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Summary
Qui, presentiamo un protocollo di valutazione di un cuore impiantato eterotopicamente dopo la conservazione ex situ normotermica nel modello di ratto.
Abstract
Il trapianto di cuore è la terapia più efficace per l'insufficienza cardiaca allo stadio terminale. Nonostante i miglioramenti negli approcci terapeutici e negli interventi, il numero di pazienti con insufficienza cardiaca in attesa di trapianto è ancora in aumento. La tecnica di conservazione normotermica ex situ è stata stabilita come metodo comparabile alla tecnica convenzionale di conservazione statica a freddo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i cuori dei donatori possono essere conservati fino a 12 ore in condizioni fisiologiche. Inoltre, questa tecnica consente la rianimazione dei cuori dei donatori dopo la morte circolatoria e applica gli interventi farmacologici necessari per migliorare la funzione del donatore dopo l'impianto. Sono stati stabiliti numerosi modelli animali per migliorare le tecniche di conservazione ex situ normotermica ed eliminare le complicazioni legate alla conservazione. Sebbene i modelli animali di grandi dimensioni siano facili da gestire rispetto ai modelli di piccoli animali, è costoso e impegnativo. Presentiamo un modello di ratto di preservazione del cuore del donatore normotermico ex situ seguito da trapianto addominale eterotopico. Questo modello è relativamente economico e può essere realizzato da un singolo sperimentatore.
Introduction
Il trapianto di cuore rimane l'unica terapia praticabile per l'insufficienza cardiaca refrattaria 1,2,3,4. Nonostante un costante aumento del numero di pazienti che necessitano di trapianto di cuore, non è stato osservato un aumento proporzionale della disponibilità di organi donatori5. Per affrontare questo problema, sono stati sviluppati nuovi approcci per preservare i cuori dei donatori con l'obiettivo di migliorare le sfide e aumentare la disponibilità dei donatori 6,7,8,9.
La perfusione cardiaca ex situ normomica (NESHP) utilizzando macchine per sistemi di cura degli organi (OCS) è emersa come intervento clinico 1,3. Questa tecnica è stata ritenuta un'alternativa adeguata al metodo convenzionale di conservazione statica a freddo (SCS) 2,9. NESHP riduce efficacemente la durata dell'ischemia fredda, diminuisce la domanda metabolica e facilita l'apporto nutrizionale ottimale e l'ossigenazione durante il trasporto degli organi dei donatori10,11. Nonostante il chiaro potenziale di questo metodo per migliorare la conservazione degli organi dei donatori, la sua applicazione clinica e ulteriori indagini sono state limitate dai costi elevati. Pertanto, i modelli animali preclinici di NESHP sono cruciali per identificare le principali sfide tecniche associate a questa tecnica12,13. Suini e ratti sono i modelli animali preferiti per gli studi preclinici a causa della loro tolleranza ischemica9. Sebbene il modello suino sia ideale per la ricerca di base e traslazionale, è limitato dal suo alto costo e dal lavoro intensivo richiesto per la cura e la manutenzione. Al contrario, i modelli di ratto sono meno costosi e più facili da gestire14.
In questo studio, introduciamo un modello semplificato di ratto di NESHP, seguito da trapianto di cuore eterotopico, per valutare l'impatto della tecnica di conservazione sulla condizione del trapianto post-impianto. Questo modello è semplice, economico e può essere eseguito da un singolo sperimentatore. Nella Figura 1 vengono illustrati gli schemi della procedura.
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Protocol
Il comitato etico del Centro di ricerca sugli animali da laboratorio dell'ospedale universitario nazionale di Chonnam (approvazione n. CNU IACUC - H - 2022-36) ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali. I ratti maschi di Sprague-Dawley (350-450 g), utilizzati in questo studio, hanno ricevuto cure in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. I ratti sono stati alloggiati in stanze a temperatura controllata con un ciclo luce-buio di 12 ore, con cibo e acqua standard disponibili.
