Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni

Questo protocollo descrive ricostruzioni su larga scala di popolazioni neuronali selettivi, etichettati dopo l'infezione retrograda con esprimendo un virus della rabbia modificato marcatori fluorescenti, e le analisi di cluster indipendente, imparziale che consentono la caratterizzazione completa delle metriche morfologiche tra sottoclassi neuronali distinti.

Gli obiettivi di questo protocollo sono descrivere i passaggi per ricostruire la morfologia dei neuroni marcati con virus e di eseguire analisi di cluster indipendenti e imparziali su popolazioni di neuroni marcati per consentire una caratterizzazione completa delle metriche morfologiche lungo sottoclassi neuronali distinte. Delineiamo un nuovo approccio per la raccolta e l'analisi dei dati neuroanatomici per facilitare un campionamento più completo e una classificazione imparziale di tipi neuronali morfologicamente unici all'interno di una popolazione neuronale selettiva. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'analisi su larga scala della morfologia neuronale e utilizza metodi imparziali per classificare sottoclassi neuronali distinte.

Gli aspetti più impegnativi delle ricostruzioni morfologiche sono la selezione di neuroni ben isolati da ricostruire, l'assegnazione della corretta profondità z e l'allineamento degli alberi per continuare le ricostruzioni tra sezioni di tessuto adiacenti. Iniziare una ricostruzione selezionando un vetrino contenente una sezione di tessuto cerebrale colorata di 50 micron da un primate iniettato stereotassicamente con il virus della rabbia modificato che esprime EGFP. Posizionare il vetrino nel supporto del vetrino del microscopio e mettere a fuoco una singola sezione di interesse utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento.

Assicurati che l'immagine della fotocamera sia visibile nell'immagine dal vivo posizionando correttamente l'otturatore della fotocamera. Scegliere un neurone marcato ragionevolmente isolato all'interno della struttura cerebrale di interesse per consentire la ricostruzione inequivocabile dell'arborizzazione dendritica. Passa all'ingrandimento 10x e metti a fuoco l'area.

Scegliere preferibilmente i neuroni se il corpo cellulare si trova completamente all'interno di una singola sezione per stimare con precisione la sua area e rotondità. Una volta scelto un neurone ben colorato e ben isolato, fare clic sul pulsante della nuova sezione nel software per aggiungere la sezione iniziale contenente il corpo cellulare al gestore delle sezioni. Immettere il numero di sezioni da includere nella ricostruzione.

Si consiglia di inserire due o tre sezioni per iniziare. Assegnare uno spessore di sezione di 50 micron. Scegli i due obiettivi x, quindi fai clic sul pulsante del contorno nella barra degli strumenti in alto e scegli il tipo di contorno dal menu a discesa.

Traccia il contorno della struttura target utilizzando il mouse per fare clic sui punti lungo il contorno. Al termine del tracciato del contorno, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Chiudi contorno dal menu per chiudere il contorno. Successivamente, con la vista ancora a due x, fare clic sul simbolo dell'indicatore desiderato sulla barra degli strumenti a sinistra.

Quindi fare clic sul centro della struttura di destinazione per posizionare il marcatore. Una volta completati i contorni, selezionare l'obiettivo 40x o 60x per tracciare il contorno del corpo cellulare. Quindi seleziona il pulsante di tracciamento dei neuroni sulla barra degli strumenti in alto e seleziona la struttura del neurone da tracciare, in questo caso, il corpo cellulare, dal menu a discesa.

Traccia il corpo cellulare facendo clic sui punti attorno all'estensione massima del corpo cellulare, regolando la profondità z secondo necessità per mettere a fuoco il corpo cellulare. E facendo clic con il pulsante destro del mouse per completare il contorno del corpo della cella. Quindi, posiziona un marcatore di stile diverso al centro del contorno del corpo della cella, assicurandoti che il marcatore si trovi all'incirca al centro della profondità z.

È fondamentale stabilire la corretta profondità z nella sezione principale, così come nelle sezioni adiacenti, prima di iniziare ogni tracciamento, in modo che i valori dell'asse z siano accurati. Per iniziare a tracciare gli alberi dendritici, seleziona dendrite dal menu a discesa in alto.

Quindi traccia ogni dendrite a partire dal corpo cellulare. Quando un dendrite si ramifica, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare il nodo di biforcazione o il nodo di triforcazione per posizionare un nodo in questo punto di diramazione. Assicurati di regolare la profondità z durante il tracciato per catturare con precisione l'angolo e la direzione del dendrite.

Alla fine del dendrite in questa sezione, fai clic con il pulsante destro del mouse e seleziona la fine dal menu a discesa. Quando tutti gli alberi dendritici sono tracciati nella sezione principale, identifica quelle estremità dendritiche che probabilmente continueranno nella sezione adiacente. E metteteli a fuoco alla profondità z appropriata nell'immagine del microscopio a 20x.

Includi nell'immagine del microscopio i principali punti di riferimento nelle vicinanze, come i vasi sanguigni o i modelli o i fasci di dendriti facilmente riconoscibili. Quindi, scatta una foto dell'immagine dal vivo utilizzando una fotocamera digitale portatile sullo schermo del computer. Quindi spostare l'obiettivo del microscopio su due x e spostarsi nella sezione adiacente sul vetrino.

