Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Råttmodell av normothermisk ex-situ perfuserad heterotopisk hjärttransplantation

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64954
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3, 2, 2,3, 4, 5, 3,6
1Department of Medical Science, Chonnam National University Graduate School, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 3Cardiovascular and Respiratory Research Team, Chonnam National University Hospital, 4Department of Internal Medicine, Chonnam National University Hospital and Medical School, 5Departments of Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 6Department of Pediatrics, Chonnam National University Children’s Hospital, and Medical School
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Här presenterar vi ett bedömningsprotokoll av ett heterotopiskt implanterat hjärta efter normotermisk ex situ-konservering i råttmodellen.

Abstract

Hjärttransplantation är den mest effektiva behandlingen för hjärtsvikt i slutstadiet. Trots förbättringarna i terapeutiska metoder och interventioner ökar antalet hjärtsviktspatienter som väntar på transplantation fortfarande. Den normotermiska ex situ-konserveringstekniken har etablerats som en jämförbar metod med den konventionella statiska kyllagringstekniken. Den största fördelen med denna teknik är att donatorhjärtan kan bevaras i upp till 12 timmar i ett fysiologiskt tillstånd. Dessutom möjliggör denna teknik återupplivning av donatorhjärtan efter cirkulationsdöd och tillämpar nödvändiga farmakologiska ingrepp för att förbättra givarfunktionen efter implantation. Många djurmodeller har etablerats för att förbättra normotermiska ex situ-konserveringstekniker och eliminera konserveringsrelaterade komplikationer. Även om stora djurmodeller är lätta att hantera jämfört med små djurmodeller är det dyrt och utmanande. Vi presenterar en råttmodell av normotermiskt ex situ-donatorhjärtbevarande följt av heterotopisk buktransplantation. Denna modell är relativt billig och kan åstadkommas av en enda experimenter.

Introduction

Hjärttransplantation är fortfarande den enda livskraftiga behandlingen för eldfast hjärtsvikt 1,2,3,4. Trots en stadig ökning av antalet patienter i behov av hjärttransplantation har en proportionell ökning av tillgången på donerade organ inte observerats5. För att ta itu med denna fråga har nya metoder för att bevara donatorhjärtan utvecklats med målet att förbättra utmaningarna och öka tillgången på givare 6,7,8,9.

Normothermic ex situ hjärtperfusion (NESHP) med hjälp av organvårdssystem (OCS) maskiner har uppstått som en klinisk intervention 1,3. Denna teknik har ansetts vara ett lämpligt alternativ till konventionell statisk kyllagring (SCS) metod 2,9. NESHP minskar effektivt varaktigheten av kall ischemi, minskar metabolisk efterfrågan och underlättar optimal näringstillförsel och syresättning under transport av donatororgan10,11. Trots den tydliga potentialen hos denna metod för att förbättra bevarandet av donatororgan har dess kliniska tillämpning och ytterligare undersökningar begränsats av höga kostnader. Därför är prekliniska djurmodeller av NESHP avgörande för att identifiera viktiga tekniska utmaningar i samband med denna teknik12,13. Grisar och råttor är de djurmodeller som föredras för prekliniska studier på grund av deras ischemiska tolerans9. Även om svinmodellen är idealisk för grundforskning och translationell forskning, begränsas den av dess höga kostnader och det intensiva arbete som krävs för vård och underhåll. Däremot är råttmodeller billigare och lättare att hantera14.

I denna studie introducerar vi en förenklad råttmodell av NESHP, följt av heterotopisk hjärttransplantation, för att utvärdera effekten av konserveringstekniken på transplantattillstånd efter implantation. Denna modell är enkel, kostnadseffektiv och kan köras av en enda experimenter. Figur 1 visar schemat för proceduren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den etiska kommittén för Laboratory Animal Research Center vid Chonnam National University Hospital (godkännande nr. CNU IACUC - H - 2022-36) godkände alla djurförsök. Hanråttor av typen Sprague-Dawley (350-450 g) som användes i denna studie fick vård i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjuren. Råttorna hölls i temperaturkontrollerade rum med en 12 timmars ljus-mörk cykel, med standardmat och vatten tillgängligt.

1. Förberedelse

OBS: En enda experimenter kan utföra alla experimentella procedurer.