1. Preparazione
NOTA: un singolo sperimentatore può condurre tutte le procedure sperimentali.
- Assemblare l'apparecchiatura Langendorff, comprese le linee di ossigenatore, pompa e perfusione, prima dell'intervento chirurgico (Figura 2). Riempire il circuito di perfusione con 20 ml di soluzione salina e farlo circolare fino a quando non viene innescato con sangue autologo.
NOTA: L'obiettivo di questo passaggio è quello di riscaldare il circuito extracorporeo. - Collegare la linea cardioplegica al circuito tramite il rubinetto di arresto collegato alla cannula aortica e preparare la pompa a siringa per l'infusione cardioplegica finale.
NOTA: Assicurarsi di rimuovere eventuali bolle d'aria dal circuito di perfusione e dalla linea cardioplegica. - Posizionare il sensore di temperatura all'interno del serbatoio in cui verrà conservato il cuore del donatore, mantenendo la temperatura del circuito a 37 °C.
- Preparazioni chirurgiche
- Preparare un set separato di micro-strumenti e materiali sterili per ciascun ratto donatore e ricevente.
- Preparare il set chirurgico per il donatore: paio di forbici chirurgiche, paio di micropinze, pinze per zanzare affilate, suture di seta 5-0, tamponi di cotone, siringa da 50 ml, linea di perfusione per la soluzione cardioplegica (CPS), pompa a siringa, angiocatetere da 18 G, un set di cateteri femorali da 5 Fr. e garze sterili.
- Preparare il set chirurgico per il ricevente: forbici microchirurgiche, divaricatore della ferita, coppia di micro pinze, pinze per zanzare, micro morsetti vascolari, siringa da 1 ml, una sutura in polipropilene 5-0 e 9-0, suture di seta 5-0, tamponi di cotone e garze sterili.
- Preparare un set separato di micro-strumenti e materiali sterili per ciascun ratto donatore e ricevente.
2. Conservazione del cuore del donatore e raccolta del sangue
- Indurre l'anestesia nel ratto donatore con isoflurano (5%) nella camera di anestesia e registrare il peso del ratto prima di posizionarlo sul tavolo chirurgico.
- Posizionare il ratto in posizione supina sul lettino chirurgico e somministrare l'anestesia continua somministrando isoflurano al 2% -2,5% con ossigeno al 90% attraverso un nosecone.
- Verificare la profondità dell'anestesia controllando la mancanza di risposta al pizzico del piede e la frequenza del respiro, che dovrebbe essere compresa tra 50-60 al minuto.
NOTA: Un livello adeguato di anestesia è fondamentale per evitare stress e dolore inutili al ratto donatore. - Applicare lubrificante per gli occhi e radere la regione pubica alla clavicola, dove verrà eseguito l'intervento chirurgico. Pulire l'area con uno scrub a base di iodio e alcool al 70%.
- Cateterismo
- Fare un'incisione addominale della linea mediana di 7 cm e incisioni bilaterali di 3 cm dal processo xifoideo alla clavicola media. Rimuovere la pelle dalla regione toracica.
- Usando tamponi di cotone, mobilitare gli organi addominali sul lato sinistro dell'addome. Isolare l'aorta addominale dalla fascia retroperitoneale e dai tessuti adiposi.
- Iniettare 1.000 UI di eparina sciolta in 0,3 mL di soluzione salina isotonica attraverso la vena cava inferiore (IVC) utilizzando una siringa da 1 ml. Interrompere qualsiasi sanguinamento dal foro dell'ago comprimendo delicatamente con un batuffolo di cotone.
NOTA: Prestare attenzione all'embolia aerea durante l'iniezione, poiché può portare ad arresto cardiaco. - Inserire un catetere femorale 5 Fr. nell'aorta addominale (Abd. A). Assicurarsi che la punta del catetere raggiunga l'arco aortico. Confermare la posizione del catetere valutando la lunghezza approssimativa della parte inserita del catetere.
