proteomik-Assays als erfolgreich erwiesen, konnte die Anwendung dieser Assays für räumliche Transkriptomik-Assays nicht bestätigt werden. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Reagenzien und das Protokoll zurückzuführen, die für die automatisierten Visualisierungsprotokolle verwendet werden, die die RNA-Integrität zu beeinträchtigen scheinen. Die Erkenntnis, dass ein automatisiertes Markierungsprotokoll für Visualisierungsmarker für räumliche Proteomik-Assays, nicht aber für räumliche Transkriptomik-Assays verwendet werden kann, bietet eine wichtige Orientierungshilfe für Assay-Designs der Spatial Omics-Technologie.

Darüber hinaus zeigt die Studie, dass der räumliche Transkriptomik-Assay verwendet werden kann, um Ziele in Regionen mit einem Durchmesser von nur 50 μm oder etwa 15 Zellen zu profilieren. Es wurden zwei unterschiedlich große ROIs ausgewählt, um die Fähigkeit des Assays zu testen, auch Transkripte in kleinen ROIs zu erkennen. Für jede Region von Interesse wurden Oligos, die 1.800 mRNA-Zielen entsprachen, gesammelt und gemäß dem Protokoll der räumlichen Profiling-Plattform in Bibliotheken umgewandelt. Bibliotheken wurden einzeln indiziert, anschließend gepoolt und sequenziert. Dies ermöglichte die Bewertung sowohl der Pooling-Effizienz als auch der Fähigkeit, spezifische Zellpopulationen in kleinen ROIs zu identifizieren.

Diese Arbeit zeigt, dass für räumliche Proteomik-Assays ein automatisiertes Protokoll zur Steuerung der ROI-Auswahl auf bestimmten Markern von Interesse verwendet werden kann, um die Abfrage relevanter Gewebebereiche selektiv zu steuern und die räumliche Umgebung des Gewebes zu charakterisieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass kleinere ROIs für räumliche transkriptomische Assays verwendet werden können, um spezifische Zellpopulationen zu detektieren und zu charakterisieren.

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Protocol

Alle menschlichen Gewebe wurden von kommerziellen Biobanken oder akkreditierten Gewebebanken unter der Garantie erworben, dass die entsprechende Genehmigung des Institutional Review Board und die Einverständniserklärung eingeholt wurden.

HINWEIS: Das Protokoll wird mit dem Discovery Ultra und dem GeoMx Digital Spatial Profiler durchgeführt. Weitere Informationen zu Reagenzien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .

1. Automatisiertes Visualisierungsprotokoll für räumliche Proteomik-Assays

  1. Programmieren Sie Autostainer zur Anwendung fluoreszierender Visualisierungsantikörper
    1. Klicken Sie in der Autostainer-Software auf die Home-Taste und wählen Sie Protokolle. Klicken Sie dann auf Protokolle erstellen/bearbeiten und wählen Sie RUO DISCOVERY Universal als Prozedur aus.
    2. Klicken Sie auf Erste Sequenz > Deparaffinisierung > Depar v2. Wählen Sie für Mediumstemperatur 72 ° C, klicken Sie dann auf Vorbehandlung und wählen Sie Zellkonditionierung und CC1-Reservoir. Wählen Sie für sehr hohe Temperatur 100 ° C, klicken Sie dann auf CC1 8 Min und klicken Sie weiter, bis CC1 64 Min ausgewählt ist.
    3. Klicken Sie auf Inhibitor > DISCOVERY Inhibitor und wählen Sie für Inkubationszeit 8 Minuten. Klicken Sie dann auf Antikörper > High Temp Ab Inkubation; für niedrige Temperatur, wählen Sie 37 ° C; Wählen Sie für Antikörper die Antikörpernummer auf dem Etikett des Spenders aus (in diesem Beispiel Antikörper 6); Wählen Sie für Plus Inkubationszeit die Option 32 Minuten aus.
      HINWEIS: Dieses Protokoll hat drei verschiedene Antikörpernummern. Der erste Antikörper ist FAP, der zweite ist Pan-Cytokeratin und der dritte ist Antikörper X.
    4. Klicken Sie auf Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, wählen Sie dann für Antikörperblockierung die Option Gt Ig Block und für Inkubationszeit die Option 4 Minuten. Wählen Sie als Nächstes unter Multimer HRP Reagenz die Option OMap anti-Rb HRP und für Inkubationszeit 16 Minuten aus. Klicken Sie dann auf Cy5 und wählen Sie für Long Incubation Time (Lange Inkubationszeit) die Option 0 Hr 8 Min.
    5. Klicken Sie auf Dual Sequence (Dualsequenz ) und wählen Sie Antibody Denaturation, dann Antibody Denature CC2-1 und für Very High Temperature (Sehr hohe Temperatur) die Option 100 °C (Sehr hohe Temperatur). Stellen Sie sicher, dass die Inkubationszeit 8 min beträgt. Klicken Sie anschließend auf DS Inhibitor und wählen Sie Neutralisieren.
    6. Klicken Sie auf DS Antikörper und wählen Sie für Sehr niedrige Temperatur 37 ° C. Wählen Sie dann unter Antikörper die Antikörpernummer aus dem Spenderetikett aus (in diesem Beispiel Antikörper 3), und wählen Sie für Plus Inkubationszeit die Option 32 Minuten aus.
    7. Klicken Sie auf DS Multimer HRP und wählen Sie DS Multimer HRP Blocker. Wählen Sie dann für Antikörperblockierung die Option Gt Ig-Block und für Inkubationszeit die Option 4 Minuten aus. Wählen Sie als Nächstes auf Multimer HRP Reagenz OMap Anti-Ms HRP aus, und wählen Sie für Inkubationszeit 16 Minuten aus. Klicken Sie dann auf DS Rhodamine 6G und wählen Sie für Lange Inkubationszeit 0 Std. 8 Min.
    8. Klicken Sie auf Triple Färbung und wählen Sie TS Antikörper-Denaturierung, dann wählen Sie Antikörper-Denaturierung CC2-2 und für sehr hohe Temperatur wählen Sie 100 ° C. Stellen Sie sicher, dass die Inkubationszeit 8 Minuten beträgt. Klicken Sie anschließend auf TS-Inhibitor und wählen Sie TS Neutralisieren.
    9. Klicken Sie auf TS-Antikörper und wählen Sie für Sehr niedrige Temperatur 37 ° C aus. Wählen Sie dann unter Antikörper die Antikörpernummer aus dem Spenderetikett aus (in diesem Beispiel Antikörper 7), und wählen Sie für Plus Inkubationszeit die Option 32 Minuten aus.
    10. Klicken Sie auf TS Multimer HRP und wählen Sie TS Multimer HRP Blocker. Wählen Sie dann für Antikörperblockierung die Option Gt Ig Block und für Inkubationszeit die Option 4 Minuten. Wählen Sie als Nächstes unter Multimer HRP Reagenz die Option OMap anti-Rb HRP und für Inkubationszeit 16 Minuten aus. Klicken Sie dann auf TS FAM und wählen Sie für Long Incubation Time (Lange Inkubationszeit) 0 Hr 8 Min.
    11. Fügen Sie dem Protokoll einen Titel hinzu. Wählen Sie eine Protokollnummer aus, fügen Sie einen Kommentar hinzu und klicken Sie auf Aktiv und dann auf Speichern.
  2. Vorbereiten von Dias, Drucken von Etiketten und Starten des Autostainer-Laufs
    1. Der Backverkäufer beschaffte FFPE (Formalin-fixierte, paraffineingebettete) menschliche Gewebeschnitte in einem Ofen, der 20-60 Minuten auf 70 °C eingestellt war. Drucken Sie Etiketten aus, indem Sie in der Autostainer-Software auf "Etikett erstellen " klicken. Klicken Sie anschließend auf Protokolle, wählen Sie die Protokollnummer aus und klicken Sie auf Schließen/Drucken. Fügen Sie relevante Informationen auf dem Folienetikett hinzu und klicken Sie auf Drucken.
    2. Dias aus dem Ofen nehmen und auf Raumtemperatur (RT) abkühlen lassen. Wenden Sie die zuvor gedruckten Protokollbeschriftungen auf die entsprechenden Folien an.
    3. Beladen Sie nachfüllbare Antikörperspender mit Antikörpern gemäß der in Schritt 1.1 zugewiesenen Antikörper-Kennzeichnungsnummer. Verwenden Sie in diesem Protokoll Antikörper 6 für FAP bei 1 μg/ml, verwenden Sie Antikörper 3 für Pan-Zytokeratin bei 0,1 μg/ml und verwenden Sie Antikörper 7 für Antikörper X bei 2,5 μg/ml. Verdünnen Sie jeden Antikörper in dem angegebenen Verdünnungsmittel und bereiten Sie die nachfüllbaren Antikörperspender vor.
    4. Sammeln Sie die oben genannten vorgefüllten Reagenzienspender zum Blockieren, Erkennen und Verstärken und legen Sie sie auf ein Reagenzienfach. Laden Sie die Folien in die Folienfächer (bis zu 30 Folien pro Durchlauf) und klicken Sie auf Ausführen und dann auf Ja. Beachten Sie, dass DAPI nicht für die nukleare Gegenfärbung verwendet wird.
    5. Bestätigen Sie den Start des Laufs, indem Sie die Laufdauer in der Autostainer-Software überprüfen. Das Protokoll dauert ~11 h für die Fertigstellung und kann über Nacht ausgeführt werden.
    6. Stellen Sie am nächsten Tag sicher, dass der Lauf abgeschlossen ist, indem Sie grüne Blinklichter an den Schiebefachschlitzen beobachten. Nehmen Sie dann die Objektträger vom Gerät ab und spülen Sie die Objektträger kräftig in 1x Reaktionspuffer, bis die flüssige Deckglaslösung vollständig entfernt ist.
  3. Räumliches Profiling-Plattformprotokoll für Proteomik-Assays
    1. Befolgen Sie das räumliche Proteomik-Protokoll, das in der folgenden Anmerkung angegeben ist. Nehmen Sie die folgenden Änderungen am Protokoll vor, um das automatisierte 3-Plex-Kennzeichnungsverfahren zu aktivieren.
    2. Führen Sie die Schritte 1.2.1 bis 1.2.6 am Tag vor dem Start des räumlichen Proteomikprotokolls durch und fahren Sie nach dem Ausführen von Schritt 1.2.6 direkt mit dem Antigenabrufschritt des räumlichen Proteomikprotokolls fort. Lassen Sie das im Spatial Profiling Proteomics-Protokoll beschriebene Visualisierungsverfahren weg.
    3. Ersetzen Sie SYTO 13 durch SYTO 64 bei 5000 nM, um die Fluorophorintegration zu ermöglichen. SYTO 64 in 1x TBS verdünnen und 15 min in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.
    4. Wählen Sie beim Einrichten der Scanparameter in der räumlichen Profilierungsplattform die Filter und Fokussierkanäle entsprechend den im Visualisierungspanel verwendeten Fluorophoren aus, um eine 3-Plex-Integration zu ermöglichen. Verwenden Sie FITC für DISCOVERY FAM und stellen Sie die Belichtung auf 200 ms ein, verwenden Sie Cy3 für DISCOVERY Rhodamin 6G und stellen Sie die Belichtung auf 200 ms ein, verwenden Sie Texas Red für SYTO 64 und stellen Sie die Belichtung auf 50 ms ein (geben Sie dies als Fokuskanal an), und verwenden Sie schließlich Cy5 für DISCOVERY Cy5, stellen Sie die Belichtung auf 200 ms ein, und speichern Sie die Änderungen.
      HINWEIS: Detaillierte Anweisungen zum Proteomik-Protokoll für räumliche Profilerstellung finden Sie auf der offiziellen Support-Registerkarte der Website, indem Sie Dokumentation > Benutzerhandbücher auswählen. Suchen Sie hier nach dem Proteinprotokoll für nCounter mit Bond RX.