  1. Montera Langendorff-apparaten, inklusive oxygenatorn, pumpen och perfusionsledningarna, före operationen (figur 2). Fyll perfusionskretsen med 20 ml saltlösning och cirkulera den tills den är grundad med autologt blod.
    OBS: Målet med detta steg är att värma den extrakorporeala kretsen.
  2. Fäst den kardioplegiska ledningen till kretsen via stoppkranen fäst vid aortakanylen och förbered sprutpumpen för den slutliga kardioplegiska infusionen.
    OBS: Se till att eventuella luftbubblor avlägsnas från perfusionskretsen och den kardioplegiska linjen.
  3. Placera temperatursensorn i behållaren där givarhjärtat ska förvaras och håll kretsens temperatur vid 37 °C.
  4. Kirurgiska preparat
    1. Förbered en separat uppsättning sterila mikroinstrument och material för varje donator- och mottagarråtta.
      1. Förbered den kirurgiska uppsättningen för givaren: par kirurgiska saxar, par mikropincett, skarpa myggpincett, 5-0 silkesuturer, bomullspinne, 50 ml spruta, perfusionslinje för kardioplegisk lösning (CPS), sprutpump, 18 G angiokateter, en uppsättning 5 Fr. lårbenskatetrar och sterila gasbindor.
      2. Förbered den kirurgiska uppsättningen för mottagaren: mikrokirurgisk sax, sårupprullare, par mikropincett, myggpincett, vaskulära mikroklämmor, 1 ml spruta, en 5-0 och 9-0 polypropensuturer, 5-0 silkesuturer, bomullspinne och sterila gasbindor.

2. Bevarande av donatorhjärta och blodinsamling

  1. Inducera anestesi hos donatorråtta med isofluran (5%) i anestesikammaren och registrera råttans vikt innan den läggs på operationsbordet.
  2. Placera råttan i ryggläge på operationsbordet och administrera kontinuerlig anestesi genom att leverera 2% -2,5% isofluran med 90% syre genom en noskon.
  3. Kontrollera anestesidjupet genom att kontrollera bristen på svar på tånypningen och andningsfrekvensen, som bör vara mellan 50-60 per minut.
    OBS: En adekvat nivå av anestesi är avgörande för att undvika onödig stress och smärta för donatorråttan.
  4. Applicera ögonsmörjmedel och raka regionen pubis till clavicula, där operationen kommer att utföras. Rengör området med en jodbaserad skrubba och 70% alkohol.
  5. Kateterisering
    1. Gör ett 7 cm mittlinjesnitt i buken och bilaterala snitt som mäter 3 cm från xiphoidprocessen till mittnyckelbenet. Ta bort pälsen från bröstregionen.
    2. Använd bomullspinne, mobilisera bukorganen till vänster sida av buken. Isolera buken aorta från retroperitoneal fascia och fettvävnader.
    3. Injicera 1 000 IE heparin upplöst i 0,3 ml isoton saltlösning genom den sämre vena cava (IVC) med en 1 ml spruta. Stoppa blödning från nålhålet genom att försiktigt komprimera med en bomullspinne.
      OBS: Var försiktig med luftemboli under injektionen, eftersom det kan leda till hjärtstillestånd.
    4. Sätt in en 5 Fr. lårbenskateter i bukaortan (Abd. A). Se till att kateterspetsen når aortabågen. Bekräfta kateterns placering genom att bedöma den ungefärliga längden på den införda delen av katetern.
  6. Insamling av blod
    1. Samla cirka 10 ml blod via katetern som sätts in i Abd. A.
    2. Senare späd primingblodet med isotonisk saltlösning tills den totala volymen når 12 ml. Tillsätt 5 mg cefazolin upplöst i 0,3 ml saltlösning och insulin (20 IE).
  7. Hjärtstillestånd
    1. Anslut den tidigare förberedda CPS-perfusionsslangen till bukkatetern och starta CPS-administreringen med sprutpumpen med en hastighet av 800 ml/h.
    2. Öppna brösthålan från membranet och skär IVC nära membranet för att förhindra ventrikulär distans. Skär revbenen bilateralt längs bröstryggen upp till bröstkorgsinloppet. Reflektera den mobiliserade ventrala bröstväggen överlägset med myggpincett.
    3. Ta bort tymus helt med hjälp av mikropincett för att visualisera aortabågen. Applicera ljuskompression om tymartärer blöder.
  8. Extraktion
    1. Efter administrering av alla CPS, isolera aortabågen från de omgivande vävnaderna. Dissekera försiktigt strax under den vänstra subklaviska artären.
    2. Transektera brakiocefaliska och lämnade gemensamma halspulsåder i en avlägsen position, vilket lämnar de längre stubbarna i aortabågen för enkel hantering under aortakannulation. Transektera huvudlungartären (MPA) så nära bifurkationen som möjligt. Var försiktig så att du inte skadar vänster förmaksbilaga.
    3. Ligera försiktigt överlägsen vena cava (SVC) och IVC med 5-0 silkesuturer, vilket förhindrar obstruktion av höger atrium (RA) och koronar sinus. Täck bröstkorgens vänstra marginaler med våt gasväv, placera hjärtat på det och dra försiktigt tillbaka SVC- och IVC-ligaturerna för att exponera hilum.
    4. Ligate lung- och azygosvenerna tillsammans med en 5-0 silkesutur. Skär av vävnaden dorsal till ligaturen och extrahera hjärtat. Undersök hjärtat för eventuella skador. Slutligen, väg hjärtat före aorta cannulation.