- Raccolta del sangue
- Raccogliere circa 10 ml di sangue attraverso il catetere inserito nell'Abd.
- Successivamente, diluire il sangue di priming con soluzione salina isotonica fino a quando il volume totale raggiunge i 12 ml. Aggiungere 5 mg di cefazolina sciolta in 0,3 ml di soluzione salina e insulina (20 UI).
- Arresto cardiaco
- Collegare la linea di perfusione CPS precedentemente preparata al catetere addominale e iniziare la somministrazione di CPS con la pompa a siringa ad una velocità di 800 ml/h.
- Aprire la cavità toracica dal diaframma e tagliare l'IVC vicino al diaframma per prevenire la distensione ventricolare. Tagliare le costole bilateralmente lungo la colonna vertebrale toracica fino all'ingresso toracico. Riflettere la parete toracica ventrale mobilizzata superiormente con una pinza per zanzare.
- Rimuovere completamente il timo utilizzando micro pinze per visualizzare l'arco aortico. Applicare una leggera compressione se le arterie timiche sanguinano.
- Estrazione
- Dopo aver somministrato tutto il CPS, isolare l'arco aortico dai tessuti circostanti. Sezionare attentamente appena sotto l'arteria succlavia sinistra.
- Transetto le arterie carotidi brachiocefaliche e sinistra comune in una posizione distante, lasciando i monconi più lunghi dell'arco aortico per una facile manipolazione durante l'incannulamento dell'aorta. Transettare l'arteria polmonare principale (MPA) il più vicino possibile alla biforcazione. Fare attenzione a non danneggiare l'appendice atriale sinistra.
- Applicare con cura la vena cava superiore (SVC) e l'IVC con suture di seta 5-0, evitando l'ostruzione dell'atrio destro (RA) e del seno coronarico. Coprire i margini sinistri del torace con una garza bagnata, posizionare il cuore su di esso e ritrarre delicatamente le legature SVC e IVC per esporre l'ilo.
- Ligare le vene polmonari e azygos insieme a una sutura di seta 5-0. Recidere il tessuto dorsale alla legatura ed estrarre il cuore. Esaminare il cuore per eventuali lesioni. Infine, pesare il cuore prima dell'incannulamento aortico.
3. Perfusione ex situ
- Incannulamento e perfusione dell'aorta
- Prima dell'incannulamento dell'aorta, sostituire il circuito salino con l'adescamento del sangue.
- Inserire la cannula aortica nell'arco aortico e fissarla con un micro morsetto temporaneo. Assicurarsi che la punta della cannula sia posizionata sulla giunzione brachiocefalica.
- Confermare la corretta posizione della cannula afferrando delicatamente l'aorta con micro pinze.
- Avviare la perfusione con una portata di 2-3 ml/min, consentendo al perfusato di fuoriuscire dal sito di incannulamento per rimuovere eventuali bolle d'aria.
- Monitorare la pressione e la temperatura di perfusione attraverso il sensore collegato al sistema di monitoraggio.
- Massaggiare delicatamente il cuore con il primo e l'indice fino a quando il sangue venoso fuoriesce dall'arteria polmonare principale (MPA).
- Fissare l'aorta con una legatura di seta 1-0 e rimuovere il morsetto dopo aver verificato tutte le impostazioni (circuito di perfusione, pressione di perfusione, temperatura).
- Una volta posizionata la legatura permanente, assicurarsi che il cuore inizi a contrarsi entro pochi secondi e raggiunga il ritmo normale in 60 secondi. Una pressione media di perfusione di 55-65 mmHg con una portata coronarica di 3-4 ml a 37 °C indica una perfusione adeguata.
- Raccogliere 0,15 ml di sangue dal serbatoio e controllare l'emogasanalisi (BGA) all'inizio della perfusione e successivamente ogni 20 minuti. Monitorare e registrare pH, pCO 2, pO2, glucosio, ematocrito, potassio e lattato durante la perfusione. Dopo 120 minuti di perfusione, somministrare 3 ml di Custodiol attraverso la pompa a siringa ad una velocità di 250 ml/h per arrestare il cuore.
4. Impianto
- Preparazione del destinatario
- Iniziare la preparazione del ricevente 30 minuti prima della cessazione della perfusione ex situ .
- Anestetizzare l'animale ricevente con lo stesso metodo indicato al punto 2.2.
- Posizionare il ratto in posizione supina sulla piastra riscaldante e inserire la sonda di temperatura nel retto per mantenere la temperatura corporea a 37 °C.
- Applicare lubrificante per gli occhi, radere il pube sulla zona epigastrica e pulire l'area con uno scrub a base di iodio e alcool al 70%.
- Farmaci
- Iniettare 2 ml di soluzione salina calda per via sottocutanea per compensare il liquido perso durante l'intervento. Iniettare 200 UI di eparina per via sottocutanea.
- Somministrare profilassi antibiotica iniettando 10 mg/kg di cefazolina sciolta in 0,3 mL di soluzione salina per via sottocutanea o intramuscolare.
- Somministrare il controllo del dolore iniettando 20 mg/kg di diclofenac per via sottocutanea.
- Eseguire la laparotomia della linea mediana e inserire un divaricatore per allargare la cavità addominale. Mobilitare gli organi addominali sul lato sinistro del destinatario usando tamponi di cotone per fare spazio alla procedura.
- Prevenire la disidratazione avvolgendo gli organi addominali con una garza calda e bagnata. Distribuire abbondantemente soluzione salina calda con una siringa da 50 ml durante l'intervento.
- Utilizzando un microscopio chirurgico con un ingrandimento 10x, mobilitare il duodeno e il digiuno prossimale mediante dissezione smussata con tamponi di cotone per esporre l'Abd. A. e IVC. Preparare l'Abd. A e IVC per anastomosi e impiantare sistematicamente il cuore del donatore, in conformità con la Figura 3 o metodi precedentemente documentati15.
NOTA: Non separare l'Abd. A. e l'IVC.- Supponendo che l'anastomosi vascolare sia posizionata per via infrarenale, preparare una porzione sufficiente dell'aorta e dell'IVC per il bloccaggio.
- Eseguire una preparazione smussata utilizzando tamponi di cotone o pinze seghettate per rimuovere i grassi e la fascia intorno ai vasi.
- Posizionare legature di seta 5-0 ai rami mesenterici e ai lati cranico e caudale dei vasi principali. Elevare i vasi addominali e coagulare o legare i rami lombari con suture di seta 5-0. Ricorda di risparmiare le arterie e le vene testicolari e di non bloccarle.
- Utilizzare legature per sollevare i vasi e posizionare i micro-morsetti ai rami mesenterici, caudali e cranici dei vasi principali per fermare il flusso sanguigno nel sito di anastomosi. Spegnere la piastra riscaldante prima di posizionare i morsetti, poiché il riscaldamento eccessivo può esacerbare l'ischemia degli arti. Assicurarsi di accendere la piastra riscaldante dopo aver sbloccato i vasi per evitare l'ipotermia.
- Forare l'aorta con un ago da 27 G e allungare l'incisione con micro forbici ad una lunghezza uguale o leggermente maggiore dell'apertura dell'aorta ascendente del donatore (Asc. A), che è di circa 5 mm.
- Fare un'incisione longitudinale sull'IVC allo stesso modo dell'aortotomia, ma renderla 3 mm più vicina al lato caudale rispetto all'incisione dell'aorta.
- Iniziando le anastomosi, posizionare il cuore del donatore sul lato destro dell'addome del ricevente e attaccare il donatore Asc. A all'Abd del destinatario. A con un semplice punto interrotto (polipropilene 9-0) all'angolo cranico dell'incisione longitudinale.
- Spostare il cuore sul lato sinistro dell'addome ricevente ed eseguire l'anastomosi dell'Asc del donatore. A con l'Abd del destinatario. A utilizzando una sutura in polipropilene 9-0 in esecuzione.
- Fissare l'arteria polmonare del donatore all'IVC con due suture interrotte (polipropilene 9-0) agli angoli caudale e cranico dell'incisione longitudinale.
- Eseguire la prima metà dell'anastomosi venosa dal lato intraluminale della nave e completare la seconda metà dal lato extraluminale della nave. Prima di stringere i nodi, sciacquare il campo con soluzione salina per prevenire l'embolia aerea.
- De-airing e de-clamping
- Rimuovere il morsetto della vena mesenterica prima dopo aver completato l'anastomosi per consentire al lato destro del cuore di riempirsi di sangue venoso.
- Rimuovere l'aria nel circuito coronarico e Asc. A. applicando la perfusione coronarica retrograda per alcuni secondi.
- Posizionare un pezzo di garza su entrambi i lati dei vasi e rimuovere il morsetto caudale e il morsetto cranico.
- Applicare una leggera compressione con tamponi di cotone per 1-2 minuti. Dopo aver assicurato un'adeguata emostasi, rimuovere i tamponi e lavare le anastomosi con soluzione salina calda.
NOTA: Il cuore dovrebbe iniziare a battere entro il primo minuto di riperfusione. Se la temperatura corporea del ratto ricevente è inferiore a 35 °C, il ritmo cardiaco si normalizzerà dopo che la temperatura raggiunge i 36 °C.
- Sostituire gli organi addominali in modo simile a un meandro e chiudere gli strati dell'incisione addominale utilizzando suture continue in polipropilene 5-0.
- Dopo l'intervento, posizionare l'animale anestetizzato su un'area pulita su una piastra elettrica fino a quando la temperatura corporea raggiunge i 37 ° C.
NOTA: Non iniziare gli esami postoperatori fino a quando la temperatura corporea non raggiunge i 37°C. Mantenere l'anestesia al 2-2,5% di isoflurano fino alla fine degli esperimenti. - Monitorare l'ECG del cuore del donatore trapiantato per 3 ore. Quindi, asportare il cuore in anestesia profonda per studi istologici.
NOTA: Confermare la profondità dell'anestesia attraverso la mancanza di riflesso del pedale prima di asportare il cuore. La procedura chirurgica e il monitoraggio ECG richiedono meno di 6 ore. Diclofenac, somministrato perioperatoriamente (fase 4.2.3.), consente la gestione del dolore per l'intera durata di questa procedura. Il regime di analgesia può essere regolato secondo le linee guida istituzionali sull'uso degli animali.
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Representative Results
La Figura 1 illustra il disegno sperimentale utilizzato in un modello animale di piccole dimensioni. La figura 2 mostra l'apparato di perfusione Langendorff modificato, che include un piccolo ossigenatore animale. L'ordine di anastomosi per l'impianto addominale eterotopico è presentato in Figura 3.
La figura 4 mostra i parametri utilizzati per valutare la vitalità del cuore durante la perfusione ex situ , come lattato, potassio e pressione aortica media. In questo studio, l'uso della conservazione ex situ normotermica ha ridotto il tempo ischemico totale di sei casi riusciti a 46,2 ± 4,7 minuti, mentre il tempo totale fuori dal corpo è stato di 166,2 ± 4,7 minuti (Figura 5). L'estrazione del cuore dal donatore e la preparazione per la perfusione ex situ e il trapianto eterotopico hanno richiesto 5,8 ± 1,3 minuti, come mostrato nella Figura 5. Il tasso di successo complessivo dell'intervento chirurgico è stato del 70% e il tempo medio di anastomosi dei sei casi riusciti è stato di 38,4 ± 3,4 minuti. In tutti gli esperimenti, la frequenza cardiaca è diminuita significativamente immediatamente dopo l'impianto, ma alla fine si è ripresa nel tempo, come illustrato nella Figura 6. La struttura grossolana dei cuori dei donatori è stata ben conservata dopo la conservazione ex situ e l'impianto eterotopico, senza danni visibili rilevati. Tuttavia, la colorazione dell'ematossilina-eosina ha rivelato un aumento del numero di cellule infiammatorie, per lo più neutrofili, dopo 3 ore di impianto eterotopico (Figura 7).
Figura 1: Disegno sperimentale della conservazione normotermica ex situ del cuore con trapianto di cuore eterotopico. Abbreviazioni: BGA = emogasanalisi, CPS = soluzione cardioplegica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Schemi della conservazione ex situ del cuore di piccoli animali modificati. Abbreviazioni: sensore BP = sensore di pressione sanguigna, CPS = soluzione cardioplegica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: L'ordine di anastomosi nel trapianto di cuore eterotopico . (A) Schemi della posizione del cuore del donatore nell'addome ricevente e ordine di anastomosi. (B) Anastomosi dell'aorta ascendente del donatore e dell'aorta addominale ricevente. (C) Anastomosi IVC dell'arteria polmonare del donatore e del ricevente. Abbreviazioni: LV = ventricolo sinistro, RV = ventricolo destro, LA = atrio sinistro, MPA = arteria polmonare principale, IVC = vena cava inferiore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Parametri per la valutazione della vitalità durante la perfusione ex situ. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Cronologia della conservazione dei sei cuori conservati con successo. Estrazione cardiaca e facilitazione della perfusione ex situ: 5,8 ± 1,3 min. Perfusione ex situ : 120 min. Impianto nell'addome del ratto ricevente: 38,4 ± 3,4 min. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Le prestazioni elettrofisiologiche del cuore del donatore prima dell'approvvigionamento e dopo l'impianto . (A) Variazioni della frequenza cardiaca. Pre-raccolta, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min: i tempi dopo l'impianto. (B) Immagini elettrocardiografiche prima del prelievo cardiaco del donatore e dopo 3 ore di impianto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Aspetto macroscopico (A-C) e microscopico (D-F) del cuore del donatore. (A,D) Prima della conservazione ex situ normotermica. (B,E) Dopo la conservazione ex situ normotermica. (C,F) Dopo 2 ore di impianto eterotopico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il nostro obiettivo nello stabilire questo modello era quello di replicare il trapianto di cuore umano normotermico. I modelli non espulsivi sono la tecnica comunemente preferita per preservare il cuore del donatore in un ambiente ex situ 16. Mentre i modelli di espulsione offrono molti vantaggi nella valutazione della funzione cardiaca durante la perfusione ex situ 17, non sono adatti per i modelli di trapianto eterotopico. Nel trapianto eterotopico, il cuore del donatore impiantato deve superare la pressione sistolica di postcarico creata dal cuore ospite nel sistema circolatorio ricevente, portando a prestazioni cardiache limitate del donatore e sottostima nella valutazione18. Pertanto, i modelli non espulsivi sono più favorevoli nel trapianto eterotopico. Nei modelli non espulsivi, il cuore del donatore è perfuso ma non supporta la circolazione del ricevente, limitando significativamente la valutazione delle prestazioni del cuore. Le valutazioni morfologiche e molecolari, come la colorazione istologica e l'analisi della macchia, possono essere utili per esaminare le condizioni cardiache del donatore quando le valutazioni funzionali sono limitate. Inoltre, i marcatori metabolici possono essere valutati utilizzando tecnologie avanzate, come la tomografia ad emissione di positroni (PET) o la risonanza magnetica (MRI)19. Questo modello può essere utile per testare l'efficacia a lungo termine degli interventi farmacologici e genetici prima dell'impianto.
Numerosi gruppi di ricerca hanno sviluppato un modello di conservazione ex situ normotermica, che è stato impiegato con successo per conservare i cuori suini fino a 12 ore6. Tuttavia, la manutenzione di modelli animali di grandi dimensioni può essere proibitiva dal punto di vista dei costi per i piccoli laboratori, in quanto comporta spese sostanziali e richiede un numero considerevole di personale addestrato. Per affrontare questo problema, proponiamo un metodo di conservazione ex situ meno costoso e tecnicamente semplice, che prevede l'uso di sangue autologo seguito da trapianto di cuore eterotopico. In particolare, il costo di un singolo esperimento utilizzando il nostro modello è di circa $ 300. Sebbene non esista un modello animale di piccole dimensioni equivalente per confrontare i costi, l'apparato di perfusione ex situ per animali di grandi dimensioni, se usato una volta, può costare fino a $ 30.00016.
Il protocollo presentato dimostra che tutte le procedure sperimentali possono essere eseguite in modo graduale da un singolo sperimentatore (Figura 3). La possibilità di impianto eterotopico dopo la conservazione ex situ è un altro vantaggio di questo modello. Anninnando l'aorta discendente del cuore donatore per la perfusione ex situ , siamo stati in grado di risparmiare la parte ascendente senza causare alcun danno. Inoltre, abbiamo modificato il circuito Langendorff, riducendo la quantità di soluzione di perfusione necessaria a 12 ml per un'efficace perfusione cardiaca. Il sangue di perfusione è stato ottenuto dal ratto donatore prima della raccolta, permettendoci di preservare il cuore con il proprio sangue ed evitare qualsiasi reazione immunologica durante la conservazione.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Si raccomanda il circuito di perfusione ex situ per mantenere una pressione media di postcarico nell'intervallo 50-70 mmHg. La pressione è determinata da vari fattori, tra cui il flusso di perfusione, la resistenza dell'arteria coronaria e la viscosità del perfusato20. La resistenza arteriosa coronarica è suscettibile alle fluttuazioni dovute alle variazioni di temperatura e pH, quindi è fondamentale mantenere questi parametri entro il range di normalità. Il flusso di perfusione richiesto varia per ogni esperimento e dipende dal flusso necessario per mantenere la pressione di perfusione desiderata. Tipicamente, un flusso di 3-4 ml/min (equivalente a 5-6 giri/min per la nostra pompa) è sufficiente per un cuore di ratto da 350-450 g. Il livello di ematocrito è un determinante della viscosità del perfusato21. Per il nostro circuito, l'intervallo ottimale di ematocrito è compreso tra il 25% e il 30%. Nonostante l'utilizzo del più piccolo ossigenatore sperimentale, l'ampia superficie di scambio gassoso di 0,05 m2 per un volume di perfulato di 12 ml può portare all'evaporazione e alla conseguente perdita di fluido nel tempo. Questa perdita di fluido può essere corretta con l'aggiunta di acqua distillata secondo necessità. Non è consigliabile aggiungere soluzione salina o suoneria al perfuffato, in quanto possono causare ipernatriemia. La concentrazione di glucosio perfusato deve essere mantenuta a 100-150 mg/dL.
È fondamentale evitare l'aritmia durante la perfusione in quanto indica il deterioramento di uno o più parametri fisiologici dell'ambiente ex situ 10. La tachiaritmia o la fibrillazione ventricolare sinistra sono comunemente associate a vari fattori, come squilibrio elettrolitico, basso ematocrito, acidosi / alcalosi, ipertermia e postcarico eccessivo. D'altra parte, la bradiaritmia è causata principalmente dall'ipotermia. Lattato e potassio sono i parametri chiave nella valutazione della vitalità miocardica. Livelli elevati di lattato (>5 mmol/L) e iperkaliemia (>5,0 mg/dL) indicano un grado sostanziale di danno miocardico22.
L'attento monitoraggio del dosaggio dell'anestesia e dei modelli di respirazione del ratto ricevente è fondamentale durante le procedure chirurgiche. Poiché gli animali non sono ventilati, la somministrazione continua di anestesia eccessiva può portare a ipoventilazione e fallimento. La laparotomia totale e l'estrazione degli organi addominali provocano una significativa perdita di calore, che può ulteriormente deteriorare le condizioni del ricevente. Pertanto, l'uso di un regolatore di temperatura dotato di una piastra riscaldante e di una sonda di temperatura è fondamentale per mitigare l'impatto della perdita di calore e mantenere una temperatura corporea stabile.
Passaggi critici
Le fasi critiche della procedura chirurgica comprendono la dissezione dell'arco aortico e dell'MPA, l'incannulamento aortico per la perfusione ex situ, la de-aerazione prima della perfusione ex situ e la de-aerazione prima di rimuovere i morsetti dopo l'impianto. Questi passaggi sono altamente vulnerabili e sono spesso associati a un fallimento. Tuttavia, la chiave per superare queste sfide sta nell'identificare la tecnica appropriata e acquisire una pratica sufficiente. Durante l'isolamento dei vasi nel ricevente, particolare attenzione deve essere prestata all'uretere destro, che si trova in prossimità dell'IVC nello spazio retroperitoneale e può imitare il dotto linfatico. Nel contesto dell'anastomosi venosa, si raccomanda di fissare prima l'estremità caudale utilizzando suture di soggiorno seguite dall'estremità cranica per prevenire lacrimazione e stenosi. Ciò è particolarmente importante a causa della natura relativamente fragile delle vene rispetto all'aorta.
Limitazioni
Le procedure chirurgiche coinvolte in questo esperimento sono considerevolmente complesse, in particolare quando si ottiene il cuore del donatore e si perfonde il sangue dallo stesso animale. Le valutazioni funzionali post-impianto sono limitate in quanto abbiamo utilizzato un modello non espulso. Si ritiene che un modello di espulsione fornisca risultati più avanzati in un ambiente ex situ . Tuttavia, nel trapianto eterotopico, è limitato a causa della presenza di un cuore ospite di supporto nel sistema circolatorio.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione B2021-0991 del Chonnam National University Hospital Biomedical Research Institute e NRF-2020R1F1A1073921 dalla National Research Foundation of Korea
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AES active evacuation system | Smiths medical | PC-6769-51A | Utilize CO2 and excess isoflurane |
| Anesthesia machine | Smiths medical | PC-8801-01A | Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal |
| B20 patient monitor | GE medical systems | B20 | to observe mean aortic pressure and temperature |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard apparatus | 55-7020 | To monitor and maintain animal's temperature |
| Micro-1 Rat oxygenator | Dongguan Kewei medical instruments | Micro-MO | For gas exchange in the langendorff circuit |
| Micropuncture introducer Set | COOK medical | G48007 | for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta |
| Microscope | Amscope | MU1403 | For zooming surgical field (Recipient) |
| Surgical loupe | SurgiTel | L2S09 | For zooming surgical field (Donor) |
| Syringe pump | AMP all | SP-8800 | To deliver cardioplegic solution |
| Transonic flow sensor | Transonic | ME3PXL-M5 | Perfusion circuit flow sensor |
| Transonic tubing flow module | Transonic | TS410 | flow acquiring system |
| Watson - Marlow pumps | Harvard apparatus | 010.6131.DAO | Peristaltic pump used for recirculate perfusate |
| WBC-1510A | JEIO TECH | E03056D | Heating bath |
| Sprague-Dawley rats | Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea | ||
| Medications | |||
| BioHAnce Gel Eye Drops | SENTRIX Animal care | wet ointments for eye | |
| Cefazolin | JW pharmaceutical | For prophilaxis | |
| Custodiol | DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH | For heart harvesting | |
| Diclofenac | Myungmoon Pharm. Co. Ltd | For pain control | |
| Heparin | JW pharmaceutical | Anticoagulant | |
| Insulin | JW pharmaceutical | hormon therapy | |
| Saline | JW pharmaceutical | For hydration therapy |
References
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Medicina Numero 194Erratum
Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 08/28/2023.
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An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.
Section 4 of the Protocol was updated from:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
to:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
- After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C.
NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments. - Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
