Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni
15 febbraio 2017
Questo protocollo descrive ricostruzioni su larga scala di popolazioni neuronali selettivi, etichettati dopo l'infezione retrograda con esprimendo un virus della rabbia modificato marcatori fluorescenti, e le analisi di cluster indipendente, imparziale che consentono la caratterizzazione completa delle metriche morfologiche tra sottoclassi neuronali distinti.
Gli obiettivi di questo protocollo sono descrivere i passaggi per ricostruire la morfologia dei neuroni marcati con virus e di eseguire analisi di cluster indipendenti e imparziali su popolazioni di neuroni marcati per consentire una caratterizzazione completa delle metriche morfologiche lungo sottoclassi neuronali distinte. Delineiamo un nuovo approccio per la raccolta e l'analisi dei dati neuroanatomici per facilitare un campionamento più completo e una classificazione imparziale di tipi neuronali morfologicamente unici all'interno di una popolazione neuronale selettiva. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'analisi su larga scala della morfologia neuronale e utilizza metodi imparziali per classificare sottoclassi neuronali distinte.
Gli aspetti più impegnativi delle ricostruzioni morfologiche sono la selezione di neuroni ben isolati da ricostruire, l'assegnazione della corretta profondità z e l'allineamento degli alberi per continuare le ricostruzioni tra sezioni di tessuto adiacenti. Iniziare una ricostruzione selezionando un vetrino contenente una sezione di tessuto cerebrale colorata di 50 micron da un primate iniettato stereotassicamente con il virus della rabbia modificato che esprime EGFP. Posizionare il vetrino nel supporto del vetrino del microscopio e mettere a fuoco una singola sezione di interesse utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento.
Assicurati che l'immagine della fotocamera sia visibile nell'immagine dal vivo posizionando correttamente l'otturatore della fotocamera. Scegliere un neurone marcato ragionevolmente isolato all'interno della struttura cerebrale di interesse per consentire la ricostruzione inequivocabile dell'arborizzazione dendritica. Passa all'ingrandimento 10x e metti a fuoco l'area.
Scegliere preferibilmente i neuroni se il corpo cellulare si trova completamente all'interno di una singola sezione per stimare con precisione la sua area e rotondità. Una volta scelto un neurone ben colorato e ben isolato, fare clic sul pulsante della nuova sezione nel software per aggiungere la sezione iniziale contenente il corpo cellulare al gestore delle sezioni. Immettere il numero di sezioni da includere nella ricostruzione.
Si consiglia di inserire due o tre sezioni per iniziare. Assegnare uno spessore di sezione di 50 micron. Scegli i due obiettivi x, quindi fai clic sul pulsante del contorno nella barra degli strumenti in alto e scegli il tipo di contorno dal menu a discesa.
Traccia il contorno della struttura target utilizzando il mouse per fare clic sui punti lungo il contorno. Al termine del tracciato del contorno, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Chiudi contorno dal menu per chiudere il contorno. Successivamente, con la vista ancora a due x, fare clic sul simbolo dell'indicatore desiderato sulla barra degli strumenti a sinistra.
Quindi fare clic sul centro della struttura di destinazione per posizionare il marcatore. Una volta completati i contorni, selezionare l'obiettivo 40x o 60x per tracciare il contorno del corpo cellulare. Quindi seleziona il pulsante di tracciamento dei neuroni sulla barra degli strumenti in alto e seleziona la struttura del neurone da tracciare, in questo caso, il corpo cellulare, dal menu a discesa.
Traccia il corpo cellulare facendo clic sui punti attorno all'estensione massima del corpo cellulare, regolando la profondità z secondo necessità per mettere a fuoco il corpo cellulare. E facendo clic con il pulsante destro del mouse per completare il contorno del corpo della cella. Quindi, posiziona un marcatore di stile diverso al centro del contorno del corpo della cella, assicurandoti che il marcatore si trovi all'incirca al centro della profondità z.
È fondamentale stabilire la corretta profondità z nella sezione principale, così come nelle sezioni adiacenti, prima di iniziare ogni tracciamento, in modo che i valori dell'asse z siano accurati. Per iniziare a tracciare gli alberi dendritici, seleziona dendrite dal menu a discesa in alto.
Quindi traccia ogni dendrite a partire dal corpo cellulare. Quando un dendrite si ramifica, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare il nodo di biforcazione o il nodo di triforcazione per posizionare un nodo in questo punto di diramazione. Assicurati di regolare la profondità z durante il tracciato per catturare con precisione l'angolo e la direzione del dendrite.
Alla fine del dendrite in questa sezione, fai clic con il pulsante destro del mouse e seleziona la fine dal menu a discesa. Quando tutti gli alberi dendritici sono tracciati nella sezione principale, identifica quelle estremità dendritiche che probabilmente continueranno nella sezione adiacente. E metteteli a fuoco alla profondità z appropriata nell'immagine del microscopio a 20x.
Includi nell'immagine del microscopio i principali punti di riferimento nelle vicinanze, come i vasi sanguigni o i modelli o i fasci di dendriti facilmente riconoscibili. Quindi, scatta una foto dell'immagine dal vivo utilizzando una fotocamera digitale portatile sullo schermo del computer. Quindi spostare l'obiettivo del microscopio su due x e spostarsi nella sezione adiacente sul vetrino.
Quindi allineare i contorni della sezione precedentemente tracciata nella vista software con i contorni di LGN e TRN nella nuova sezione. Torna a 20x e allinea utilizzando i punti di riferimento. Quindi, con l'aiuto della foto delle terminazioni dei dendriti dalla sezione precedentemente tracciata, spostare il tracciato per allineare i dendriti utilizzando prima lo strumento freccia per selezionare la ricostruzione.
Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Sposta dal menu a discesa e spostare il tracciamento di conseguenza. Per ruotare il tracciamento, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare ruota dal menu a discesa e ruotare il tracciamento di conseguenza. In alternativa, seleziona lo strumento di corrispondenza dal menu a discesa degli strumenti in alto e seleziona il numero di punti da abbinare.
Quindi fare clic sulla fine nella ricostruzione e sul punto di continuazione corrispondente nell'immagine dal vivo per abbinare le finali dendritiche agli inizi. Una volta che il tracciato della sezione precedente è allineato con i dendriti nella nuova sezione, aggiungere una nuova sezione al gestore della sezione come prima. In alternativa, è sufficiente selezionare la sezione adiacente creata in precedenza e regolare la profondità z nello stesso modo.
Assicurati che la nuova sezione corrispondente sia selezionata nel gestore delle sezioni facendo clic sulla sezione corrente. Quindi, dopo aver aumentato l'ingrandimento a 40x o 60x, selezionare il dendrite utilizzando la freccia. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'estremità del dendrite della sezione precedente e selezionare aggiungi alla fine dal menu a discesa.
Un prompt chiederà se la continuazione si trova in una nuova sezione. Fare clic su Sì. Quindi traccia la continuazione del dendrite usando il mouse come strumento di disegno.
Scatta immagini dei finali in preparazione per l'allineamento alla sezione successiva. Quindi aggiungere continuazioni ai tracciati dendritici fino a quando non vengono tracciate almeno tre sezioni per il neurone o fino a quando i dendriti non possono più essere seguiti o trovati. Utilizzando un programma di estrazione associato al sistema di ricostruzione neuronale, aprire un file di ricostruzione completato.
Dal menu a discesa di modifica, selezionare Seleziona tutti gli oggetti. Selezionare Analisi struttura rami dalla barra degli strumenti di analisi superiore, quindi fare clic su ciascuna scheda e selezionare le opzioni di analisi desiderate in ciascuna scheda. Estrarre tutti i dati desiderati facendo clic sul pulsante OK nella finestra di analisi e salvarli in un foglio di calcolo facendo clic con il pulsante destro del mouse sulle finestre di output e selezionando esporta in Excel per ulteriori analisi.
Questa fotografia mostra una singola sezione coronale attraverso l'LGN dorsale di un animale. La colorazione con citocromo ossidasi viene utilizzata per visualizzare gli strati di LGN. E la colorazione GFP segna il sito di iniezione del virus.