3. Ex situ-perfusion

  1. Aorta kanylering och perfusion
    1. Innan aorta cannulation, byt ut den saltlösningsgrundade kretsen med blodpriming.
    2. Sätt in aortakanylen i aortabågen och säkra den med en tillfällig mikroklämma. Se till att kanylens spets är placerad vid brakiocefalisk korsning.
    3. Bekräfta kanylens korrekta position genom att försiktigt ta tag i aortan med mikropincett.
    4. Starta perfusionen med en flödeshastighet på 2-3 ml / min, så att perfusat läcker från kanyleringsstället för att avlägsna eventuella luftbubblor.
    5. Övervaka perfusionstrycket och temperaturen genom sensorn som är ansluten till övervakningssystemet.
    6. Massera försiktigt hjärtat med första och pekfingrarna tills venöst blod läcker från huvudlungartären (MPA).
    7. Säkra aortan med en 1-0 silkeligatur och ta bort klämman efter att ha verifierat alla inställningar (perfusionskrets, perfusionstryck, temperatur).
    8. När den permanenta ligaturen är placerad, se till att hjärtat börjar dra ihop sig inom några sekunder och når normal rytm på 60 s. Ett genomsnittligt perfusionstryck på 55-65 mmHg med en koronarflödeshastighet på 3-4 ml vid 37 °C indikerar adekvat perfusion.
    9. Samla 0,15 ml blod från behållaren och kontrollera blodgasanalysen (BGA) i början av perfusionen och var 20: e minut därefter. Övervaka och registrera pH, pCO 2, pO2, glukos, hematokrit, kalium och laktat under perfusion. Efter 120 minuters perfusion, administrera 3 ml Custodiol genom sprutpumpen med en hastighet av 250 ml / h för att arrestera hjärtat.