Quindi allineare i contorni della sezione precedentemente tracciata nella vista software con i contorni di LGN e TRN nella nuova sezione. Torna a 20x e allinea utilizzando i punti di riferimento. Quindi, con l'aiuto della foto delle terminazioni dei dendriti dalla sezione precedentemente tracciata, spostare il tracciato per allineare i dendriti utilizzando prima lo strumento freccia per selezionare la ricostruzione.

Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Sposta dal menu a discesa e spostare il tracciamento di conseguenza. Per ruotare il tracciamento, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare ruota dal menu a discesa e ruotare il tracciamento di conseguenza. In alternativa, seleziona lo strumento di corrispondenza dal menu a discesa degli strumenti in alto e seleziona il numero di punti da abbinare.

Quindi fare clic sulla fine nella ricostruzione e sul punto di continuazione corrispondente nell'immagine dal vivo per abbinare le finali dendritiche agli inizi. Una volta che il tracciato della sezione precedente è allineato con i dendriti nella nuova sezione, aggiungere una nuova sezione al gestore della sezione come prima. In alternativa, è sufficiente selezionare la sezione adiacente creata in precedenza e regolare la profondità z nello stesso modo.

Assicurati che la nuova sezione corrispondente sia selezionata nel gestore delle sezioni facendo clic sulla sezione corrente. Quindi, dopo aver aumentato l'ingrandimento a 40x o 60x, selezionare il dendrite utilizzando la freccia. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'estremità del dendrite della sezione precedente e selezionare aggiungi alla fine dal menu a discesa.

Un prompt chiederà se la continuazione si trova in una nuova sezione. Fare clic su Sì. Quindi traccia la continuazione del dendrite usando il mouse come strumento di disegno.

Scatta immagini dei finali in preparazione per l'allineamento alla sezione successiva. Quindi aggiungere continuazioni ai tracciati dendritici fino a quando non vengono tracciate almeno tre sezioni per il neurone o fino a quando i dendriti non possono più essere seguiti o trovati. Utilizzando un programma di estrazione associato al sistema di ricostruzione neuronale, aprire un file di ricostruzione completato.

Dal menu a discesa di modifica, selezionare Seleziona tutti gli oggetti. Selezionare Analisi struttura rami dalla barra degli strumenti di analisi superiore, quindi fare clic su ciascuna scheda e selezionare le opzioni di analisi desiderate in ciascuna scheda. Estrarre tutti i dati desiderati facendo clic sul pulsante OK nella finestra di analisi e salvarli in un foglio di calcolo facendo clic con il pulsante destro del mouse sulle finestre di output e selezionando esporta in Excel per ulteriori analisi.

Questa fotografia mostra una singola sezione coronale attraverso l'LGN dorsale di un animale. La colorazione con citocromo ossidasi viene utilizzata per visualizzare gli strati di LGN. E la colorazione GFP segna il sito di iniezione del virus.

La freccia indica le regioni di neuroni densi, marcati retrogradamente, del nucleo reticolare talamico. L'orientamento della sezione è in base alla bussola laterale mediale ventrale dorsale illustrata. La barra della scala è illustrata nell'angolo in basso a sinistra.

Questa immagine mostra i contorni del LGN in rosso e del TRN in marrone per tutte le sezioni contenenti iniezione di virus, come indicato dai contorni neri. Le stelle gialle indicano i centri dei siti di iniezione. Questa immagine mostra il rendering 3D dei contorni e del sito di iniezione.

Questa è una mappa delle posizioni dei neuroni TRN ricostruiti, codificati a colori in base all'assegnazione del cluster all'interno di un singolo contorno TRN aggregato mostrato in marrone. La barra della scala rappresenta 500 micron. Questa immagine mostra i contorni aggregati del TRN in nero e dell'LGN in grigio con cinque neuroni TRN ricostruiti colorati da caldi a freddi in base alla loro posizione laterale mediale all'interno del TRN.

La barra della scala rappresenta 500 micron. Queste fotografie mostrano i dettagli degli stessi cinque neuroni TRN con barre di scala abbinate al colore che rappresentano 100 micron. Questo albero gerarchico del dendrogramma illustra le distanze di collegamento tra 160 neuroni TRN ricostruiti sulla base di 10 metriche morfologiche indipendenti e mostra i risultati complessivi dell'analisi dei cluster.

Tre distinti gruppi di neuroni TRN sono illustrati in blu, verde e rosso. Una volta padroneggiate queste tecniche di ricostruzione neuronale, un singolo neurone può essere completamente ricostruito in una o due ore. È importante monitorare e regolare costantemente la profondità z durante la ricostruzione dei neuroni.

Il protocollo qui delineato è un miglioramento rispetto ai metodi di analisi neuroanatomica tradizionali, più distorti, e consente ai ricercatori di esplorare nuove sottoclassi di neuroni sulla base di dati morfologici su larga scala. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ricostruire i neuroni attraverso sezioni di tessuto adiacenti ed estrarre dati morfologici per ulteriori analisi.