2. ROI-Auswahl für räumliche Transkriptomik-Assays

  1. FFPE-Zellpelletabschnitte in einem auf 70 °C eingestellten Ofen für 20-60 min backen. Befolgen Sie das NGS-Protokoll der räumlichen Profilierungsplattform, das in der folgenden Anmerkung angegeben ist, und scannen Sie Objektträger auf der räumlichen Profilierungsplattform, wobei Sie Größen von 50 μm und 300 μm auswählen. Die folgende Empfehlung wird für den räumlichen Transkriptomik-Assay hervorgehoben:
    1. Wenn beim Vorbereiten der Bibliothek verschiedene Größen von ROIs ausgewählt wurden, fassen Sie ROIs ähnlicher Größe zusammen, um eine Bibliothek pro Größe zu erstellen. Damit soll sichergestellt werden, dass ausreichende Sequenziertiefen für alle ROIs ohne Verzerrung durch die Größe erreicht werden.
      HINWEIS: Detaillierte Anweisungen zur räumlichen Profilerstellungsplattform finden Sie auf der offiziellen Registerkarte "Support" auf der Website, indem Sie " Dokumentation" > "Benutzerhandbücher" auswählen. Suchen Sie hier nach dem RNA-Protokoll für NGS-Anwendungen mit Bond RX.

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Representative Results

Automatisiertes Visualisierungsprotokoll zur Steuerung der ROI-Auswahl
In diesem Artikel stellen wir die Verwendung eines automatisierten, benutzerdefinierten TSA-basierten IF-Protokolls vor, um das Gewebe zu visualisieren und spezifische ROIs auszuwählen. Die Entwicklung von Visualisierungspanels unter Verwendung von Melanomen und normaler menschlicher Haut als Kontrollgewebe bestand aus Epitopstabilitätstests, Feinabstimmung der Markerintensitäten und Durchblutungsbewertung durch Leave-One-Out-Kontrollen. Um zu testen, ob die Epitopstabilität der Antikörper durch wiederholte Elutionsschritte beeinflusst wird, wurden FAP- und Antikörper-X-Signale nach der Markierung in jeder Position des 3-Plex qualitativ bewertet. Das Antikörper-X-Signal blieb in allen Positionen konsistent, während die Intensität des FAP-Signals nach einer Elution abnahm (Abbildung 2). Frühere interne Studien zeigten, dass das panCK-Epitop während eines 3-Plex-Assays stabil ist. Daher wurde FAP in der 1. Position im 3-Plex, panCK in der 2. und Antikörper X in der 3. Position gewählt. Da das FAP-Signal im Vergleich zu Antikörper X und panCK insgesamt schwächer war, wurde FAP mit dem helleren Fluorophor Cy5 gepaart.