4. Implantation

  1. Förberedelse av mottagaren
    1. Börja beredningen av mottagaren 30 minuter innan ex situ-perfusionen upphör.
    2. Bedöva mottagardjuret med samma metod som nämns i steg 2.2.
    3. Placera råttan i ryggläge på värmedynan och sätt in temperatursonden i ändtarmen för att hålla kroppstemperaturen vid 37 °C.
    4. Applicera ögonsmörjmedel, raka skönheten till det epigastriska området och rengör området med en jodbaserad skrubb och 70% alkohol.
  2. Läkemedel
    1. Injicera 2 ml varm saltlösning subkutant för att kompensera för vätskan som förlorats under operationen. Injicera 200 IE heparin subkutant.
    2. Administrera antibiotikaprofylax genom att injicera 10 mg/kg cefazolin upplöst i 0,3 ml saltlösning subkutant eller intramuskulärt.
    3. Administrera smärtkontroll genom att injicera 20 mg/kg diklofenak subkutant.
  3. Utför laparotomi i mittlinjen och sätt in en upprullare för att vidga bukhålan. Mobilisera bukorganen till vänster om mottagaren med hjälp av bomullspinne för att göra plats för proceduren.
  4. Förhindra uttorkning genom att linda bukorganen med varm och våt gasbindning. Sprid tillfälligt varm saltlösning med en 50 ml spruta under operationen.
  5. Använd ett kirurgiskt mikroskop med en 10x förstoring, mobilisera tolvfingertarmen och proximal jejunum genom trubbig dissektion med bomullspinnar för att exponera Abd. A. och IVC. Förbered Abd. A och IVC för anastomos och systematiskt implantera donatorhjärtat, i enlighet med figur 3 eller tidigare dokumenterade metoder15.
    OBS: Separera inte Abd. A. och IVC.
    1. Förutsatt att vaskulär anastomos placeras infrarenal, förbered en tillräcklig del av aorta och IVC för fastspänning.
    2. Utför trubbig förberedelse med bomullspinne eller skarpa tandade pincett för att ta bort fetter och fascia runt kärlen.
    3. Placera 5-0 silkeligaturer till de mesenteriska grenarna och både kraniala och kaudala sidor av de stora kärlen. Höj bukkärlen och koagulera eller ligera ländryggsgrenarna med 5-0 silkesuturer. Kom ihåg att skona testikelartärerna och venerna och kläm inte fast dem.
    4. Använd ligaturer för att lyfta kärlen och placera mikroklämmorna på de mesenteriska grenarna, kaudala och kraniala sidorna av de stora kärlen för att stoppa blodflödet vid anastomosstället. Stäng av värmedynan innan du placerar klämmorna, eftersom överflödig uppvärmning kan förvärra ischemi i lemmarna. Se till att slå på värmedynan efter avklämning av kärlen för att undvika hypotermi.
    5. Punktera aortan med en 27 G nål och förläng snittet med mikrosax till en längd som är lika med eller något större än öppningen av givarens stigande aorta (Asc. A), vilket är ungefär 5 mm.
    6. Gör ett längsgående snitt på IVC på samma sätt som aortotomi, men gör det 3 mm närmare den kaudala sidan jämfört med aortasnittet.
    7. Starta anastomoserna, placera donatorhjärtat på höger sida av mottagarens buk och fäst donatorn Asc. A till mottagarens Abd. A med en enkel avbruten söm (9-0 polypropen) i kranialhörnet av det längsgående snittet.
    8. Flytta hjärtat till vänster sida av mottagarens buk och utför anastomos av donatorns Asc. A med mottagarens Abd. A med en löpande 9-0 polypropensutur.
    9. Fixera donatorlungartären till IVC med två avbrutna suturer (9-0 polypropen) vid de kaudala och kraniala hörnen av det längsgående snittet.
    10. Utför den första halvan av venös anastomos från kärlets intraluminala sida och slutför den andra halvan från kärlets extraluminala sida. Innan du drar åt knutarna, spola fältet med saltlösning för att förhindra luftemboli.
  6. Avluftning och avklämning
    1. Ta bort den mesenteriska venklämman först efter avslutad anastomos så att höger sida av hjärtat kan fyllas med venöst blod.
    2. Ta bort luften i kranskärlskretsen och Asc. A. genom att applicera retrograd koronar perfusion i flera sekunder.
    3. Placera en bit gasbind på båda sidor av kärlen och ta bort den kaudala klämman och kranialklämman.
    4. Applicera mild kompression med bomullspinnar i 1-2 min. Efter att ha säkerställt adekvat hemostas, ta bort vattpinnarna och tvätta anastomoserna med varm saltlösning.
      OBS: Hjärtat bör börja slå inom den första minuten av reperfusion. Om mottagarråttans kroppstemperatur är under 35 °C normaliseras hjärtrytmen efter att temperaturen når 36 °C.
  7. Byt ut bukorganen på ett meanderliknande sätt och stäng skikten i buksnittet med kontinuerliga 5-0 polypropensuturer.
  8. Efter operationen, placera det bedövade djuret på ett rent område över en värmedyna tills kroppstemperaturen når 37 ° C.
    OBS: Starta inte de postoperativa undersökningarna förrän kroppstemperaturen når 37 ° C. Behåll anestesi vid 2-2,5% isofluran till slutet av experimenten.
  9. Övervaka EKG hos det transplanterade donatorhjärtat i 3 timmar. Punktbeskatta sedan hjärtat under djupbedövning för histologiska studier.
    OBS: Bekräfta anestesidjupet via brist på pedalreflex innan du skär hjärtat. Det kirurgiska ingreppet och EKG-övervakningen tar mindre än 6 timmar. Diklofenak, administrerat perioperativt (steg 4.2.3.), möjliggör smärtlindring under hela denna procedur. Analgesiregimen kan justeras enligt de institutionella riktlinjerna för djuranvändning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 illustrerar den experimentella designen som används i en smådjursmodell. Figur 2 visar den modifierade Langendorff-perfusionsapparaten, som inkluderar en liten djuroxygenator. Ordningen på anastomos för heterotopisk bukimplantation presenteras i figur 3.

