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Modelo de rata de trasplante cardíaco heterotópico con perfusión ex-situ normotémica

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64954
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3, 2, 2,3, 4, 5, 3,6
1Department of Medical Science, Chonnam National University Graduate School, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 3Cardiovascular and Respiratory Research Team, Chonnam National University Hospital, 4Department of Internal Medicine, Chonnam National University Hospital and Medical School, 5Departments of Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 6Department of Pediatrics, Chonnam National University Children’s Hospital, and Medical School
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

En este trabajo se presenta un protocolo de evaluación de un corazón implantado heterotópicamente tras la preservación ex situ normotérmica en el modelo de rata.

Abstract

El trasplante de corazón es la terapia más eficaz para la insuficiencia cardíaca terminal. A pesar de las mejoras en los enfoques e intervenciones terapéuticas, el número de pacientes con insuficiencia cardíaca que esperan un trasplante sigue aumentando. La técnica de conservación ex situ normotérmica se ha establecido como un método comparable a la técnica convencional de almacenamiento estático en frío. La principal ventaja de esta técnica es que los corazones de los donantes pueden conservarse hasta 12 h en condiciones fisiológicas. Además, esta técnica permite la reanimación de los corazones del donante después de la muerte circulatoria y aplica las intervenciones farmacológicas necesarias para mejorar la función del donante después de la implantación. Se han establecido numerosos modelos animales para mejorar las técnicas de preservación normotérmica ex situ y eliminar las complicaciones relacionadas con la preservación. Aunque los modelos de animales grandes son fáciles de manejar en comparación con los modelos de animales pequeños, es costoso y desafiante. Presentamos un modelo de rata de preservación normotérmica ex situ del corazón de donante seguido de trasplante abdominal heterotópico. Este modelo es relativamente barato y puede ser realizado por un solo experimentador.

Introduction

El trasplante cardíaco sigue siendo la única terapia viable para la insuficiencia cardíaca refractaria 1,2,3,4. A pesar de un aumento constante en el número de pacientes que necesitan trasplante cardíaco, no se ha observado un aumento proporcional en la disponibilidad de órganos de donantes5. Para abordar este problema, se han desarrollado enfoques novedosos para preservar los corazones de los donantes con el objetivo de mejorar los desafíos y aumentar la disponibilidad de donantes 6,7,8,9.

La perfusión cardíaca nortérmica ex situ (NESHP) mediante máquinas del sistema de cuidado de órganos (OCS) ha surgido como una intervención clínica 1,3. Esta técnica se ha considerado una alternativa adecuada al método convencional de almacenamiento estático en frío (SCS) 2,9. La NESHP reduce eficazmente la duración de la isquemia fría, disminuye la demanda metabólica y facilita el suministro nutricional óptimo y la oxigenación durante el transporte de los órganos del donante10,11. A pesar del claro potencial de este método para mejorar la preservación de órganos de donantes, su aplicación clínica y la investigación posterior se han visto limitadas por los altos costos. Por lo tanto, los modelos animales preclínicos de NESHP son cruciales para identificar los desafíos técnicos clave asociados con esta técnica12,13. Los cerdos y las ratas son los modelos animales preferidos para los estudios preclínicos debido a su tolerancia isquémica9. Aunque el modelo porcino es ideal para la investigación básica y traslacional, está limitado por su alto costo y la mano de obra intensiva requerida para su cuidado y mantenimiento. Por el contrario, los modelos de ratas son menos costosos y más fáciles de manejar14.

En este estudio, introducimos un modelo simplificado de NESHP en ratas, seguido de un trasplante cardíaco heterotópico, para evaluar el impacto de la técnica de preservación en la condición del injerto después de la implantación. Este modelo es sencillo, rentable y puede ser ejecutado por un solo experimentador. La Figura 1 muestra los esquemas del procedimiento.