Der automatisierte 3-Plex wurde mit Leave-One-Out-Steuerelementen optimiert, bei denen jeder Marker einmal aus dem 3-Plex-Protokoll weggelassen wurde, um zu bestätigen, dass es kein Durchbluten in benachbarte Kanäle gab (Abbildung 3).

Die auf der automatisierten Färbeplattform verwendeten Fluorophore wurden auf der räumlichen Profilierungsplattform getestet, um zu bestätigen, dass die Filter mit den TSA-Fluorophoren im 3-plex-Visualisierungspanel kompatibel sind. Da das 3-Plex-Protokoll FITC, Cy3 und Cy5 verwendet und der DAPI-Kanal für die UV-Spaltung auf der räumlichen Profilierungsplattform verwendet wird, musste ein nuklearer Gegenfleck im Texas Red-Kanal verwendet werden. Zwei verschiedene Kernfarbstoffe, SYTO 59 und SYTO 64, wurden getestet, und die Farbstoffe zeigten ein deutliches Kernsignal im Dickdarmgewebe. SYTO 59 zeigte jedoch auch ein Durchblutungssignal im Cy5-Kanal an, während der Cy5-Kanal bei Verwendung von SYTO 64 sauber war (Abbildung 4). Daher war SYTO 64 die bevorzugte Wahl für die nukleare Detektion.

Weitere Tests von SYTO 64 zeigten, dass dieser Farbstoff nicht fotostabil war und während der Bildgebung schnell photogebleicht wurde. Sobald das Signal gebleicht ist, fokussiert sich das Bildgebungssystem auf den Hintergrund, der als unspezifisches Signal interpretiert werden kann (Abbildung 5). Die Erhöhung der Konzentration des Kernfarbstoffs zur Erhöhung der Signalintensität trug dazu bei, dieses Problem zu minimieren.

Gewebe, die mit dem manuellen Visualisierungsprotokoll panCK/CD45 markiert waren, das direkt konjugierte Antikörper verwendet, wurden mit Geweben verglichen, die mit dem automatisierten benutzerdefinierten Visualisierungsprotokoll panCK/FAP/Antikörper X markiert waren. Beide Protokolle teilen panCK als gemeinsamen Marker, und das Signal war zwischen den beiden Protokollen vergleichbar (Abbildung 6).

Um sicherzustellen, dass ein modifiziertes Visualisierungsprotokoll keine Auswirkungen auf den vorgelagerten räumlichen Proteomik-Assay hat, verglichen wir die Zählwerte, die nach der Erfassung der räumlichen Profiling-Plattform und der Verarbeitung der Zählplattform unter Verwendung des manuellen Visualisierungsprotokolls panCK/CD45 erhalten wurden. Dies verwendet direkt konjugierte Antikörper oder das automatisierte 3-Plex-Visualisierungsprotokoll, das TSA verwendet. Vier Darmkrebsgewebe (CRC) wurden mit dem manuellen Visualisierungsprotokoll panCK/CD45 oder dem automatisierten benutzerdefinierten 3-Plex-Visualisierungsprotokoll in Kombination mit dem räumlichen Proteomik-Assay markiert. Für jedes Protokoll wurden ähnliche ROIs ausgewählt, und die Zähldaten der entsprechenden ROIs wurden unter Verwendung der Housekeeping-Normalisierung für S6 und Histon verglichen. Ähnliche Trends wurden zwischen diesen ROIs beobachtet, wie in der log2-Heatmap (Abbildung 7A) gezeigt, mit einem Spearman-R-Wert von 0,88 für alle Marker, die im räumlichen Proteomik-Assay enthalten sind (Abbildung 7B). Von den 31 Antikörpern, die in den Assays verwendet wurden, hatten 23 Antikörper einen Spearman-R-Wert größer oder gleich 0,5.