La freccia indica le regioni di neuroni densi, marcati retrogradamente, del nucleo reticolare talamico. L'orientamento della sezione è in base alla bussola laterale mediale ventrale dorsale illustrata. La barra della scala è illustrata nell'angolo in basso a sinistra.
Questa immagine mostra i contorni del LGN in rosso e del TRN in marrone per tutte le sezioni contenenti iniezione di virus, come indicato dai contorni neri. Le stelle gialle indicano i centri dei siti di iniezione. Questa immagine mostra il rendering 3D dei contorni e del sito di iniezione.
Questa è una mappa delle posizioni dei neuroni TRN ricostruiti, codificati a colori in base all'assegnazione del cluster all'interno di un singolo contorno TRN aggregato mostrato in marrone. La barra della scala rappresenta 500 micron. Questa immagine mostra i contorni aggregati del TRN in nero e dell'LGN in grigio con cinque neuroni TRN ricostruiti colorati da caldi a freddi in base alla loro posizione laterale mediale all'interno del TRN.
La barra della scala rappresenta 500 micron. Queste fotografie mostrano i dettagli degli stessi cinque neuroni TRN con barre di scala abbinate al colore che rappresentano 100 micron. Questo albero gerarchico del dendrogramma illustra le distanze di collegamento tra 160 neuroni TRN ricostruiti sulla base di 10 metriche morfologiche indipendenti e mostra i risultati complessivi dell'analisi dei cluster.
Tre distinti gruppi di neuroni TRN sono illustrati in blu, verde e rosso. Una volta padroneggiate queste tecniche di ricostruzione neuronale, un singolo neurone può essere completamente ricostruito in una o due ore. È importante monitorare e regolare costantemente la profondità z durante la ricostruzione dei neuroni.
Il protocollo qui delineato è un miglioramento rispetto ai metodi di analisi neuroanatomica tradizionali, più distorti, e consente ai ricercatori di esplorare nuove sottoclassi di neuroni sulla base di dati morfologici su larga scala. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ricostruire i neuroni attraverso sezioni di tessuto adiacenti ed estrarre dati morfologici per ulteriori analisi.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per ricostruire la morfologia dei neuroni marcati mediante infezione retrograda con un virus della rabbia modificato. Si concentra su analisi di clustering senza pregiudizi al fine di caratterizzare sottoclassi neuronali distinte in base a parametri morfologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Neuroanatomia
- Biologia cellulare
Sfondo
- Comprendere la morfologia neuronale è fondamentale per classificare i tipi neuronali.
- I metodi tradizionali possono introdurre bias nell'analisi morfologica.
- Il virus della rabbia modificato può etichettare efficacemente popolazioni neuronali specifiche.
- Le analisi di clustering prive di bias migliorano la caratterizzazione delle sottoclassi neuronali.
Scopo dello studio
- Ricostruire la morfologia dei neuroni marcati con il virus.
- Eseguire analisi di clustering senza bias sulle popolazioni di neuroni marcati.
- Facilitare la caratterizzazione completa di sottoclassi neuronali distinte.
Metodi Utilizzati
- Selezione di neuroni ben isolati per la ricostruzione.
- Assegnazione della profondità z appropriata per una rappresentazione accurata della morfologia.
- Allineamento degli alberi tra sezioni di tessuto adiacenti.
- Utilizzo di un microscopio per mettere a fuoco sezioni di tessuto cerebrale colorate.
Risultati principali
- Analisi su larga scala della morfologia neuronale completata con successo.
- Identificazione di tipi neuronali morfologicamente unici.
- Classificazione senza pregiudizi di sottoclassi neuronali distinte.
- Migliorata comprensione della raccolta e dell'analisi dei dati neuroanatomici.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un quadro solido per la ricostruzione della morfologia neuronale.
- Metodi privi di bias migliorano l'accuratezza della classificazione delle sottoclassi neuronali.
- Questo approccio può facilitare futuri studi di neuroanatomia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente una classificazione morfologica su larga scala e priva di bias delle popolazioni neuronali, supportando la validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'identificazione dei sottotipi neuronali. L'approccio aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici fornendo metriche quantitative e riproducibili per ridurre i rischi associati alle ipotesi sugli obiettivi legate alla funzione dei circuiti neuronali. Posiziona il fenotipaggio morfologico come uno strumento scalabile nella fase di scoperta, utile per prioritizzare obiettivi caratterizzati da una forte continuità traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso la classificazione senza pregiudizi delle sottoclassi neuronali basata su parametri morfologici.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico stabilendo criteri quantitativi per distinguere popolazioni neuronali funzionalmente distinte.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia sul bersaglio collegando l'unicità morfologica a una potenziale risposta differenziale ai farmaci in popolazioni neuronali selettive.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi neuronali validati per lo sviluppo di saggi successivi, definendo sottoclassi morfologicamente distinte per modelli cellulari coerenti.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso l'estrazione di dati morfologici quantitativi adatti a piattaforme di screening ad alto contenuto.
- Scalabilità: Permette il riutilizzo della piattaforma su diverse popolazioni neuronali, stabilendo un flusso di lavoro trasferibile per la ricostruzione e il raggruppamento su larga scala.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Supporta la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie consentendo la classificazione di tipi neuronali in regioni cerebrali di primati pertinenti ai bersagli dei disturbi neuropsichiatrici.
- Allineamento Preclinico: Facilita decisioni di avanzamento corrette per il rischio fornendo biomarcatori morfologici che si correlano con l'attivazione di percorsi specifici per sottotipi neuronali.
- De-risking Meccanicistico: Riduce il rischio biologico in fasi avanzate mediante la validazione della selettività del bersaglio attraverso un profilo morfologico completo delle popolazioni neuronali fuori bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dal test iniziale dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto guida, in cui la classificazione morfologica orienta lo screening dei composti in sistemi neuronali rilevanti per la malattia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'identificazione senza pregiudizi di sottoclassi neuronali che possono modulare in modo differenziale circuiti rilevanti per la malattia.
- Screening: Migliora la prontezza del saggio fornendo output morfologici quantitativi che garantiscono coerenza nei modelli neuronali utilizzati per la valutazione dei composti.
- Analisi: Fornisce analisi statistica dei cluster e metriche morfologiche che consentono il confronto tra popolazioni neuronali in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica attraverso il profilo morfologico in sistemi neuronali di primati, con rilevanza per i bersagli cerebrali umani.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di profilazione neuroanatomica riutilizzabile, applicabile a diverse popolazioni neuronali e regioni cerebrali per la validazione dei bersagli su tutta la linea di prodotti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella classificazione dei sottotipi neuronali.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della generazione di dati morfologici tra laboratori e studi.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di proseguimento o interruzione progettuale, consentendo una riduzione precoce dei rischi associati agli obiettivi sulla base della specificità per sottoclasse neuronale, riducendo così il rischio di fallimento biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione delle decisioni di sviluppo con adeguamento al rischio, grazie a una classificazione oggettiva della morfologia delle popolazioni neuronali in modelli preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nel tracciamento neuroanatomico, nella microscopia confocale e nell'utilizzo di software di ricostruzione 3D per un'accurata acquisizione della morfologia neuronale.
- È dipendente da infrastrutture microscopiche in grado di effettuare sezioni in z e di realizzare immagini fluorescenti di sezioni di tessuto spesse, insieme a strumenti computazionali per l'estrazione morfologica e l'analisi di cluster.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di tracciamento e delle definizioni delle metriche morfologiche, al fine di garantire la riproducibilità tra diversi siti e operatori.
- Richiede valutazioni di adattamento nell'applicare il metodo a diverse popolazioni neuronali, regioni cerebrali o specie, a causa delle variazioni nella morfologia e nell'efficienza di marcatura.
- I limiti pratici includono la natura particolarmente dispendiosa in termini di tempo del tracciamento manuale e la dipendenza da un'etichettatura virale di alta qualità e da una conservazione ottimale del tessuto per ricostruzioni affidabili.