Figur 4 visar de parametrar som används för att bedöma hjärtats livskraft under ex situ-perfusion , såsom laktat, kalium och genomsnittligt aortatryck. I denna studie minskade användningen av normotermiskt ex situ-bevarande den totala ischemiska tiden för sex framgångsrika fall till 46,2 ± 4,7 min, medan den totala tiden utanför kroppen var 166,2 ± 4,7 min (figur 5). Extraktionen av hjärtat från donatorn och förberedelse för ex situ-perfusion och heterotopisk transplantation krävde 5,8 ± 1,3 minuter, såsom visas i figur 5. Den totala framgångsgraden för operationen var 70% och den genomsnittliga anastomostiden för de sex framgångsrika fallen var 38,4 ± 3,4 min. I alla experiment minskade hjärtfrekvensen signifikant omedelbart efter implantationen, men den återhämtade sig så småningom med tiden, vilket illustreras i figur 6. Donatorhjärtans grova struktur bevarades väl efter ex situ-konservering och heterotopisk implantation, utan att några synliga skador upptäcktes. Hematoxylin-eosinfärgning avslöjade emellertid ett ökat antal inflammatoriska celler, mestadels neutrofiler, efter 3 timmars heterotopisk implantation (figur 7).

Figure 1
Figur 1: Experimentell design av normotermisk ex situ hjärtkonservering med heterotopisk hjärttransplantation. Förkortningar: BGA = blodgasanalys, CPS = kardioplegisk lösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Scheman över modifierad hjärtkonservering hos små djur ex situ . Förkortningar: BP-sensor = blodtryckssensor, CPS = kardioplegisk lösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Ordningen på anastomos vid heterotopisk hjärttransplantation . (A) Scheman över givarens hjärtposition i mottagarens buk och ordning av anastomos. (B) Donatoruppstigande aorta och mottagare bukaortanastomos. (C) Donatorlungartär och mottagare IVC-anastomos. Förkortningar: LV = vänster kammare, RV = höger kammare, LA = vänster förmak, MPA = huvudlungartär, IVC = sämre vena cava. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Parametrar för bedömning av viabilitet under ex situ-perfusion. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Tidslinje för bevarande av de sex framgångsrikt bevarade hjärtana. Hjärtextraktion och ex situ-perfusionsunderlättande: 5,8 ± 1,3 min. Ex situ-perfusion : 120 min. Implantation i buken hos mottagarråtta: 38,4 ± 3,4 min. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Donatorhjärtats elektrofysiologiska prestanda före tillvaratagande och efter implantation . (A) Förändringar i hjärtfrekvensen. Förskörd, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min: tiderna efter implantation. (B) Elektrokardiografiska bilder före skörd av donatorhjärta och efter 3 timmars implantation. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Donatorhjärtats makroskopiska (A-C) och mikroskopiska (D-F) utseende. (A, D) Före normotermisk ex situ-konservering . (B,E) Efter normotermisk ex situ-konservering . (C,F) Efter 2 h heterotopisk implantation. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vårt fokus för att etablera denna modell var att replikera normotermisk mänsklig hjärttransplantation. Icke-utskjutande modeller är den vanligaste tekniken för att bevara donatorhjärtat i en ex situ-miljö 16. Medan utmatningsmodeller erbjuder många fördelar vid bedömning av hjärtfunktion under ex situ-perfusion 17, är de inte lämpliga för heterotopiska transplantationsmodeller. Vid heterotopisk transplantation måste det implanterade donatorhjärtat övervinna det systoliska efterbelastningstrycket som skapas av värdhjärtat i mottagarens cirkulationssystem, vilket leder till en begränsad donatorhjärtprestanda och underskattning i bedömningen18. Därför är icke-utstötande modeller mer gynnsamma vid heterotopisk transplantation. I icke-utmatande modeller är donatorhjärtat perfuserat men stöder inte mottagarens cirkulation, vilket avsevärt begränsar prestationsbedömningen av hjärtat. Morfologiska och molekylära utvärderingar, såsom histologisk färgning och blottinganalys, kan vara fördelaktiga för att undersöka donatorhjärtsjukdomar när funktionella bedömningar är begränsade. Dessutom kan de metaboliska markörerna utvärderas med hjälp av avancerad teknik, såsom positronemissionstomografi (PET) eller magnetisk resonanstomografi (MRT)19. Denna modell kan vara användbar för att testa den långsiktiga effektiviteten av farmakologiska och genetiska ingrepp före implantation.

Många forskargrupper har utvecklat en normotermisk ex situ-konserveringsmodell , som framgångsrikt har använts för att bevara svinhjärtan i upp till 12 h6. Underhåll av stora djurmodeller kan dock vara kostnadseffektivt för små laboratorier, eftersom det innebär betydande kostnader och kräver ett stort antal utbildad personal. För att ta itu med denna fråga föreslår vi en billigare och tekniskt enkel ex situ-konserveringsmetod , som innebär användning av autologt blod följt av heterotopisk hjärttransplantation. I synnerhet är kostnaden för ett enda experiment med vår modell ungefär $ 300. Även om det inte finns någon motsvarande smådjursmodell för att jämföra kostnaderna, kan ex situ-perfusionsapparaten för stora djur, när den används en gång, kosta upp till $ 30,00016.

Det presenterade protokollet visar att alla experimentella procedurer kan utföras stegvis av en enda experimentator (figur 3). Möjligheten till heterotopisk implantation efter ex situ-konservering är en annan fördel med denna modell. Genom att kanylera den nedåtgående aortan i donatorhjärtat för ex situ-perfusion kunde vi skona den stigande delen utan att orsaka någon skada. Dessutom modifierade vi Langendorff-kretsen, vilket minskade mängden perfusionslösning som krävs till 12 ml för effektiv hjärtperfusion. Perfusionsblodet erhölls från givarråttan före skörden, så att vi kunde bevara hjärtat med sitt eget blod och undvika immunologiska reaktioner under konservering.

Ändringar och felsökning
Ex-situ-perfusionskretsen rekommenderas för att bibehålla ett genomsnittligt efterbelastningstryck inom området 50-70 mmHg. Trycket bestäms av olika faktorer, inklusive perfusionsflöde, kranskärlsmotstånd och perfusatviskositet20. Koronarartärresistens är känslig för fluktuationer på grund av variationer i temperatur och pH, så det är viktigt att hålla dessa parametrar inom det normala intervallet. Det erforderliga perfusionsflödet varierar för varje experiment och är beroende av det nödvändiga flödet för att bibehålla det önskade perfusionstrycket. Vanligtvis är ett flöde på 3-4 ml / min (motsvarande 5-6 rpm för vår pump) tillräckligt för ett 350-450 g råtthjärta. Hematokritnivån är en determinant av perfusatviskositet21. För vår krets är det optimala hematokritområdet 25% till 30%. Trots användningen av den minsta experimentella oxygenatorn kan den stora gasutbytesytan på 0,05 m2 för en perfusatvolym på 12 ml leda till avdunstning och därmed vätskeförlust över tiden. Denna vätskeförlust kan åtgärdas genom tillsats av destillerat vatten efter behov. Det rekommenderas inte att tillsätta saltlösning eller ringlösning till perfusatet, eftersom de kan orsaka hypernatremi. Perfusatglukoskoncentrationen bör bibehållas vid 100-150 mg / dL.

Det är viktigt att undvika arytmi under perfusion eftersom det innebär försämring av en eller flera fysiologiska parametrar i ex situ-miljön 10. Takyarytmi eller vänster ventrikelflimmer är vanligtvis förknippade med olika faktorer, såsom elektrolytisk obalans, låg hematokrit, acidos / alkalos, hypertermi och överdriven efterbelastning. Å andra sidan orsakas bradyarytmi huvudsakligen av hypotermi. Laktat och kalium är de viktigaste parametrarna vid bedömning av myokardiell livskraft. Förhöjda laktatnivåer (>5 mmol / L) och hyperkalemi (>5,0 mg / dL) indikerar en betydande grad av myokardskada22.

