Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Rottemodel af normamymisk ex-situ perfuseret heterotopisk hjertetransplantation

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64954
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3, 2, 2,3, 4, 5, 3,6
1Department of Medical Science, Chonnam National University Graduate School, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 3Cardiovascular and Respiratory Research Team, Chonnam National University Hospital, 4Department of Internal Medicine, Chonnam National University Hospital and Medical School, 5Departments of Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 6Department of Pediatrics, Chonnam National University Children’s Hospital, and Medical School
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Her præsenterer vi en vurderingsprotokol for et heterotopisk implanteret hjerte efter normoterm ex situ-konservering i rottemodellen.

Abstract

Hjertetransplantation er den mest effektive terapi til hjertesvigt i slutstadiet. På trods af forbedringerne i terapeutiske tilgange og interventioner stiger antallet af hjertesvigtpatienter, der venter på transplantation, stadig. Den normotermiske ex situ-konserveringsteknik er etableret som en metode, der kan sammenlignes med den konventionelle statiske kølelagringsteknik. Den største fordel ved denne teknik er, at donorhjerter kan bevares i op til 12 timer i en fysiologisk tilstand. Desuden tillader denne teknik genoplivning af donorhjerterne efter kredsløbsdød og anvender nødvendige farmakologiske indgreb for at forbedre donorfunktionen efter implantation. Talrige dyremodeller er blevet etableret for at forbedre normotermiske ex situ-konserveringsteknikker og eliminere bevaringsrelaterede komplikationer. Selvom store dyremodeller er nemme at håndtere sammenlignet med små dyremodeller, er det dyrt og udfordrende. Vi præsenterer en rottemodel af normoterm ex situ donorhjertekonservering efterfulgt af heterotopisk abdominal transplantation. Denne model er relativt billig og kan opnås af en enkelt eksperimentator.

Introduction

Hjertetransplantation er fortsat den eneste levedygtige behandling for ildfast hjertesvigt 1,2,3,4. På trods af en støt stigning i antallet af patienter, der har behov for hjertetransplantation, er der ikke observeret en forholdsmæssig stigning i tilgængeligheden af donororganer5. For at løse dette problem er der udviklet nye tilgange til bevarelse af donorhjerter med det formål at forbedre udfordringerne og øge tilgængeligheden af donorer 6,7,8,9.

Normothermic ex situ hjerteperfusion (NESHP) ved hjælp af organplejesystem (OCS) maskiner er opstået som en klinisk intervention 1,3. Denne teknik er blevet anset for at være et egnet alternativ til den konventionelle metode 2,9 med statisk kold opbevaring (SCS). NESHP reducerer effektivt varigheden af kold iskæmi, mindsker metabolisk efterspørgsel og letter optimal ernæringsforsyning og iltning under transport af donororganer10,11. På trods af denne metodes klare potentiale til at forbedre donororganets bevaring har dens kliniske anvendelse og yderligere undersøgelse været begrænset af høje omkostninger. Derfor er prækliniske dyremodeller af NESHP afgørende for at identificere vigtige tekniske udfordringer forbundet med denne teknik12,13. Svin og rotter er de foretrukne dyremodeller til prækliniske undersøgelser på grund af deres iskæmiske tolerance9. Selvom svinemodellen er ideel til grundlæggende og translationel forskning, er den begrænset af dens høje omkostninger og det intensive arbejde, der kræves til pleje og vedligeholdelse. I modsætning hertil er rottemodeller billigere og lettere at håndtere14.

I denne undersøgelse introducerer vi en forenklet rottemodel af NESHP, efterfulgt af heterotopisk hjertetransplantation, for at evaluere virkningen af konserveringsteknikken på transplantatets tilstand efter implantation. Denne model er ligetil, omkostningseffektiv og kan udføres af en enkelt eksperimentator. Figur 1 viser skemaerne for proceduren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Det etiske udvalg for Laboratory Animal Research Center på Chonnam National University Hospital (godkendelsesnr. CNU IACUC - H - 2022-36) godkendte alle dyreforsøg. Hanrotter (350-450 g), der blev anvendt i denne undersøgelse, blev behandlet i overensstemmelse med retningslinjerne for pasning og brug af forsøgsdyrene. Rotterne blev anbragt i temperaturstyrede rum med en 12 timers lys-mørk cyklus med standard mad og vand til rådighed.

1. Forberedelse

BEMÆRK: En enkelt eksperimentator kan udføre alle eksperimentelle procedurer.

  1. Saml Langendorff-apparatet, herunder oxygenator-, pumpe- og perfusionsledningerne, før operationen (figur 2). Fyld perfusionskredsløbet med 20 ml saltopløsning og cirkulere det, indtil det er primet med autologt blod.
    BEMÆRK: Formålet med dette trin er at opvarme det ekstrakorporeale kredsløb.
  2. Fastgør den kardioplegiske linje til kredsløbet via stophanen, der er fastgjort til aortakanylen, og forbered sprøjtepumpen til den endelige kardioplegiske infusion.
    BEMÆRK: Sørg for fjernelse af eventuelle luftbobler fra perfusionskredsløbet og den kardioplegiske linje.
  3. Placer temperatursensoren i reservoiret, hvor donorhjertet opbevares, og hold kredsløbets temperatur på 37 ° C.
  4. Kirurgiske præparater
    1. Forbered et separat sæt sterile mikroinstrumenter og materialer til hver donor- og modtagerrotte.
      1. Forbered det kirurgiske sæt til donoren: par kirurgiske saks, par mikrotang, skarpe mygtang, 5-0 silkesuturer, bomuldspinde, 50 ml sprøjte, perfusionslinje til den kardioplegiske opløsning (CPS), sprøjtepumpe, 18 G angiokateter, et sæt 5 Fr. lårbenskatetre og sterile gasbind.
      2. Forbered det kirurgiske sæt til modtageren: mikrokirurgisk saks, sårretraktor, par mikrotang, mygtang, vaskulære mikroklemmer, 1 ml sprøjte, en 5-0 og 9-0 polypropylensuturer, 5-0 silkesuturer, vatpinde og sterile gasbind.

2. Konservering af donorhjerte og blodindsamling

  1. Inducer anæstesi hos donorrotten med isofluran (5%) i anæstesikammeret og registrer rottens vægt, før den placeres på operationsbordet.
  2. Placer rotten i liggende stilling på operationsbordet og administrer kontinuerlig anæstesi ved at levere 2% -2,5% isofluran med 90% ilt gennem en næsekegle.
  3. Kontroller dybden af anæstesi ved at kontrollere manglen på respons på tåklemmen og åndedrætfrekvensen, som skal være mellem 50-60 pr. Minut.
    BEMÆRK: Et passende niveau af anæstesi er afgørende for at undgå unødig stress og smerte for donorrotten.
  4. Påfør øjensmøremiddel og barber regionen pubis til clavicula, hvor operationen vil blive udført. Rengør området med en jodbaseret skrubbe og 70% alkohol.
  5. Kateterisation
    1. Lav et 7 cm midterlinie abdominal snit og bilaterale snit, der måler 3 cm fra xiphoidprocessen til midterkravebenet. Fjern skindet fra brystområdet.
    2. Brug bomuldspindler til at mobilisere abdominale organer til venstre side af maven. Isoler abdominal aorta fra retroperitoneal fascia og fedtvæv.
    3. Injicer 1.000 IE heparin opløst i 0,3 ml isotonisk saltvand gennem den ringere vena cava (IVC) ved hjælp af en 1 ml sprøjte. Stop enhver blødning fra nålehullet ved forsigtigt at komprimere med en vatpind.
      BEMÆRK: Vær forsigtig med luftemboli under injektion, da det kan føre til hjertestop.
    4. Indsæt et 5 Fr. lårbenskateter i abdominal aorta (Abd. A). Sørg for, at kateterspidsen når aortabuen. Bekræft kateterets placering ved at vurdere den omtrentlige længde af den indsatte del af kateteret.
  6. Blodindsamling
    1. Opsaml omkring 10 ml blod via kateteret indsat i Abd. A.
    2. Senere fortyndes primingblodet med isotonisk saltvand, indtil det samlede volumen når 12 ml. Tilsæt 5 mg cefazolin opløst i 0,3 ml saltvand og insulin (20 IE).
  7. Hjertestop
    1. Tilslut den tidligere forberedte CPS-perfusionsslange til abdominalkateteret, og start CPS-administrationen med sprøjtepumpen med en hastighed på 800 ml/t.
    2. Åbn brysthulen fra membranen og skær IVC tæt på membranen for at forhindre ventrikulær afstand. Skær ribbenene bilateralt langs brystryggen op til brystindløbet. Reflekter den mobiliserede ventrale brystvæg overlegent med mygtang.
    3. Fjern thymus helt ved hjælp af mikrotang for at visualisere aortabuen. Påfør let kompression, hvis thymiske arterier bløder.
  8. Ekstraktion
    1. Efter administration af alle CPS isoleres aortabuen fra det omgivende væv. Dissekere forsigtigt lige under venstre subklaviske arterie.
    2. Transekter brachiocephalic og venstre fælles halspulsårer i en fjern position, efterlader de længere stubbe af aortabuen for nem håndtering under aorta kanylering. Transekter hovedlungearterien (MPA) så tæt som muligt på bifurcationen. Vær forsigtig med ikke at beskadige venstre atriale vedhæng.
    3. Ligér forsigtigt den overlegne vena cava (SVC) og IVC med 5-0 silkesuturer, hvilket forhindrer obstruktion af højre atrium (RA) og koronar sinus. Dæk venstre margen af thorax med vådt gasbind, placer hjertet på det og træk forsigtigt SVC- og IVC-ligaturerne tilbage for at udsætte hilum.
    4. Ligate lunge- og azygovenerne sammen med en 5-0 silkesutur. Afbryd vævet dorsalt til ligaturen og ekstraher hjertet. Undersøg hjertet for enhver skade. Endelig vejer hjertet før aorta kanylering.

3. Ex situ perfusion

  1. Aorta kanylering og perfusion
    1. Før aorta-kanylering skal du udskifte det saltvandsgrundede kredsløb med blodpriming.
    2. Indsæt aortakanylen i aortabuen og fastgør den med en midlertidig mikroklemme. Sørg for, at spidsen af kanylen er placeret ved brachiocephalic krydset.
    3. Bekræft kanylens korrekte position ved forsigtigt at tage fat i aorta med mikrotang.
    4. Start perfusionen med en strømningshastighed på 2-3 ml / min, så perfusat lækker fra kanyleringsstedet for at fjerne eventuelle luftbobler.
    5. Overvåg perfusionstrykket og temperaturen gennem sensoren, der er tilsluttet overvågningssystemet.
    6. Massér forsigtigt hjertet med de første fingre og pegefingrene, indtil venøst blod lækker fra hovedlungearterien (MPA).
    7. Fastgør aorta med en 1-0 silkeligatur, og fjern klemmen efter at have verificeret alle indstillinger (perfusionskredsløb, perfusionstryk, temperatur).
    8. Når den permanente ligatur er placeret, skal du sørge for, at hjertet begynder at trække sig sammen inden for få sekunder og når normal rytme i 60 s. Et gennemsnitligt perfusionstryk på 55-65 mmHg med en koronar strømningshastighed på 3-4 ml ved 37 °C indikerer tilstrækkelig perfusion.
    9. Opsaml 0,15 ml blod fra reservoiret, og kontroller blodgasanalysen (BGA) i begyndelsen af perfusionen og hvert 20. minut derefter. Overvåg og registrer pH, pCO 2, pO2, glucose, hæmatokrit, kalium og lactat under perfusion. Efter 120 minutters perfusion administreres 3 ml Custodiol gennem sprøjtepumpen med en hastighed på 250 ml / t for at arrestere hjertet.