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Protocol

El comité de ética del Centro de Investigación con Animales de Laboratorio del Hospital Universitario Nacional de Chonnam (aprobación no. CNU IACUC - H - 2022-36) aprobó todos los experimentos con animales. Las ratas macho Sprague-Dawley (350-450 g), utilizadas en este estudio, recibieron cuidados de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de los animales de laboratorio. Las ratas fueron alojadas en habitaciones con temperatura controlada con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, con comida y agua estándar disponibles.

1. Preparación

NOTA: Un solo experimentador puede llevar a cabo todos los procedimientos experimentales.

  1. Ensamble el aparato de Langendorff, incluyendo el oxigenador, la bomba y las líneas de perfusión, antes de la cirugía (Figura 2). Llenar el circuito de perfusión con 20 mL de suero fisiológico y hacerlo circular hasta que se cebe con sangre autóloga.
    NOTA: El objetivo de este paso es calentar el circuito extracorpóreo.
  2. Conecte la vía cardiopléjica al circuito a través de la llave de paso conectada a la cánula aórtica y prepare la bomba de jeringa para la infusión cardiopléjica final.
    NOTA: Asegúrese de eliminar las burbujas de aire del circuito de perfusión y de la vía cardiopléjica.
  3. Coloque el sensor de temperatura dentro del depósito donde se almacenará el corazón del donante, manteniendo la temperatura del circuito a 37 °C.
  4. Preparaciones quirúrgicas
    1. Prepare un conjunto separado de microinstrumentos y materiales estériles para cada rata donante y receptora.
      1. Prepare el set quirúrgico para el donante: par de tijeras quirúrgicas, par de micro pinzas, pinzas afiladas para mosquitos, suturas de seda 5-0, hisopos de algodón, jeringa de 50 ml, línea de perfusión para la solución cardiopléjica (CPS), bomba de jeringa, angiocatéter de 18 G, un juego de catéteres femorales de 5 Fr. y gasas estériles.
      2. Prepare el set quirúrgico para el receptor: tijeras microquirúrgicas, retractor de heridas, par de micropinzas, pinzas para mosquitos, micropinzas vasculares, jeringa de 1 ml, suturas de polipropileno 5-0 y 9-0, suturas de seda 5-0, bastoncillos de algodón y gasas estériles.

2. Preservación del corazón del donante y extracción de sangre

  1. Inducir la anestesia en la rata donante con isoflurano (5%) en la cámara de anestesia y registrar el peso de la rata antes de colocarla en la mesa quirúrgica.
  2. Coloque a la rata en posición supina sobre la mesa quirúrgica y administre anestesia continua administrando isoflurano al 2%-2,5% con oxígeno al 90% a través de un cono nasal.
  3. Verifique la profundidad de la anestesia verificando la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie y la frecuencia de la respiración, que debe estar entre 50-60 por minuto.
    NOTA: Un nivel adecuado de anestesia es crucial para evitar estrés y dolor innecesarios a la rata donante.
  4. Aplique lubricante para los ojos y afeite la región del pubis hasta la clavícula, donde se realizará la cirugía. Limpie el área con un exfoliante a base de yodo y alcohol al 70%.
  5. Cateterismo
    1. Realizar una incisión abdominal de 7 cm en la línea media e incisiones bilaterales de 3 cm desde la apófisis xifoides hasta la mitad de la clavícula. Retire la piel de la región torácica.
    2. Con hisopos de algodón, movilice los órganos abdominales hacia el lado izquierdo del abdomen. Aislar la aorta abdominal de la fascia retroperitoneal y de los tejidos adiposos.
    3. Inyectar 1.000 UI de heparina disuelta en 0,3 ml de solución salina isotónica a través de la vena cava inferior (VCI) con una jeringa de 1 ml. Detenga el sangrado del orificio de la aguja comprimiendo suavemente con un hisopo de algodón.
      NOTA: Tenga cuidado con la embolia gaseosa durante la inyección, ya que puede provocar un paro cardíaco.
    4. Insertar un catéter femoral de 5 Fr. en la aorta abdominal (Abd. A). Asegúrese de que la punta del catéter llegue al arco aórtico. Confirme la ubicación del catéter evaluando la longitud aproximada de la parte insertada del catéter.
  6. Extracción de sangre
    1. Recolectar alrededor de 10 ml de sangre a través del catéter insertado en el Abd. A.
    2. Posteriormente, diluir la sangre de cebado con suero fisiológico isotónico hasta que el volumen total alcance los 12 mL. Añadir 5 mg de cefazolina disuelta en 0,3 mL de suero fisiológico e insulina (20 UI).
  7. Paro cardiaco
    1. Conecte la línea de perfusión CPS previamente preparada al catéter abdominal e inicie la administración de CPS con la bomba de jeringa a una velocidad de 800 mL/h.
    2. Abra la cavidad torácica desde el diafragma y corte la VCI cerca del diafragma para evitar la distensión ventricular. Corta las costillas bilateralmente a lo largo de la columna torácica hasta la entrada torácica. Reflejar la pared torácica ventral movilizada de forma superior con pinzas antimosquitos.
    3. Retire el timo por completo con micropinzas para visualizar el arco aórtico. Aplique una ligera compresión si las arterias tímicas sangran.
  8. Extracción
    1. Después de administrar todo el CPS, aísle el arco aórtico de los tejidos circundantes. Diseccione cuidadosamente justo debajo de la arteria subclavia izquierda.
    2. Transecte las arterias braquiocefálicas y carótidas comunes izquierdas en una posición distante, dejando los muñones más largos del arco aórtico para facilitar su manipulación durante la canulación de la aorta. Transecte la arteria pulmonar principal (AMP) lo más cerca posible de la bifurcación. Tenga cuidado de no dañar la orejuela auricular izquierda.
    3. Ligar cuidadosamente la vena cava superior (VCS) y la VCI con suturas de seda 5-0, evitando la obstrucción de la aurícula derecha (AR) y el seno coronario. Cubra los márgenes izquierdos del tórax con una gasa húmeda, coloque el corazón sobre él y retraiga suavemente las ligaduras de la VCS y la VCI para exponer el hilio.
    4. Ligar las venas pulmonar y ácigos junto con una sutura de seda 5-0. Cortar el tejido dorsal a la ligadura y extraer el corazón. Examina el corazón en busca de cualquier lesión. Por último, pesar el corazón antes de la canulación aórtica.

3. Perfusión ex situ

  1. Canulación y perfusión de la aorta
    1. Antes de la canulación de la aorta, reemplace el circuito preparado con solución salina con cebado sanguíneo.
    2. Inserte la cánula aórtica en el arco aórtico y asegúrela con una micropinza temporal. Asegúrese de que la punta de la cánula esté colocada en la unión braquiocefálica.
    3. Confirme la posición correcta de la cánula agarrando suavemente la aorta con micropinzas.
    4. Inicie la perfusión a un caudal de 2-3 ml/min, permitiendo que la perfusión se filtre desde el sitio de canulación para eliminar las burbujas de aire.
    5. Controle la presión y la temperatura de perfusión a través del sensor conectado al sistema de monitoreo.
    6. Masajee suavemente el corazón con los dedos índice e índice hasta que la sangre venosa se filtre de la arteria pulmonar principal (MPA).
    7. Asegure la aorta con una ligadura de seda 1-0 y retire la pinza después de verificar todos los ajustes (circuito de perfusión, presión de perfusión, temperatura).
    8. Una vez colocada la ligadura permanente, asegúrese de que el corazón comience a contraerse en unos pocos segundos y alcance el ritmo normal en 60 s. Una presión media de perfusión de 55-65 mmHg con un flujo coronario de 3-4 mL a 37 °C indica una perfusión adecuada.
    9. Recoger 0,15 ml de sangre del depósito y comprobar la gasometría (BGA) al inicio de la perfusión y cada 20 minutos a partir de entonces. Controle y registre el pH, pCO 2, pO2, glucosa, hematocrito, potasio y lactato durante la perfusión. Después de 120 min de perfusión, administrar 3 mL de Custodiol a través de la bomba de jeringa a una velocidad de 250 mL/h para detener el corazón.

4. Implantación

  1. Preparación del destinatario
    1. Iniciar la preparación del receptor 30 min antes del cese de la perfusión ex situ .
    2. Anestesiar al animal receptor utilizando el mismo método mencionado en el paso 2.2.
    3. Coloque a la rata en posición supina sobre la almohadilla térmica e inserte la sonda de temperatura en el recto para mantener la temperatura corporal a 37 °C.
    4. Aplique lubricante para los ojos, afeite el pubis en el área epigástrica y limpie el área con un exfoliante a base de yodo y alcohol al 70%.
  2. Medicamentos
    1. Inyecte 2 ml de solución salina tibia por vía subcutánea para compensar la pérdida de líquido durante la cirugía. Inyectar 200 UI de heparina por vía subcutánea.
    2. Administrar profilaxis antibiótica inyectando 10 mg/kg de cefazolina disuelta en 0,3 ml de suero fisiológico por vía subcutánea o intramuscular.
    3. Administrar el control del dolor inyectando 20 mg/kg de diclofenaco por vía subcutánea.
  3. Realizar la laparotomía de línea media e insertar un retractor para ensanchar la cavidad abdominal. Movilice los órganos abdominales hacia el lado izquierdo del receptor con hisopos de algodón para hacer espacio para el procedimiento.
  4. Evite la deshidratación envolviendo los órganos abdominales con una gasa tibia y húmeda. Esparcir de forma intermitente solución salina tibia con una jeringa de 50 ml durante la cirugía.
  5. Utilizando un microscopio quirúrgico con un aumento de 10x, movilice el duodeno y el yeyuno proximal mediante disección roma con hisopos de algodón para exponer el Abd. A. y la VCI. Prepara el Abd. A y VCI para la anastomosis e implantar sistemáticamente el corazón del donante, de acuerdo con la Figura 3 o métodos previamente documentados15.
    NOTA: No separe el Abd. A. y el IVC.
    1. Suponiendo que la anastomosis vascular se coloque infrarrenal, prepare una porción suficiente de la aorta y la VCI para el pinzamiento.
    2. Realice la preparación roma con hisopos de algodón o pinzas dentadas afiladas para eliminar las grasas y la fascia alrededor de los vasos.
    3. Coloque ligaduras de seda 5-0 en las ramas mesentéricas y en los lados craneal y caudal de los vasos principales. Elevar los vasos abdominales y coagular o ligar las ramas lumbares con suturas de seda 5-0. Recuerde preservar las arterias y venas testiculares y no pinzarlas.
    4. Use ligaduras para levantar los vasos y coloque las micropinzas en las ramas mesentéricas, los lados caudal y craneal de los vasos principales para detener el flujo sanguíneo en el sitio de la anastomosis. Apague la almohadilla térmica antes de colocar las pinzas, ya que el exceso de calor puede exacerbar la isquemia de las extremidades. Asegúrese de encender la almohadilla térmica después de quitar la abrazadera de los vasos para evitar la hipotermia.
    5. Punción de la aorta con aguja de 27 G y alargar la incisión con microtijeras hasta una longitud igual o ligeramente mayor que la abertura de la aorta ascendente donante (Asc. A), que es de aproximadamente 5 mm.
    6. Realice una incisión longitudinal en la VCI de la misma manera que la aortotomía, pero hágala 3 mm más cerca del lado caudal en comparación con la incisión de la aorta.
    7. Iniciando las anastomosis, se colocó el corazón del donante en el lado derecho del abdomen del receptor y se colocó el Asc del donante. A al Abd. A con una puntada simple interrumpida (polipropileno 9-0) en la esquina craneal de la incisión longitudinal.
    8. Mover el corazón hacia el lado izquierdo del abdomen del receptor y realizar la anastomosis del Asc del donante. A con el Abd. A utilizando una sutura de polipropileno 9-0 en funcionamiento.
    9. Fijar la arteria pulmonar donante a la VCI con dos suturas interrumpidas (polipropileno 9-0) en las esquinas caudal y craneal de la incisión longitudinal.
    10. Realizar la primera mitad de la anastomosis venosa desde el lado intraluminal del vaso y completar la segunda mitad desde el lado extraluminal del vaso. Antes de apretar los nudos, enjuague el campo con solución salina para evitar la embolia gaseosa.
  6. Desaireación y desbloqueo
    1. Retire primero la pinza de la vena mesentérica después de completar la anastomosis para permitir que el lado derecho del corazón se llene de sangre venosa.
    2. Retire el aire en el circuito coronario y Asc. A. aplicando perfusión coronaria retrógrada durante varios segundos.
    3. Coloque un trozo de gasa a ambos lados de los vasos y retire la pinza caudal y la pinza craneal.
    4. Aplique una compresión suave con bastoncillos de algodón durante 1-2 minutos. Después de asegurar una hemostasia adecuada, retire los hisopos y lave las anastomosis con solución salina tibia.
      NOTA: El corazón debe comenzar a latir dentro del primer minuto de la reperfusión. Si la temperatura corporal de la rata receptora es inferior a 35 °C, el ritmo cardíaco se normalizará después de que la temperatura alcance los 36 °C.
  7. Reemplace los órganos abdominales en forma de meandro y cierre las capas de la incisión abdominal con suturas continuas de polipropileno 5-0.
  8. Después de la cirugía, coloque al animal anestesiado en un área limpia sobre una almohadilla térmica hasta que la temperatura corporal alcance los 37 ° C.
    NOTA: No inicie los exámenes postoperatorios hasta que la temperatura corporal alcance los 37 ° C. Mantener la anestesia al 2-2,5% de isoflurano hasta el final de los experimentos.
  9. Monitorizar el ECG del corazón del donante trasplantado durante 3 h. Luego, extirpar el corazón bajo anestesia profunda para estudios histológicos.
    NOTA: Confirme la profundidad de la anestesia a través de la falta de reflejo pedal antes de extirpar el corazón. El procedimiento quirúrgico y la monitorización del ECG duran menos de 6 h. El diclofenaco, administrado perioperatoriamente (paso 4.2.3.), permite el tratamiento del dolor durante toda la duración de este procedimiento. El régimen de analgesia se puede ajustar según las pautas institucionales de uso de animales.

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Representative Results

La Figura 1 ilustra el diseño experimental utilizado en un modelo de animal pequeño. La figura 2 muestra el aparato de perfusión de Langendorff modificado, que incluye un oxigenador para animales pequeños. El orden de la anastomosis para el implante abdominal heterotópico se presenta en la Figura 3.

En la figura 4 se muestran los parámetros utilizados para evaluar la viabilidad del corazón durante la perfusión ex situ , como el lactato, el potasio y la presión aórtica media. En este estudio, el uso de la preservación ex situ normotérmica disminuyó el tiempo isquémico total de seis casos exitosos a 46,2 ± 4,7 min, mientras que el tiempo total fuera del cuerpo fue de 166,2 ± 4,7 min (Figura 5). La extracción del corazón del donante y la preparación para la perfusión ex situ y el trasplante heterotópico requirieron de 5,8 ± 1,3 min, como se muestra en la Figura 5. La tasa de éxito global de la cirugía fue del 70% y el tiempo medio de anastomosis de los seis casos exitosos fue de 38,4 ± 3,4 min. En todos los experimentos, la frecuencia cardíaca disminuyó significativamente inmediatamente después de la implantación, pero finalmente se recuperó con el tiempo, como se ilustra en la Figura 6. La estructura macroscópica de los corazones de los donantes se conservó bien después de la preservación ex situ y la implantación heterotópica, sin que se detectaran daños visibles. Sin embargo, la tinción con hematoxilina-eosina reveló un aumento del número de células inflamatorias, en su mayoría neutrófilos, después de 3 h de implantación heterotópica (Figura 7).

Figure 1
Figura 1: Diseño experimental de preservación normotérmica ex situ del corazón con trasplante cardíaco heterotópico. Abreviaturas: BGA = gasometría, CPS = solución cardiopléjica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquemas de la preservación ex situ del corazón de pequeños animales modificados. Abreviaturas: sensor de presión arterial = sensor de presión arterial, CPS = solución cardiopléjica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Orden de la anastomosis en el trasplante cardiaco heterotópico. (A) Esquemas de la posición del corazón del donante en el abdomen del receptor y orden de la anastomosis. (B) Anastomosis de la aorta ascendente del donante y de la aorta abdominal del receptor. (C) Anastomosis de la arteria pulmonar del donante y del receptor de la VCI. Abreviaturas: VI = ventrículo izquierdo, VD = ventrículo derecho, LA = aurícula izquierda, MPA = arteria pulmonar principal, VCI = vena cava inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Parámetros para la evaluación de la viabilidad durante la perfusión ex situ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Cronología de la preservación de los seis corazones conservados con éxito. Extracción cardíaca y facilitación de perfusión ex situ: 5,8 ± 1,3 min. Perfusión ex situ: 120 min. Implantación en el abdomen de la rata receptora: 38,4 ± 3,4 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Rendimiento electrofisiológico del corazón del donante antes de la obtención y después de la implantación . (A) Cambios en la frecuencia cardíaca. Pre-cosecha, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min: los tiempos después de la implantación. (B) Imágenes electrocardiográficas antes de la extracción del corazón del donante y después de 3 h de la implantación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Aspecto macroscópico (A-C) y microscópico (D-F) del corazón del donante. (A,D) Antes de la preservación ex situ normotérmica. (B,E) Después de la preservación ex situ normotérmica. (C,F) Después de 2 h de implante heterotópico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Nuestro objetivo al establecer este modelo fue replicar el trasplante de corazón humano normotérmico. Los modelos sin eyección son la técnica comúnmente preferida para preservar el corazón del donante en un ambiente ex situ 16. Si bien los modelos de eyección ofrecen muchas ventajas en la evaluación de la función cardíaca durante la perfusión ex situ 17, no son adecuados para los modelos de trasplante heterotópico. En el trasplante heterotópico, el corazón del donante implantado necesita superar la presión de poscarga sistólica creada por el corazón del huésped en el sistema circulatorio del receptor, lo que lleva a un rendimiento limitado del corazón del donante y a una subestimación en la evaluación18. Por lo tanto, los modelos no eyectivos son más favorables en el trasplante heterotópico. En los modelos sin eyección, el corazón del donante se perfunde pero no apoya la circulación del receptor, lo que limita significativamente la evaluación del rendimiento del corazón. Las evaluaciones morfológicas y moleculares, como la tinción histológica y el análisis de transferencia, pueden ser beneficiosas para examinar las afecciones cardíacas del donante cuando las evaluaciones funcionales son limitadas. Además, los marcadores metabólicos pueden evaluarse utilizando tecnologías avanzadas, como la tomografía por emisión de positrones (PET) o la resonancia magnética (RM)19. Este modelo puede ser útil para probar la eficacia a largo plazo de las intervenciones farmacológicas y genéticas antes de la implantación.

Numerosos grupos de investigación han desarrollado un modelo de preservación ex situ normotérmico, que se ha empleado con éxito para preservar corazones porcinos hasta 12 h6. Sin embargo, el mantenimiento de modelos animales grandes puede tener un costo prohibitivo para los laboratorios pequeños, ya que implica gastos sustanciales y requiere un número considerable de personal capacitado. Para abordar este problema, proponemos un método de preservación ex situ menos costoso y técnicamente sencillo, que implica el uso de sangre autóloga seguida de un trasplante cardíaco heterotópico. En particular, el costo de un solo experimento utilizando nuestro modelo es de aproximadamente $ 300. Aunque no existe un modelo equivalente de animales pequeños para comparar los costos, el aparato de perfusión ex situ para animales grandes, cuando se usa una vez, puede costar hasta $30,00016.

El protocolo presentado demuestra que todos los procedimientos experimentales pueden ser realizados de manera escalonada por un solo experimentador (Figura 3). La posibilidad de implantación heterotópica tras la preservación ex situ es otra de las ventajas de este modelo. Al canular la aorta descendente del corazón del donante para la perfusión ex situ , pudimos salvar la parte ascendente sin causar ningún daño. Además, modificamos el circuito de Langendorff, reduciendo la cantidad de solución de perfusión requerida a 12 mL para una perfusión cardíaca efectiva. La sangre de perfusión se obtuvo de la rata donante antes de la recolección, lo que nos permitió preservar el corazón con su propia sangre y evitar cualquier reacción inmunológica durante la preservación.

Modificaciones y solución de problemas
Se recomienda que el circuito de perfusión ex situ mantenga una presión media de poscarga dentro del rango de 50-70 mmHg. La presión está determinada por varios factores, como el flujo de perfusión, la resistencia de las arterias coronarias y la viscosidad de la perfusión20. La resistencia arterial coronaria es susceptible a fluctuaciones debidas a variaciones de temperatura y pH, por lo que es crucial mantener estos parámetros dentro del rango normal. El flujo de perfusión requerido varía para cada experimento y depende del flujo necesario para mantener la presión de perfusión deseada. Normalmente, un caudal de 3-4 ml/min (equivalente a 5-6 rpm para nuestra bomba) es suficiente para un corazón de rata de 350-450 g. El nivel de hematocrito es un determinante de la viscosidad de perfusión21. Para nuestro circuito, el rango óptimo de hematocrito es del 25% al 30%. A pesar de la utilización del oxigenador experimental más pequeño, la gran superficie de intercambio de gases de 0,05 m2 para un volumen de perfusión de12 mL puede provocar la evaporación y la consiguiente pérdida de líquido con el tiempo. Esta pérdida de fluido se puede rectificar mediante la adición de agua destilada según sea necesario. No se recomienda añadir solución salina o de zumbido a la perfusión, ya que pueden causar hipernatremia. La concentración de glucosa perfusada debe mantenerse en 100-150 mg/dL.

Es crucial evitar la arritmia durante la perfusión, ya que significa el deterioro de uno o más parámetros fisiológicos del ambiente ex situ 10. La taquiarritmia o fibrilación ventricular izquierda se asocian comúnmente con diversos factores, como desequilibrio electrolítico, hematocrito bajo, acidosis/alcalosis, hipertermia y poscarga excesiva. Por otro lado, la bradiarritmia es causada principalmente por hipotermia. El lactato y el potasio son los parámetros clave para evaluar la viabilidad miocárdica. Los niveles elevados de lactato (>5 mmol/L) y la hiperpotasemia (>5,0 mg/dL) indican un grado sustancial de daño miocárdico22.

El monitoreo cuidadoso de la dosis de anestesia y los patrones de respiración de la rata receptora es crucial durante los procedimientos quirúrgicos. Dado que los animales no están ventilados, la administración continua de anestesia excesiva puede provocar hipoventilación y fracaso. La laparotomía total y la extracción de los órganos abdominales dan como resultado una pérdida de calor significativa, lo que puede deteriorar aún más la condición del receptor. Por lo tanto, el uso de un controlador de temperatura equipado con una almohadilla térmica y una sonda de temperatura es crucial para mitigar el impacto de la pérdida de calor y mantener una temperatura corporal estable.

Pasos críticos
Las etapas críticas en el procedimiento quirúrgico incluyen la disección del arco aórtico y la MPA, la canulación aórtica para la perfusión ex situ, la desaireación antes de la perfusión ex situ y la desaireación antes de retirar las pinzas después de la implantación. Estos pasos son muy vulnerables y, a menudo, se asocian con el fracaso. Sin embargo, la clave para superar estos desafíos radica en identificar la técnica adecuada y adquirir suficiente práctica. Durante el aislamiento del vaso en el receptor, se debe prestar especial atención al uréter derecho, que está situado muy cerca de la VCI en el espacio retroperitoneal y puede imitar el conducto linfático. En el contexto de la anastomosis venosa, se recomienda asegurar primero el extremo caudal mediante suturas de soporte y luego el extremo craneal para evitar el desgarro y la estenosis. Esto es particularmente importante debido a la naturaleza relativamente frágil de las venas en comparación con la aorta.

Limitaciones
Los procedimientos quirúrgicos implicados en este experimento son considerablemente complejos, sobre todo cuando se obtiene el corazón del donante y se perfunde sangre del mismo animal. Las evaluaciones funcionales post-implantación son limitadas, ya que se utilizó un modelo de no expulsión. Se considera que un modelo de eyección proporciona resultados más avanzados en un entorno ex situ . Sin embargo, en el trasplante heterotópico, se ve limitado debido a la presencia de un corazón huésped de soporte en el sistema circulatorio.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo contó con el apoyo de una subvención B2021-0991 del Instituto de Investigación Biomédica del Hospital Universitario Nacional de Chonnam y NRF-2020R1F1A1073921 de la Fundación Nacional de Investigación de Corea

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AES active evacuation system Smiths medical PC-6769-51A Utilize CO2 and excess isoflurane
Anesthesia machine Smiths medical PC-8801-01A Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal
B20 patient monitor GE medical systems B20 to observe mean aortic pressure and temperature
Homeothermic Monitoring System Harvard apparatus 55-7020 To monitor and maintain animal's temperature
Micro-1 Rat oxygenator Dongguan Kewei medical instruments Micro-MO For gas exchange in the langendorff circuit
Micropuncture introducer Set COOK medical G48007 for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta
Microscope Amscope MU1403 For zooming surgical field (Recipient)
Surgical loupe SurgiTel L2S09 For zooming surgical field (Donor)
Syringe pump AMP all SP-8800 To deliver cardioplegic solution
Transonic flow sensor Transonic ME3PXL-M5 Perfusion circuit flow sensor
Transonic tubing flow module Transonic TS410 flow acquiring system
Watson - Marlow pumps Harvard apparatus 010.6131.DAO Peristaltic pump used for recirculate perfusate
WBC-1510A JEIO TECH E03056D Heating bath
Sprague-Dawley rats Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye Drops SENTRIX Animal care wet ointments for eye
Cefazolin JW pharmaceutical For prophilaxis
Custodiol DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH For heart harvesting
Diclofenac Myungmoon Pharm. Co. Ltd For pain control
Heparin JW pharmaceutical Anticoagulant
Insulin JW pharmaceutical hormon therapy
Saline JW pharmaceutical For hydration therapy

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References

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  2. Ardehali, A., et al. Ex-vivo perfusion of donor hearts for human heart transplantation (PROCEED II): a prospective, open-label, multicentre, randomized non-inferiority trial. Lancet. 385 (9987), 2577-2584 (2015).
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  4. Zhou, P., et al. Donor heart preservation with hypoxic-conditioned medium-derived from bone marrow mesenchymal stem cells improves cardiac function in a heart transplantation model. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 5f6 (2021).
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Medicina Número 194

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 08/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.

Section 4 of the Protocol was updated from:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.

to:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
  8. After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C. 
    NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments.
  9. Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
    NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
Modelo de rata de trasplante cardíaco heterotópico con perfusión ex-situ normotémica
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Kayumov, M., Jeong, I. S., Kim, D.,… More

Kayumov, M., Jeong, I. S., Kim, D., Kwak, Y., Obiweluozor, F. O., Yoon, N., Kim, H. S., Cho, H. J. Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. J. Vis. Exp. (194), e64954, doi:10.3791/64954 (2023).

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