Da sich räumliche Proteomik und transkriptomische Protokolle unterscheiden, haben wir untersucht, ob das automatisierte Visualisierungsprotokoll auch auf räumliche Transkriptomik-Assays angewendet werden kann. Das automatisierte Visualisierungsprotokoll erfordert, dass der IHC-Assay vor dem RNA-Nachweis durchgeführt wird, während das ursprüngliche manuelle Protokoll zuerst die RNA nachweist, bevor das Visualisierungsprotokoll angewendet wird. Das automatisierte 3-Plex-Visualisierungsprotokoll wurde Seite an Seite mit dem manuellen Visualisierungsprotokoll CK/CD45 in Kombination mit dem räumlichen Transkriptomik-Assay getestet. Die Sequenzierungsdaten für das automatisierte 3-Plex-Visualisierungsprotokoll Quartil 3 count (Q3), die auf der räumlichen Profilerstellungssoftware normalisiert wurden, zeigten niedrigere Werte im Vergleich zum manuellen Visualisierungsprotokoll CK/CD45 (Abbildung 8A), was sich auch in den niedrigen Spearman-R-Werten von 0,15 widerspiegelt (Abbildung 8B). Außerdem wurde ein Verlust des Dynamikbereichs beobachtet, wenn das automatisierte 3-Plex-Visualisierungsprotokoll verwendet wurde (Abbildung 8C).

Dieser Zählverlust mit dem automatisierten Visualisierungsprotokoll deutet darauf hin, dass dieses Protokoll die RNA-Integrität beeinträchtigt und dass der Nachweis der RNA vor der Durchführung des Visualisierungstests notwendig ist, um die RNA-Qualität zu erhalten. Da dieses automatisierte Visualisierungspanel erfordert, dass der Proteinteil vor der RNA-Detektion durchgeführt wird, ist dieses Protokoll nicht für RNA-Assays geeignet.

Größe der ROI-Selektion in räumlichen Transkriptomik-Assays
Um den Einfluss der ROI-Größe auf die RNA-Datenausgabe besser zu verstehen, wurden RNA-Zählungen unterschiedlich großer ROIs verglichen. Der räumliche Transkriptomik-Assay wurde an SUDHL1- und JURKAT-Zelllinien durchgeführt, um die Unterschiede zwischen den Geweben zu minimieren. Zirkuläre ROIs von 50 μm und 300 μm Durchmesser wurden ausgewählt und unter Verwendung der Q3-Normalisierung in der räumlichen Profilierungssoftware miteinander verglichen. Die RNA-Zählungen für ausgewählte Ziele auf verschiedenen Zelllinien waren nach der Normalisierung zwischen den beiden ROI-Größen vergleichbar (Abbildung 9A, B).