4. Implantation

  1. Forberedelse af modtager
    1. Påbegynd modtagerpræparatet 30 minutter før ophør af ex situ perfusion.
    2. Bedøvelse af recipientdyret sker efter samme metode som nævnt i trin 2.2.
    3. Placer rotten i liggende stilling på varmepuden, og sæt temperatursonden ind i endetarmen for at holde kropstemperaturen på 37 °C.
    4. Påfør øjensmøremiddel, barber skammen til det epigastriske område, og rens området med en jodbaseret skrubbe og 70% alkohol.
  2. Medicin
    1. Injicer 2 ml varmt saltvand subkutant for at kompensere for væsken tabt under operationen. Injicer 200 IE heparin subkutant.
    2. Administrer antibiotikaprofylakse ved at injicere 10 mg/kg cefazolin opløst i 0,3 ml saltvand subkutant eller intramuskulært.
    3. Administrer smertekontrol ved at injicere 20 mg/kg diclofenac subkutant.
  3. Udfør midterlinjen laparotomi og indsæt en retraktor for at udvide bukhulen. Mobiliser abdominale organer til venstre side af modtageren ved hjælp af vatpinde for at give plads til proceduren.
  4. Undgå dehydrering ved at indpakke abdominale organer med varmt og vådt gasbind. Spred regelmæssigt varmt saltvand med en 50 ml sprøjte under operationen.
  5. Brug et kirurgisk mikroskop med en 10x forstørrelse, mobiliser tolvfingertarmen og proksimal jejunum ved stump dissektion med vatpinde for at udsætte Abd. A. og IVC. Forbered Abd. A og IVC til anastomose og systematisk implantering af donorhjertet i overensstemmelse med figur 3 eller tidligere dokumenterede metoder15.
    BEMÆRK: Adskil ikke Abd. A. og IVC.
    1. Forudsat at vaskulær anastomose placeres infrarenal, skal du forberede en tilstrækkelig del af aorta og IVC til fastspænding.
    2. Udfør stump forberedelse ved hjælp af vatpinde eller skarptakkede tang for at fjerne fedt og fascia omkring karrene.
    3. Placer 5-0 silkeligaturer til de mesenteriske grene og både kraniale og kaudale sider af de store kar. Løft abdominalkarrene og koaguler eller liger lændehvirvelgrenene med 5-0 silkesuturer. Husk at skåne testikelarterierne og venerne og ikke klemme dem.
    4. Brug ligaturer til at løfte karrene og placere mikroklemmerne til mesenteriske grene, kaudale og kraniale sider af de store kar for at stoppe blodgennemstrømningen på anastomosestedet. Sluk for varmepuden, inden klemmerne placeres, da overskydende opvarmning kan forværre iskæmi i lemmerne. Sørg for at tænde varmepuden efter afspænding af beholderne for at undgå hypotermi.
    5. Punktering af aorta med en 27 G nål og forlæng snittet med mikrosaks til en længde, der er lig med eller lidt større end åbningen af donorens stigende aorta (Asc. A), som er ca. 5 mm.
    6. Lav et langsgående snit på IVC på samme måde som aortotomi, men gør det 3 mm tættere på den kaudale side sammenlignet med aorta-snittet.
    7. Start anastomoserne, placer donorhjertet på højre side af modtagerens underliv og fastgør donor Asc. A til modtagerens Abd. A med en simpel afbrudt søm (9-0 polypropylen) i kraniehjørnet af det langsgående snit.
    8. Flyt hjertet til venstre side af modtagerens underliv og udfør anastomose af donorens Asc. A med modtagerens Abd. A ved hjælp af en løbende 9-0 polypropylensutur.
    9. Fastgør donorlungearterien til IVC med to afbrudte suturer (9-0 polypropylen) ved de kaudale og kraniale hjørner af det langsgående snit.
    10. Udfør den første halvdel af den venøse anastomose fra den intraluminale side af beholderen og afslut anden halvdel fra den ekstraluminale side af beholderen. Før du strammer knuderne, skal du skylle feltet med saltvand for at forhindre luftemboli.
  6. Afluftning og afspænding
    1. Fjern den mesenteriske veneklemme først efter afslutning af anastomosen for at lade højre side af hjertet fyldes med venøst blod.
    2. Fjern luften i koronarkredsløbet og Asc. A. ved at anvende retrograd koronar perfusion i flere sekunder.
    3. Placer et stykke gasbind på begge sider af karrene, og fjern kaudalklemmen og kranieklemmen.
    4. Påfør skånsom kompression med vatpinde i 1-2 min. Efter at have sikret tilstrækkelig hæmostase, fjern vatpindene og vask anastomoserne med varmt saltvand.
      BEMÆRK: Hjertet skal begynde at slå inden for det første minut af reperfusion. Hvis modtagerrottens kropstemperatur er under 35 °C, normaliseres hjerterytmen, når temperaturen når 36 °C.
  7. Udskift abdominale organer på en meander-lignende måde og luk lagene af abdominal snit ved hjælp af kontinuerlige 5-0 polypropylen suturer.
  8. Efter operationen placeres det bedøvede dyr på et rent område over en varmepude, indtil kropstemperaturen når 37 ° C.
    BEMÆRK: Start ikke de postoperative undersøgelser, før kropstemperaturen når 37 ° C. Oprethold anæstesi ved 2-2,5% isofluran indtil afslutningen af forsøgene.
  9. Overvåg EKG af det transplanterede donorhjerte i 3 timer. Derefter punktafgifter hjertet under dyb anæstesi til histologiske undersøgelser.
    BEMÆRK: Bekræft anæstesidybden via manglende pedalrefleks, før du udskærer hjertet. Den kirurgiske procedure og EKG-overvågningen tager mindre end 6 timer. Diclofenac, administreret perioperativt (trin 4.2.3.), muliggør smertebehandling i hele varigheden af denne procedure. Analgesiregimet kan justeres i henhold til de institutionelle retningslinjer for brug af dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 illustrerer det eksperimentelle design, der anvendes i en lille dyremodel. Figur 2 viser det modificerede Langendorff-perfusionsapparat, som omfatter en oxygenator til små dyr. Rækkefølgen af anastomose for heterotopisk abdominal implantation er vist i figur 3.

Figur 4 viser de parametre, der anvendes til at vurdere hjertets levedygtighed under ex situ perfusion, såsom laktat, kalium og gennemsnitligt aortatryk. I denne undersøgelse reducerede brugen af normoterm ex situ-konservering den samlede iskæmiske tid for seks vellykkede tilfælde til 46,2 ± 4,7 minutter, mens den samlede ud-af-kroppen-tid var 166,2 ± 4,7 minutter (figur 5). Udtagning af hjertet fra donor og forberedelse til ex situ perfusion og heterotopisk transplantation krævede 5,8 ± 1,3 min, som vist i figur 5. Den samlede succesrate for operationen var 70%, og den gennemsnitlige anastomosetid for de seks vellykkede tilfælde var 38,4 ± 3,4 min. I alle eksperimenter faldt hjertefrekvensen signifikant umiddelbart efter implantation, men den kom sig til sidst over tid, som illustreret i figur 6. Den grove struktur af donorhjerterne blev godt bevaret efter ex situ konservering og heterotopisk implantation, uden synlige skader opdaget. Imidlertid afslørede hæmatoxylin-eosinfarvning et øget antal inflammatoriske celler, for det meste neutrofiler, efter 3 timers heterotopisk implantation (figur 7).

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelt design af normoterm ex situ hjertekonservering med heterotopisk hjertetransplantation. Forkortelser: BGA = blodgasanalyse, CPS = kardioplegisk opløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skemaer over modificeret hjertebeskyttelse af smådyr ex situ . Forkortelser: BP sensor = blodtrykssensor, CPS = kardioplegisk opløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Rækkefølgen af anastomose ved heterotopisk hjertetransplantation . (A) Skemaer over donorhjerteposition i modtagerens abdomen og rækkefølgen af anastomose. B) Donor, opstigende aorta og modtager abdominal aorta anastomose. (C) Donors lungearterie og modtager IVC-anastomose. Forkortelser: LV = venstre ventrikel, RV = højre ventrikel, LA = venstre atrium, MPA = hovedlungearterie, IVC = ringere vena cava. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Parametre for vurdering af levedygtighed under ex situ-perfusion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Bevaringstidslinje for de seks vellykkede bevarede hjerter. Hjerteekstraktion og ex situ perfusionsfacilitering: 5,8 ± 1,3 min. Ex situ perfusion: 120 min. Implantation i modtagerrottens underliv: 38,4 ± 3,4 min. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Donorhjertets elektrofysiologiske ydeevne før udtagning og efter implantation . (A) Ændringer i hjertefrekvensen. Forhøstning, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min: tiderne efter implantation. (B) Elektrokardiografiske billeder før donorhjertehøstning og efter 3 timers implantation. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Makroskopisk (A-C) og mikroskopisk (D-F) udseende af donorhjertet. (A,D) Før normoterm ex situ konservering. (B,E) Efter normoterm ex situ konservering. (C,F) Efter 2 timers heterotopisk implantation. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vores fokus i etableringen af denne model var at replikere normoterm human hjertetransplantation. Ikke-udstødende modeller er den almindeligt foretrukne teknik til bevarelse af donorhjertet i et ex situ-miljø 16. Mens udstødningsmodeller giver mange fordele ved vurdering af hjertefunktion under ex situ perfusion17, er de ikke egnede til heterotopiske transplantationsmodeller. Ved heterotopisk transplantation skal det implanterede donorhjerte overvinde systolisk efterbelastningstryk skabt af værtshjertet i modtagerens kredsløbssystem, hvilket fører til en begrænset donorhjerteydelse og undervurdering i vurderingen18. Derfor er ikke-udstødende modeller mere gunstige ved heterotopisk transplantation. I ikke-udstødende modeller er donorhjertet perfuseret, men understøtter ikke modtagerens cirkulation, hvilket signifikant begrænser præstationsvurderingen af hjertet. Morfologiske og molekylære evalueringer, såsom histologisk farvning og blottinganalyse, kan være gavnlige for undersøgelse af donorhjerteforhold, når funktionelle vurderinger er begrænsede. Desuden kan de metaboliske markører evalueres ved hjælp af avancerede teknologier, såsom positronemissionstomografi (PET) eller magnetisk resonansbilleddannelse (MRI)19. Denne model kan være nyttig til at teste den langsigtede effektivitet af farmakologiske og genetiske indgreb før implantation.

Talrige forskergrupper har udviklet en normoterm ex situ konserveringsmodel, som med succes er blevet anvendt til konservering af svinehjerter i op til 12 timer6. Vedligeholdelse af store dyremodeller kan dog være omkostningsmæssigt uoverkommeligt for små laboratorier, da det indebærer betydelige udgifter og kræver et betydeligt antal uddannet personale. For at løse dette problem foreslår vi en billigere og teknisk ligetil ex situ-konserveringsmetode, som indebærer anvendelse af autologt blod efterfulgt af heterotopisk hjertetransplantation. Især er omkostningerne ved et enkelt eksperiment ved hjælp af vores model ca. $ 300. Selvom der ikke er nogen tilsvarende smådyrsmodel til at sammenligne omkostningerne, kan ex situ-perfusionsapparatet til store dyr, når det bruges en gang, koste op til $ 30.00016.

Den præsenterede protokol viser, at alle eksperimentelle procedurer kan udføres trinvist af en enkelt eksperimentator (figur 3). Muligheden for heterotopisk implantation efter ex situ-konservering er en anden fordel ved denne model. Ved at kanylere donorhjertets nedadgående aorta til ex situ-perfusion var vi i stand til at skåne den stigende del uden at forårsage skade. Desuden ændrede vi Langendorff-kredsløbet, hvilket reducerede mængden af perfusionsopløsning, der kræves, til 12 ml for effektiv hjerteperfusion. Perfusionsblodet blev opnået fra donorrotten før høst, så vi kunne bevare hjertet med sit eget blod og undgå immunologiske reaktioner under konservering.

Ændringer og fejlfinding
Ex situ-perfusionskredsløbet anbefales at opretholde et gennemsnitligt efterbelastningstryk inden for området 50-70 mmHg. Trykket bestemmes af forskellige faktorer, herunder perfusionsstrøm, koronararteriemodstand og perfusatviskositet20. Koronar arteriel modstand er modtagelig for udsving på grund af variationer i temperatur og pH, og det er derfor afgørende at opretholde disse parametre inden for det normale område. Den krævede perfusionsstrøm varierer for hvert eksperiment og afhænger af den nødvendige strømning for at opretholde det ønskede perfusionstryk. Typisk er et flow på 3-4 ml/min (svarende til 5-6 omdr./min. for vores pumpe) tilstrækkeligt til et rottehjerte på 350-450 g. Hæmatokritniveauet er en determinant for perfusatviskositet21. For vores kredsløb er det optimale hæmatokritområde 25% til 30%. På trods af udnyttelsen af den mindste eksperimentelle oxygenator kan det store gasudvekslingsoverfladeareal på 0,05 m2 for et perfusatvolumen på 12 ml føre til fordampning og deraf følgende væsketab over tid. Dette væsketab kan afhjælpes ved tilsætning af destilleret vand efter behov. Det anbefales ikke at tilføje saltvand eller ringeopløsning til perfusat, da de kan forårsage hypernatriæmi. Perfusatglucosekoncentrationen bør opretholdes på 100-150 mg/dl.

Det er afgørende at undgå arytmi under perfusion, da det betyder forringelse af en eller flere fysiologiske parametre i ex situ-miljøet 10. Takyarytmi eller venstre ventrikelflimmer er almindeligvis forbundet med forskellige faktorer, såsom elektrolytisk ubalance, lav hæmatokrit, acidose / alkalose, hypertermi og overdreven efterbelastning. På den anden side er bradyarytmi hovedsageligt forårsaget af hypotermi. Lactat og kalium er nøgleparametrene ved vurdering af myokardielevedygtighed. Forhøjede laktatniveauer (>5 mmol / L) og hyperkaliæmi (>5,0 mg / dl) indikerer en betydelig grad af myokardieskade22.