Den noggranna övervakningen av anestesidosering och andningsmönster hos mottagarråtta är avgörande under kirurgiska ingrepp. Eftersom djuren inte ventileras kan kontinuerlig administrering av överdriven anestesi leda till hypoventilation och misslyckande. Den totala laparotomi och extraktion av bukorganen resulterar i betydande värmeförlust, vilket ytterligare kan försämra mottagarens tillstånd. Därför är användningen av en temperaturregulator utrustad med en värmedyna och temperatursond avgörande för att mildra effekterna av värmeförlust och upprätthålla en stabil kroppstemperatur.

Kritiska steg
De kritiska stadierna i det kirurgiska ingreppet innefattar dissektion av aortabågen och MPA, aortakanylering för ex situ-perfusion, avluftning före ex situ-perfusion och avluftning innan klämmorna avlägsnas efter implantation. Dessa steg är mycket sårbara och är ofta förknippade med fel. Nyckeln till att övervinna dessa utmaningar ligger dock i att identifiera lämplig teknik och få tillräcklig övning. Under isolering av kärl i mottagaren måste särskild uppmärksamhet ägnas åt den högra urinledaren, som ligger i närheten av IVC i retroperitonealutrymmet och kan efterlikna lymfkanalen. I samband med venanastomos rekommenderas att först säkra den kaudala änden med hjälp av vistelsesuturer följt av kranialänden för att förhindra rivning och stenos. Detta är särskilt viktigt på grund av venernas relativt bräckliga natur i jämförelse med aortan.

Begränsningar
De kirurgiska ingrepp som är involverade i detta experiment är avsevärt komplexa, särskilt när man får givarhjärtat och perfuserar blod från samma djur. De funktionella bedömningarna efter implantation är begränsade eftersom vi använde en icke-utstötande modell. En utkastningsmodell anses ge mer avancerade resultat i en ex situ-miljö . Vid heterotopisk transplantation är den emellertid begränsad på grund av närvaron av ett stödjande värdhjärta i cirkulationssystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett bidrag B2021-0991 från Chonnam National University Hospital Biomedical Research Institute och NRF-2020R1F1A1073921 från National Research Foundation of Korea

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AES active evacuation system Smiths medical PC-6769-51A Utilize CO2 and excess isoflurane
Anesthesia machine Smiths medical PC-8801-01A Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal
B20 patient monitor GE medical systems B20 to observe mean aortic pressure and temperature
Homeothermic Monitoring System Harvard apparatus 55-7020 To monitor and maintain animal's temperature
Micro-1 Rat oxygenator Dongguan Kewei medical instruments Micro-MO For gas exchange in the langendorff circuit
Micropuncture introducer Set COOK medical G48007 for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta
Microscope Amscope MU1403 For zooming surgical field (Recipient)
Surgical loupe SurgiTel L2S09 For zooming surgical field (Donor)
Syringe pump AMP all SP-8800 To deliver cardioplegic solution
Transonic flow sensor Transonic ME3PXL-M5 Perfusion circuit flow sensor
Transonic tubing flow module Transonic TS410 flow acquiring system
Watson - Marlow pumps Harvard apparatus 010.6131.DAO Peristaltic pump used for recirculate perfusate
WBC-1510A JEIO TECH E03056D Heating bath
Sprague-Dawley rats Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye Drops SENTRIX Animal care wet ointments for eye
Cefazolin JW pharmaceutical For prophilaxis
Custodiol DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH For heart harvesting
Diclofenac Myungmoon Pharm. Co. Ltd For pain control
Heparin JW pharmaceutical Anticoagulant
Insulin JW pharmaceutical hormon therapy
Saline JW pharmaceutical For hydration therapy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langmuur, S. J. J., et al. Normothermic ex-situ heart perfusion with the organ care system for cardiac transplantation: A meta-analysis. Transplantation. 106 (9), 1745-1753 (2022).
  2. Ardehali, A., et al. Ex-vivo perfusion of donor hearts for human heart transplantation (PROCEED II): a prospective, open-label, multicentre, randomized non-inferiority trial. Lancet. 385 (9987), 2577-2584 (2015).
  3. Dang Van, S., et al. Ex vivo perfusion of the donor heart: Preliminary experience in high-risk transplantations. Archives of Cardiovascular Diseases. 114 (11), 715-726 (2021).
  4. Zhou, P., et al. Donor heart preservation with hypoxic-conditioned medium-derived from bone marrow mesenchymal stem cells improves cardiac function in a heart transplantation model. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 5f6 (2021).
  5. Messer, S., Large, S. Resuscitating heart transplantation: the donation after circulatory determined death donor.European. Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 49 (1), 1-4 (2016).
  6. Trahanas, J. M., et al. Achieving 12 hour normothermic ex situ heart perfusion: an experience of 40 porcine hearts. ASAIO Journal. 62 (4), 470-476 (2016).
  7. Yang, Y., et al. Keeping donor hearts in completely beating status with normothermicblood perfusion for transplants. The Annals of Thoracic Surgery. 95 (6), 2028-2034 (2013).
  8. Van Caenegem, O., et al. Hypothermic continuous machine perfusion enables preservation of energy charge and functional recovery of heart grafts in an ex vivo model of donation following circulatory death. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 49 (5), 1348-1353 (2016).
  9. Lu, J., et al. Normothermic ex vivo heart perfusion combined with melatonin enhances myocardial protection in rat donation after circulatory death hearts via inhibiting NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 733183 (2021).
  10. Pinnelas, R., Kobashigawa, J. A. Ex vivo normothermic perfusion in heart transplantation: a review of the TransMedics Organ Care System. Future Cardiology. 18 (1), 5-15 (2022).
  11. Fuchs, M., et al. Does the heart transplant have a future. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 55, i38-i48 (2019).
  12. Pahuja, M., Case, B. C., Molina, E. J., Waksman, R. Overview of the FDA's circulatory system devices panel virtual meeting on the TransMedics Organ Care System (OCS) Heart - portable extracorporeal heart perfusion and monitoring system. American Heart Journal. 247, 90-99 (2022).
  13. Jawitz, O. K., Devore, A. D., Patel, C. B., Bryner, B. S., Schroder, J. N. Expanding the donor pool: quantifying the potential impact of a portable organ-care system for expanded criteria heart donation. Journal of Cardiac Failure. 27 (12), 1462-1465 (2021).
  14. van Suylen, V., et al. Ex situ perfusion of hearts donated after euthanasia: a promising contribution to heart transplantation. Transplantation Direct. 7 (3), e676 (2021).
  15. Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), e0214513 (2019).
  16. Qin, G., Jernryd, T., Sjoberg, S., Steen, S., Nilsson, J. Machine perfusion for human heart preservation: A systematic review. Transplant International. 35, 10258 (2022).
  17. Dang Van, S., Brunet, D., Akamkam, A., Decante, B., Guihaire, J. Functional assessment of the donor heart during ex situ perfusion: insights from pressure-volume loops and surface echocardiography. Journal of Visual Experiments. (188), e63945 (2022).
  18. Fu, X., Segiser, A., Carrel, T. P., Tevaearai Stahel, H. T., Most, H. Rat heterotopic heart transplantation model to investigate unloading-induced myocardial remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 3, 34 (2016).
  19. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
  20. Qi, X., et al. The evaluation of constant coronary artery flow versus constant coronary perfusion pressure during normothermic ex-situ heart perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 41 (12), 1738-1750 (2022).
  21. Okahara, S., et al. A novel blood viscosity estimation method based on pressure-flow characteristics of an oxygenator during cardiopulmonary bypass. Artificial Organs. 41 (3), 262-266 (2017).
  22. Quader, M., Torrado, J. F., Mangino, M. J., Toldo, S. Temperature and flow rate limit the optimal ex-vivo perfusion of the heart - an experimental study. Journal of Cardiothoracic Surgery. 15 (1), 180 (2020).

Tags

Medicin utgåva 194

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 08/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.

Section 4 of the Protocol was updated from:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.

to:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
  8. After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C. 
    NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments.
  9. Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
    NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
Råttmodell av normothermisk ex-situ perfuserad heterotopisk hjärttransplantation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kayumov, M., Jeong, I. S., Kim, D.,… More

Kayumov, M., Jeong, I. S., Kim, D., Kwak, Y., Obiweluozor, F. O., Yoon, N., Kim, H. S., Cho, H. J. Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. J. Vis. Exp. (194), e64954, doi:10.3791/64954 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter