Name: Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Scopri la ricostruzione morfologica di neuroni marcati con virus rabico modificato per neuroanatomia. Questo metodo utilizza analisi di clustering imparziali per classificare sottoclassi neuronali distinte in modo accurato.

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Vorremmo ringraziare il Dott. Ed Callaway e Marty Usrey per averci permesso di utilizzare il tessuto preparato come parte di uno studio preliminare e Libby Fairless e Shiyuan Liu per un aiuto con ricostruzioni neuronali. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH (NEI: EY018683) e la Fondazione Whitehall.

<ol><li>Cajal, S. R. y <a target="_blank" href="https://archive.org/details/b2129592x_0001">Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres</a>. , Maloine. (1911).</li>
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<li>Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+circuit+tracing+with+neurotropic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).</li>
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<li>Cauli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+fusiform+neocortical+interneurons+based+on+unsupervised+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering.</a> PNAS. 97, 6144-6149 (2000).</li>
<li>Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+visual+sector+thalamic+reticular+neurons+in+the+macaque+monkey+sugests+retinotopically-specialized%2C+parallel+stream-mixed+input+to+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus.</a> J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).</li>
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<li>Nhan, H. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+superior+colliculus-+and+middle+temporal+area-projecting+neurons+in+primate+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex.</a> J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).</li>
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<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, e3564(2012).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Research. 171, 11-28 (1979).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+neuroanatomical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Basic neuroanatomical methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1(2003).</li>
<li>Thorndike, R. L. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.177.7605">Who belongs in the family?</a> Psychometrika. 18, 267-276 (1953).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

studi neuroanatomici sono rimasti un pilastro di neuroscienze e recente interesse connectomics e le relazioni struttura-funzione ha rinnovato entusiasmo per la caratterizzazione morfologica dettagliata delle popolazioni di neuroni selettivi. Tradizionalmente, gli studi neuroanatomici hanno fatto affidamento su classificazioni qualitative di neuroni in classi morfologicamente distinte di neuroni definiti da neuroanatomisti esperti. Con i progressi nelle tecniche per la ricostruzione neuroni e l&#39;estrazione dei dati mo...

Neuroanatomy è uno dei fondamenti delle neuroscienze 1 e recente interesse &quot;connectomics&quot; ha rinnovato entusiasmo per la comprensione della diversità morfologica delle popolazioni neuronali e le connessioni tra i neuroni specifici 2. Metodi per l&#39;etichettatura e neuroni ricostruendo hanno notevolmente migliorato con le recenti innovazioni, tra cui genetica e virus-mediata circuito di tracciamento approcci 3, 4, consentendo studi morfologici più complete delle popolazioni neuronali 5. Oltre a miglioramenti nella etichettatura singoli neuroni, sono anche emerse tecniche di analisi quantitativa dei dati che consentono di classificazione indipendente e imparziale dei neuroni in sottopopolazioni distinte in base a dati morfologici 5, 6. Queste tecniche imparziali sono un miglioramento su più traditional metodi di classificazione qualitativi che sono stati lo standard nel settore per più di un secolo. L&#39;obiettivo di questo studio è quello di delineare, passo dopo passo, la combinazione di etichettatura virus-mediata di neuroni all&#39;interno di una popolazione selettivo, ricostruzioni su larga scala di un campione globale di questi neuroni, e l&#39;analisi quantitativa dei dati basata su cluster indipendente con valutazione statistica. Grazie alla combinazione di questi metodi, delineiamo un nuovo approccio verso la raccolta e l&#39;analisi dei dati neuroanatomici da facilitare la campionatura completa e imparziale la classificazione dei tipi di neuroni morfologicamente unici all&#39;interno di una popolazione neuronale selettiva. Come esempio di questi metodi, descriviamo la nostra analisi di una vasta popolazione di neuroni all&#39;interno di un singolo settore del nucleo reticolare del talamo (TRN) del macaco. Questi dati provengono da uno studio preliminare 7. Metodi per l&#39;etichettatura selettivamente i neuroni TRN proiettano al Latera dorsalil genicolato nucleo del talamo (dLGN) con iniezione chirurgica del virus della rabbia modificato codifica EGFP 4, 8 (vedi tabella di specifici materiali / attrezzature, fila 2) sono delineati. Questo virus della rabbia modificato manca il gene che codifica una proteina essenziale cappotto, eliminando movimento trans-sinaptica del virus. Una volta che il virus entra terminali degli assoni nel sito di iniezione, si comporta come un tracciante tradizionale retrograda con l&#39;importante vantaggio di guidare espressione EGFP durante l&#39;intero arborization dendritica dei neuroni infettati 5, 9, 10. Di conseguenza, questo virus della rabbia G-cancellato può essere utilizzato per infettare selettivamente etichettare qualsiasi popolazione neuronale dopo l&#39;iniezione e trasporto retrogrado. Per eseguire un&#39;analisi completa di una specifica popolazione neuronale, è importante campionareun&#39;ampia distribuzione dei neuroni all&#39;interno della popolazione. Poiché la tecnica di etichettatura virus-mediata produce completa intracellulare, &quot;Golgi-like&quot; riempie di molti neuroni con assoni nel sito di iniezione virus, è possibile ricostruire un campione molto ampio di neuroni nella misura massima di una struttura cerebrale. Inoltre, poiché il virus della rabbia modificato è così efficace a infettare ed etichettatura gran numero di neuroni, è possibile ricostruire centinaia di neuroni per animale. Procedure di campionamento 160 neuroni tutto il settore visivo del TRN 11 per generare un campione completo di dLGN sporgenti neuroni TRN sono delineati. Il processo di ricostruzione neuroni individuali utilizzando un sistema di ricostruzione neurone compreso un microscopio, fotocamera e software di ricostruzione è descritto. Anche descritto sono metodi per determinare le posizioni di singoli neuroni all&#39;interno di una struttura del cervello (in questo caso all&#39;interno del TRN) e per verificare il virus iniezione site dal volume e all&#39;interno di una struttura (in questo caso all&#39;interno del dLGN) utilizzando ricostruzioni contorno volumetriche. I passaggi per esportare i dati morfologici ed eseguire gruppo indipendente analisi basate su metriche morfologiche misurati per ogni neurone sono delineati. Ci sono limitazioni per metodi di clustering e ci sono anche una varietà di diversi algoritmi di clustering disponibili. Di conseguenza, sono descritte le opzioni ei vantaggi di alcuni degli algoritmi più comunemente usato. L&#39;analisi dei cluster non prevede la verifica statistica della unicità dei cluster. Pertanto, passaggi aggiuntivi sono delineati verificare raggruppamento ottimale nonché le relazioni tra i dati morfologici all&#39;interno e tra cluster. Metodi statistici per la valutazione cluster per il set di dati TRN per confermare che i neuroni TRN sono raggruppati in tre gruppi unici basato su 10 parametri morfologici indipendenti sono descritte. Così, delineando passi per selettivamente l&#39;etichettatura, Ricostruendo, e l&#39;analisi dei dati morfologici da una specifica popolazione neuronale, si descrivono i metodi per quantificare le differenze morfologiche tra i neuroni all&#39;interno di una popolazione. risultati precedenti di tipi neuronali distinti all&#39;interno del settore visivo del TRN scimmia macaco sono confermate con separati metodi di valutazione statistica. Insieme, ci auguriamo che queste tecniche saranno ampiamente applicabile a set di dati neuroanatomiche e aiutare a stabilire la classificazione quantitativa della diversità delle popolazioni neuronali attraverso il cervello.

<table><tbody><tr><td>SAD&Delta; G-EGFP</td><td>E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute</td><td></td><td>Preparato dal Dr. F. Osakada. Virus della rabbia G-deleted disponibile tramite il Salk Institute Nucleo virale</td></tr><tr><td>Elettrodo di registrazione: platino/iridio o tungsteno</td><td>FHC</td><td>UEPSGGSE1N2M</td><td>Visita il sito web (www.fh-co.com) per le specifiche dell'ordine alternativo</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummod Scientific</td><td>3-000-204, 110V</td><td>Alternative: picospritzer, siringa Hamilton</td></tr><tr><td>Microtomo di congelamento</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5905-50TAB</td><td>3,3'-Diaminobenzidina tetracloridrato, compressa, substrato da 10 mg per compressa. Attenzione: cancerogeno - deve essere sbiancato prima di scartare</td></tr><tr><td>Cytochrome C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2037-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldich</td><td>C9322-5G</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Life Technologies/Thermo Fisher</td><td>#A-11122&nbsp;</td><td>Anticorpi primari</td></tr><tr><td>Laboratori vettoriali</td> <td>anti-coniglio di capra biotinilata</td><td>#BA-1000</td><td>Sistema</td></tr><tr><td>Neurolucida anticorpale</td> secondario<td>Software MicroBrightField</td><td></td><td>per il tracciamento e l'analisi dei neuroni. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</td></tr><tr><td>Neurolucida Explorer</td><td>Software di esportazione dati</td><td>MicroBrightField</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera Microfire</td><td>Optronics</td><td></td><td>2-Megapixel fotocamera per microscopio a colori reali. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf</td></tr><tr><td>Nikon E800 Microscopio</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Microscopio per ricerca biologica. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks Inc.</td><td></td><td>Software di matematica computazionale basato su matrici. http://www.mathworks.com</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Programma per fogli di calcolo</td> <td>Microsoft</td><td></td></tr></tbody></table>

ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale clustering sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi popolazioni

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

Questo protocollo delinea le ricostruzioni su larga scala di neuroni in combinazione con l&#39;uso di cluster indipendente e imparziale analisi per creare un&#39;indagine completa delle caratteristiche morfologiche osservate in una popolazione neuronale selettiva. La combinazione di queste tecniche costituisce un nuovo approccio per la raccolta e l&#39;analisi dei dati neuroanatomici. Insieme, queste tecniche consentono di larga scala, e quindi più completo, il campionamento delle popolazioni neuronali selettivi e stabilire metodi quantitativi per la descrizione imparziali classi neuronali morfologicamente unici all&#39;interno di una popolazione. Il protocollo descrive l&#39;uso di virus della rabbia modificato per etichettare selettivamente i neuroni. G-cancellato atti virus della rabbia come tracciante retrogrado seguenti iniezione stereotassica in una struttura di destinazione cerebrale di interesse e serve come veicolo per l&#39;erogazione e l&#39;espressione di EGFP in neuroni. Un gran numero di neuroni sono infettate con questotecnica e di esprimere la GFP per tutta la loro dendriti, la produzione di &quot;Golgi-like&quot; riempimenti completi dei singoli neuroni. Di conseguenza, il metodo di analisi retrograda virus-mediata migliora le tecniche di tracciamento retrogrado tradizionali a base di coloranti con la produzione di riempimenti intracellulari completi. I singoli neuroni ben isolate che abbracciano tutte le regioni della zona del cervello in fase di studio sono selezionati per la ricostruzione al fine di ottenere un campione rappresentativo di neuroni. Il protocollo delinea le procedure per ricostruire corpi cellulari e completare i modelli arborizzazione dendritiche di neuroni marcati che abbracciano molteplici sezioni di tessuto. dati morfologici, comprese le posizioni di ogni neurone all&#39;interno della struttura del cervello, vengono estratti per ulteriori analisi. funzioni di programmazione standard sono stati utilizzati per eseguire gruppo indipendente analisi e valutazioni cluster basato su metriche morfologiche. Per verificare l&#39;utilità di queste analisi, valutazione statistica di un perfo cluster analysisconfermate su 160 neuroni ricostruite nel nucleo reticolare del talamo del talamo (TRN) del macaco è stato fatto. Sia la cluster analysis originale e le valutazioni statistiche svolte qui indicano che i neuroni TRN sono separati in tre sottopopolazioni, ognuno con caratteristiche morfologiche uniche.

Abbiamo dimostrato in precedenza che le ricostruzioni su larga scala di neuroni all&#39;interno di una popolazione selettivo sta seguendo iniezione fattibile del virus della rabbia modificato nel dLGN 5. Recentemente, lo stesso tessuto è stato utilizzato per ricostruire 160 neuroni nel settore visivo del TRN (Bragg et al, in revisione;. Figure 2A-B) seguendo le fasi metodologiche dettagliate qui sopra descritti. Nello studio TRN, tre gruppi u...

Questo protocollo descrive ricostruzioni su larga scala di popolazioni neuronali selettivi, etichettati dopo l&#39;infezione retrograda con esprimendo un virus della rabbia modificato marcatori fluorescenti, e le analisi di cluster indipendente, imparziale che consentono la caratterizzazione completa delle metriche morfologiche tra sottoclassi neuronali distinti.

Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Gli obiettivi di questo protocollo sono descrivere i passaggi per ricostruire la morfologia dei neuroni marcati con il virus ed eseguire analisi di clustering indipendenti e prive di bias su popolazioni di neuroni marcati, al fine di consentire una caratterizzazione completa delle metriche morfologiche all'interno di sottoclassi neuronali distinte. Illustreremo un approccio innovativo per raccogliere e analizzare dati neuroanatomici, che facilita un campionamento più completo e una classificazione senza pregiudizi dei tipi neuronali morfologicamente unici all'interno di una popolazione neuronale selettiva. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'analisi su larga scala della morfologia neuronale e utilizza metodi privi di bias per classificare sottoclassi neuronali distinte.Gli aspetti più complessi delle ricostruzioni morfologiche consistono nella selezione di neuroni ben isolati da ricostruire, nell'assegnazione della corretta profondità assiale (z) e nell'allineamento degli alberi dendritici per proseguire le ricostruzioni attraverso sezioni di tessuto adiacenti. Iniziare una ricostruzione selezionando un vetrino contenente una sezione di tessuto cerebrale di

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