Den omhyggelige overvågning af anæstesidoseringen og vejrtrækningsmønstrene hos modtagerrotten er afgørende under kirurgiske procedurer. Da dyrene ikke ventileres, kan kontinuerlig administration af overdreven anæstesi føre til hypoventilation og svigt. Den samlede laparotomi og ekstraktion af abdominale organer resulterer i betydeligt varmetab, hvilket yderligere kan forringe modtagerens tilstand. Derfor er brugen af en temperaturregulator udstyret med en varmepude og temperatursonde afgørende for at afbøde virkningen af varmetab og opretholde en stabil kropstemperatur.

Kritiske trin
De kritiske stadier i den kirurgiske procedure involverer dissektion af aortabuen og MPA, aortakanylering til ex situ-perfusion, de-airing før ex situ-perfusion og de-airing, før klemmerne fjernes efter implantation. Disse trin er meget sårbare og er ofte forbundet med fiasko. Nøglen til at overvinde disse udfordringer ligger imidlertid i at identificere den passende teknik og få tilstrækkelig praksis. Under karisolering hos recipienten skal der lægges særlig vægt på højre urinleder, som ligger tæt på IVC i retroperitonealrummet og kan efterligne lymfekanalen. I forbindelse med veneanastomose anbefales det først at sikre den kaudale ende ved hjælp af opholdssuturer efterfulgt af kranienden for at forhindre rive og stenose. Dette er især vigtigt på grund af venernes relativt skrøbelige karakter i forhold til aorta.

Begrænsninger
De kirurgiske procedurer, der er involveret i dette eksperiment, er betydeligt komplekse, især når man får donorhjertet og perfuserer blod fra det samme dyr. De funktionelle vurderinger efter implantation er begrænsede, da vi brugte en ikke-udstødende model. En udslyngningsmodel anses for at give mere avancerede resultater i et ex situ-miljø . I heterotopisk transplantation er det imidlertid begrænset på grund af tilstedeværelsen af et støttende værtshjerte i kredsløbssystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et tilskud B2021-0991 fra Chonnam National University Hospital Biomedical Research Institute og NRF-2020R1F1A1073921 fra National Research Foundation of Korea