Figure 1
Abbildung 1: Arbeitsablauf für die digitale räumliche Profilerstellung. (A) Objektträger werden mit Antikörpern (räumlicher Proteomik-Assay) oder Sonden (räumlicher Transkriptomik-Assay) sowie Visualisierungsmarkern markiert. (B) Folien werden auf der räumlichen Profilerstellungsplattform platziert, um ROIs abzubilden und auszuwählen. (C) Oligos werden durch UV-Licht gespalten und in einer 96-Well-Platte gesammelt. Dieser Vorgang wird für jeden ausgewählten ROI wiederholt. (D) Die Proben werden verarbeitet und die Daten werden mit Hilfe der Zählplattform oder eines Sequenzers generiert. Diese Abbildung wurde von der Website 4,5 von Nanostring technologies geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Epitopstabilität. (A-C) Antikörper X und (D-F) FAP wurden auf normaler Haut bzw. Melanom getestet. Jeder Marker in der (A,D) 1. , (B,E) 2. und (C,F) 3. Position eines 3-Plex. Antikörper X ist in allen Positionen stabil, während (D) FAP nach (E-F) einer bzw. zwei Elution eine abnehmende Signalintensität zeigt. Antikörper X in grün, FAP in rot, DAPI in grau. Die Maßstabsbalken liegen bei 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Lassen Sie die Kontrollen für das automatisierte benutzerdefinierte 3-Plex-Visualisierungsprotokoll für menschliches Pankreasgewebe weg. Bei allen Bildern ist Antikörper X grün, panCK in Cyan und FAP rot dargestellt. Die erste Zeile zeigt den (A) 3-Plex und die Einzelkanäle für (B) Antikörper X in FITC, (C) panCK in Cy3 und (D) FAP in Cy5. Die zweite Zeile zeigt den 3-Plex für (E) Antikörper X und (F-H) die einzelnen Kanäle für jeden Marker. Die dritte Zeile zeigt den 3-Plex für (I) panCK und (J-L) die einzelnen Kanäle für jeden Marker. Die vierte Zeile zeigt das Leave-One-Out-Steuerelement 3-plex für (M) FAP und (N-P) die einzelnen Kanäle für jeden Marker. Es wurde kein Durchbluten in einer der Leave-One-Out-Kontrollen beobachtet, was durch das Fehlen eines Signals in den entsprechenden Kanälen angezeigt wird, wenn (F) ohne FAP, (K) ohne panCK und (P) ohne Antikörper X getestet wurde. Die Skalenbalken liegen bei 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: SYTO-Farbstoffprüfung. Texas Red Kanal zeigt das Kernsignal in Colon für (A) SYTO 59 mit Durchblutung in (B) Cy5 Kanal (rot). Texas Red Channel zeigt das Kernsignal im Colon für (D) SYTO 64 ohne Durchblutung in (E) Cy5 Kanal. Texas Red- und Cy5-Kanäle in Colon werden zusammen angezeigt, um (C) einen Durchblutungsdurchlauf von SYTO 59 und (F) keinen Durchlauf für SYTO 64 anzuzeigen. Maßstabsbalken liegen bei 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: SYTO 64 Photostabilität. Dickdarmproben, markiert mit SYTO 64 (A) vor und (B) nach dem Photobleichen. Bild B zeigt das unspezifische Signal, das nach dem Verlust des Kernsignals sichtbarer wird. Die Maßstabsbalken liegen bei 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Vergleich der panCK-Markierung. panCK-Signal auf Darmkrebsproben (CRC) mit (A) panCK/CD45 manuellem Visualisierungsprotokoll und (B) panCK/FAP/Antikörper X automatisiertem Visualisierungsprotokoll. Es wurden keine Unterschiede im panCK-Signal zwischen den beiden Protokollen beobachtet. Maßstäbe liegen bei 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Vergleich der Zählwerte für den räumlichen Proteomik-Assay unter Verwendung von zwei verschiedenen Visualisierungsprotokollen auf ähnlichen ROIs von vier CRC-Geweben . (A) Protokoll 2 Heatmap aller Marker, die im räumlichen Proteomik-Assay enthalten sind, der das manuelle panCK/CD45-Protokoll (schwarz) mit dem automatisierten 3-Plex-Protokoll (grau) vergleicht. (B) Die Log-2-Spearman-Korrelation für alle Marker ergibt einen R-Wert von 0,88. Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad Prism 7 Software oder mit der Programmiersprache Python durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Vergleich der Zählwerte für den räumlichen Transkriptomik-Assay unter Verwendung von zwei verschiedenen Visualisierungsprotokollen. (A) Protokoll 2 Heatmap ausgewählter Ziele, die im räumlichen Transkriptomik-Assay enthalten sind, der das manuelle panCK/CD45-Protokoll (schwarz) mit dem automatisierten 3-Plex-Protokoll (grau) vergleicht. (B) Die Log-2-Spearman-Korrelation für alle Marker ergibt einen R-Wert von 0,15. (C) Der Mittelwert (blau) und die Standardabweichung, bei der der Dynamikbereich im automatisierten 3-Plex-Protokoll verloren geht. Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad Prism 7 Software oder mit der Programmiersprache Python durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 9
Abbildung 9: Vergleich der RNA-Zählwerte für den räumlichen Transkriptomik-Assay an Zellpellets. Vergleichbare Ergebnisse wurden für ROIs mit einem Durchmesser von 50 μm (schwarz) und 300 μm (grau) für ausgewählte Targets auf (A) SUDHL1- und (B) JURKAT-Zelllinien beobachtet. Bei der Verwendung des t-Tests wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet. Mittelwert und Standardabweichung für n = 3 ROIs pro Größe. Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad Prism 7 Software durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Bis heute werden direkt konjugierte fluoreszierende Antikörper in einem manuellen Protokoll am häufigsten als Visualisierungspanels für räumliche Proteomik oder räumliche Transkriptomik-Assaysverwendet 9,10. Die Verwendung von direkt konjugierten fluoreszierenden Antikörpern kann jedoch für weniger häufig vorkommende Marker eine Herausforderung darstellen, was die Auswahl geeigneter Antikörper einschränkt. Dieses Protokoll zeigt, dass die Markierung von Visualisierungsmarkern auf einer automatisierten Färbeplattform mithilfe von TSA-Technologien zur Unterstützung räumlicher Proteomik-Assays automatisiert werden kann. Dies ermöglicht mehr Flexibilität bei der Anpassung von Visualisierungspanels, was eine gezieltere ROI-Auswahl und Erfassung relevanter biologischer Daten aus bestimmten Bereichen eines Gewebes ermöglicht. Die TSA-Technologie ermöglicht auch die Visualisierung von Markern mit geringer Häufigkeit und erhöht dadurch die Anzahl potentiell geeigneter Antikörper. Darüber hinaus stellt die Automatisierung des Visualisierungsprotokolls die Reproduzierbarkeit und Qualität des Etikettiervorgangs sicher.

Die Entwicklung eines 3-Plex-IF-Assays erfordert eine sorgfältige Beurteilung der Marker-/Fluorophorsignalintensitäten auf geeigneten Kontrollgeweben. Es wird empfohlen, die Antikörperkonzentrationen zu titrieren, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, was dazu beiträgt, das Durchbluten in benachbarte Kanäle zu minimieren. Darüber hinaus sollte die Epitopstabilität für jeden interessierenden Marker getestet werden, um sicherzustellen, dass das Epitop nicht durch wiederholte Elutionsschritte beeinflusst wird. Sobald die Reihenfolge der Antikörper im Panel bestätigt ist, muss der Assay mit Leave-One-Out-Kontrollen fein abgestimmt werden. Hier wird ein bestimmter Marker im Panel weggelassen und der entsprechende Kanal im aufgenommenen Bild auf Durchbluten und Übersprechen überprüft.

Hier wurde gezeigt, dass TSA-basierte Assays auf der räumlichen Profiling-Plattform abgebildet werden können und dass DAPI-Alternativen für die nukleare Färbung verwendet werden müssen. Wir haben SYTO-Farbstoffe getestet und festgestellt, dass bei der Entscheidung, welcher SYTO-Farbstoff verwendet werden soll, das Signal sorgfältig bewertet werden muss, um ein Durchbluten in benachbarte Kanäle zu vermeiden. Eine weitere Einschränkung der Verwendung von SYTO-Farbstoffen besteht darin, dass einige SYTO-Farbstoffe Photobleichmittel schneller aufhellen, wie z. B. SYTO 64 und SYTO 83 (interne Daten), was die Kernquantifizierung beeinträchtigen könnte. Daher sollte eine Belichtung der verfärbten Objektträger so weit wie möglich vermieden werden. Andere Gruppen haben die Verwendung von SYTO 1311,12 gezeigt, das besser fotostabil ist (interne Daten) und in einem Panel verwendet werden könnte, solange die interessierenden Marker Fluorophoren zugeordnet sind, die mit dem Kernfarbstoff der Wahl kompatibel sind.

Während automatisierte TSA-basierte Fluoreszenzassays in Kombination mit räumlichen Proteomik-Assays gut für die Visualisierung geeignet waren, wurde hier festgestellt, dass die Kombination eines automatisierten 3-plex-Visualisierungsprotokolls mit einem räumlichen Transkriptomik-Protokoll zu einem Verlust des Dynamikbereichs führte, was auf die härteren Protokollbedingungen zurückzuführen sein könnte, zusätzliche Antigen-Retrieval-/Elutionsschritte hinzuzufügen, die die RNA-Integrität beeinträchtigen könnten. Daher sollte das automatisierte 3-Plex-Visualisierungsprotokoll nur für Proteomik-Assays angepasst werden, was eine Einschränkung darstellt und alternative Visualisierungsansätze für RNA-basierte Assays erfordert. Als Alternative zur Visualisierung derselben Folie könnten serielle Abschnitte, die mit interessanten Markern gefärbt sind, überlagert werden, um die ROI-Auswahlzu erleichtern 13. Darüber hinaus beschreibt die Literatur die Verwendung der In-situ-Hybridisierung auf benachbarten Objektträgern, um die ROI-Auswahl zu steuern14. Diese Ansätze könnten jedoch durch die Verfügbarkeit von Gewebe, die Variabilität von Abschnitt zu Abschnitt und Zell-zu-Zell-Registrierungen eingeschränkt sein.

Wir testeten auch die Verwendbarkeit verschiedener ROI-Größen für räumliche Transkriptomik-Assays. Die Verwendung kleiner ROIs von 50 μm ermöglicht es dem Forscher, Daten von bestimmten Regionen zu erfassen, die ein detaillierteres Auslesen ausgewählter Zellen oder Interessengebiete ermöglichen. Einschränkungen bei der Auswahl kleiner ROIs bestehen darin, dass die Anzahl der vorhandenen Zellen möglicherweise nicht groß genug ist, um Zählwerte zu erhalten, die vom Hintergrund unterschieden werden können. Eine Möglichkeit besteht darin, reine Zellpopulationen auszuwählen, um weniger häufige Ziele zu erfassen. Die ROI-Auswahl für einzelne Zellen ist jedoch durch ein hohes Signal-Rausch-Verhältnisbegrenzt 15. Darüber hinaus ist es wichtig, ROI-Größen für die Bibliotheksvorbereitung zu berücksichtigen, wenn unterschiedlich große ROIs in einem einzigen Experiment gesammelt werden. Wenn sich die ROI-Größen signifikant unterscheiden, kann es von Vorteil sein, ROIs entsprechend ihrer Größe zu bündeln und separate Bibliotheken zu erstellen, um zu verhindern, dass große ROIs in einer Bibliothek überrepräsentiert werden. Dadurch wird auch sichergestellt, dass jeder ROI entsprechend seiner Größe eine ausreichende Sequenzierungsabdeckung erhält.

Andere Faktoren, die bei der Durchführung von Spatial Omics-Experimenten zu berücksichtigen sind, sind, dass die Daten aufgrund von Slide-to-Slide-Variabilität Variationen aufweisen können und eine geringere Expression bestimmter Ziele Hintergrund- und Unterschiede in den Korrelationswerten hervorrufen kann. Bei der Planung von Experimenten und der Auswertung von Daten müssen geeignete Kontroll- und Normalisierungsansätze berücksichtigt werden. Für räumliche Proteomik-Assays auf nCounter sind die Normalisierung auf Housekeeping-Targets oder auf die Negativkontroll-IgGs die bevorzugten Methoden nach interner Erfahrung und Herstellerempfehlungen, bei denen die Korrelation zwischen den Housekeeping-Targets oder den Negativkontroll-IgGs bewertet werden muss16. Abhängig von den verwendeten Geweben muss jedoch für jede Studie die beste Normalisierung definiert werden17,18. In der Literatur heißt es beispielsweise, dass GAPDH, das üblicherweise für die Normalisierung auf Haushaltsziele verwendet wird, für Brustkrebs-Spatial Omics-Studien weniger übereinstimmend war als S6 und Histon19. Daher waren S6 und Histon die empfohlenen Ziele für die Normalisierung von Brustkrebsgeweben19.

Für räumliche Transkriptomik-Assays müssen Normalisierungsstrategien in Abhängigkeit vom Studiendesign definiert werden (z. B. Gewebetypen und ROI-Auswahl). Einige Strategien, die in der RNA-Sequenzierung verwendet werden, wie z.B. die Normalisierung des oberen Quartils oder des getrimmten Mittelwerts der M-Werte (TMM), könnten angewendet werden, um sequenzierte Daten zu normalisieren19,20.

Räumliche Transkriptomik-Assays liefern Informationen über Tausende von Zielen und werden immer häufiger verwendet, um das gesamte Transkriptom zu untersuchen, wobei spezifische TME-Kompartimente in Verbindung mit Einzelkern-RNA-Sequenzierung20 oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung21 ausgewählt und analysiert werden. Wir haben gezeigt, dass Visualisierungsprotokolle zur Steuerung der ROI-Auswahl zur Beurteilung der räumlichen Verteilung von Zielen für räumliche Proteomik-Assays automatisiert werden können, nicht jedoch für räumliche Transkriptomik-Assays. Darüber hinaus stellen wir vor, dass ROIs von nur 50 μm gewählt werden können, um eine tiefergehende Untersuchung einer bestimmten Geweberegion zu ermöglichen. Zukünftige Anwendungen dieser Technologie werden das Verständnis der Mikroumgebung des Tumors verbessern.

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Disclosures

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan und Sandra Rost sind Mitarbeitende und Aktionäre von Genentech, einem Unternehmen der Roche-Gruppe. Andere Unternehmen, die zu Roche gehören, stellen Reagenzien und Instrumente her, die in diesem Manuskript verwendet werden. Ciara Martin ist eine Vollzeitangestellte von NanoString Technologies Inc., die Reagenzien und Instrumente herstellt, die in diesem Manuskript verwendet werden.

Acknowledgments

Die Autoren danken Thomas Wu für die Bearbeitung der NGS-Dateien. Wir danken James Ziai für die Ergebnisdiskussionen und die Überprüfung des Manuskripts und Meredith Triplet und Rachel Taylor für die interne Überarbeitung des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris buffered saline (TBS) Cell Signaling Technologies 12498S Diluted to 1x TBS in DEPC treated water
Antibody X (not disclosed) antibody blinded due to confidentiality
DEPC-treated water ThermoFisher AM9922 Another can be used
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) Ventana 950-500
DISCOVERY Cy5 Kit Ventana 760-238 Referred as Cy5
DISCOVERY FAM Kit Ventana 760-243 Referred as FAM
DISCOVERY Goat Ig Block Ventana 760-6008 Referred as Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP Ventana 760-4310 Referred as OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP Ventana 760-4311 Referred as OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G Kit Ventana 760-244 Referred as Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System Ventana 05 987 750 001 / N750-DISU-FS Referred as autostainer on the manuscript
FAP [EPR20021] Antibody Abcam Ab207178
GeoMx Digital Spatial Profiler NanoString GMX-DSP-1Y Referred as spatial profiling platform on the manuscript
Humidity chamber Simport M920-2 Another can be used
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody Abcam Ab27988
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Python Python Statistical analysis
Reaction Buffer (10x) Ventana 950-300
Statistical analysis software GraphPad Prism 7 Statistical analysis
SYTO 64 ThermoFisher S11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana 950-223
Ventana Antibody Diluent with Casein Ventana 760-219 Referred as specified diluent on the manuscript
Ventana Primary antibody dispenser Ventana Catalog number depends on dispenser number

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References

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Räumliches Profiling der Protein- und RNA-Expression im Gewebe: Ein Ansatz zur Feinabstimmung der virtuellen Mikrodissektion
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Ibarra-Lopez, V., Jayakar, S., Yang, Y. A., Martin, C., Modrusan, Z., Rost, S. Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection. J. Vis. Exp. (185), e62651, doi:10.3791/62651 (2022).

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