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AES active evacuation system Smiths medical PC-6769-51A Utilize CO2 and excess isoflurane
Anesthesia machine Smiths medical PC-8801-01A Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal
B20 patient monitor GE medical systems B20 to observe mean aortic pressure and temperature
Homeothermic Monitoring System Harvard apparatus 55-7020 To monitor and maintain animal's temperature
Micro-1 Rat oxygenator Dongguan Kewei medical instruments Micro-MO For gas exchange in the langendorff circuit
Micropuncture introducer Set COOK medical G48007 for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta
Microscope Amscope MU1403 For zooming surgical field (Recipient)
Surgical loupe SurgiTel L2S09 For zooming surgical field (Donor)
Syringe pump AMP all SP-8800 To deliver cardioplegic solution
Transonic flow sensor Transonic ME3PXL-M5 Perfusion circuit flow sensor
Transonic tubing flow module Transonic TS410 flow acquiring system
Watson - Marlow pumps Harvard apparatus 010.6131.DAO Peristaltic pump used for recirculate perfusate
WBC-1510A JEIO TECH E03056D Heating bath
Sprague-Dawley rats Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye Drops SENTRIX Animal care wet ointments for eye
Cefazolin JW pharmaceutical For prophilaxis
Custodiol DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH For heart harvesting
Diclofenac Myungmoon Pharm. Co. Ltd For pain control
Heparin JW pharmaceutical Anticoagulant
Insulin JW pharmaceutical hormon therapy
Saline JW pharmaceutical For hydration therapy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langmuur, S. J. J., et al. Normothermic ex-situ heart perfusion with the organ care system for cardiac transplantation: A meta-analysis. Transplantation. 106 (9), 1745-1753 (2022).
  2. Ardehali, A., et al. Ex-vivo perfusion of donor hearts for human heart transplantation (PROCEED II): a prospective, open-label, multicentre, randomized non-inferiority trial. Lancet. 385 (9987), 2577-2584 (2015).
  3. Dang Van, S., et al. Ex vivo perfusion of the donor heart: Preliminary experience in high-risk transplantations. Archives of Cardiovascular Diseases. 114 (11), 715-726 (2021).
  4. Zhou, P., et al. Donor heart preservation with hypoxic-conditioned medium-derived from bone marrow mesenchymal stem cells improves cardiac function in a heart transplantation model. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 5f6 (2021).
  5. Messer, S., Large, S. Resuscitating heart transplantation: the donation after circulatory determined death donor.European. Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 49 (1), 1-4 (2016).
  6. Trahanas, J. M., et al. Achieving 12 hour normothermic ex situ heart perfusion: an experience of 40 porcine hearts. ASAIO Journal. 62 (4), 470-476 (2016).
  7. Yang, Y., et al. Keeping donor hearts in completely beating status with normothermicblood perfusion for transplants. The Annals of Thoracic Surgery. 95 (6), 2028-2034 (2013).
  8. Van Caenegem, O., et al. Hypothermic continuous machine perfusion enables preservation of energy charge and functional recovery of heart grafts in an ex vivo model of donation following circulatory death. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 49 (5), 1348-1353 (2016).
  9. Lu, J., et al. Normothermic ex vivo heart perfusion combined with melatonin enhances myocardial protection in rat donation after circulatory death hearts via inhibiting NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 733183 (2021).
  10. Pinnelas, R., Kobashigawa, J. A. Ex vivo normothermic perfusion in heart transplantation: a review of the TransMedics Organ Care System. Future Cardiology. 18 (1), 5-15 (2022).
  11. Fuchs, M., et al. Does the heart transplant have a future. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 55, i38-i48 (2019).
  12. Pahuja, M., Case, B. C., Molina, E. J., Waksman, R. Overview of the FDA's circulatory system devices panel virtual meeting on the TransMedics Organ Care System (OCS) Heart - portable extracorporeal heart perfusion and monitoring system. American Heart Journal. 247, 90-99 (2022).
  13. Jawitz, O. K., Devore, A. D., Patel, C. B., Bryner, B. S., Schroder, J. N. Expanding the donor pool: quantifying the potential impact of a portable organ-care system for expanded criteria heart donation. Journal of Cardiac Failure. 27 (12), 1462-1465 (2021).
  14. van Suylen, V., et al. Ex situ perfusion of hearts donated after euthanasia: a promising contribution to heart transplantation. Transplantation Direct. 7 (3), e676 (2021).
  15. Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), e0214513 (2019).
  16. Qin, G., Jernryd, T., Sjoberg, S., Steen, S., Nilsson, J. Machine perfusion for human heart preservation: A systematic review. Transplant International. 35, 10258 (2022).
  17. Dang Van, S., Brunet, D., Akamkam, A., Decante, B., Guihaire, J. Functional assessment of the donor heart during ex situ perfusion: insights from pressure-volume loops and surface echocardiography. Journal of Visual Experiments. (188), e63945 (2022).
  18. Fu, X., Segiser, A., Carrel, T. P., Tevaearai Stahel, H. T., Most, H. Rat heterotopic heart transplantation model to investigate unloading-induced myocardial remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 3, 34 (2016).
  19. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
  20. Qi, X., et al. The evaluation of constant coronary artery flow versus constant coronary perfusion pressure during normothermic ex-situ heart perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 41 (12), 1738-1750 (2022).
  21. Okahara, S., et al. A novel blood viscosity estimation method based on pressure-flow characteristics of an oxygenator during cardiopulmonary bypass. Artificial Organs. 41 (3), 262-266 (2017).
  22. Quader, M., Torrado, J. F., Mangino, M. J., Toldo, S. Temperature and flow rate limit the optimal ex-vivo perfusion of the heart - an experimental study. Journal of Cardiothoracic Surgery. 15 (1), 180 (2020).

Tags

Medicin nr. 194

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 08/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.

Section 4 of the Protocol was updated from:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.

to:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
  8. After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C. 
    NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments.
  9. Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
    NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
Rottemodel af normamymisk ex-situ perfuseret heterotopisk hjertetransplantation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kayumov, M., Jeong, I. S., Kim, D.,… More

Kayumov, M., Jeong, I. S., Kim, D., Kwak, Y., Obiweluozor, F. O., Yoon, N., Kim, H. S., Cho, H. J. Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. J. Vis. Exp. (194), e64954, doi:10.3791/64954 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter