Analisi di AtHIRD11 intrinseco disordine e l'associazione verso gli ioni del metallo di elettroforesi capillare ed elettroforesi capillare di affinità

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti in tettonica le proteine di disordine intrinseco come i cambiamenti conformazionali dovuti al legame del ferro metallico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede pochissima attrezzatura e i risultati possono essere ottenuti molto rapidamente. A dimostrare la procedura sarà Matthias Stein, uno studente laureato del mio laboratorio.

Per iniziare, utilizzare un tagliavetro su una lastra di vetro per tagliare un capillare di silice fusa nuda con un rivestimento esterno in poliammide e un diametro interno di 50 micron in lunghezze di 33 e 30 centimetri. Utilizzare una penna per contrassegnare il centro di una finestra di rilevamento larga un centimetro a una distanza di 24,5 centimetri da un'estremità del capillare per l'esperimento CGE e a 21,5 centimetri da un'estremità del capillare per l'esperimento ACE. Usando una fiamma ossidrica, bruciare il rivestimento esterno in poliammide 0,5 centimetri prima e dopo ogni segno.

Allo stesso modo, utilizzare la fiamma ossidrica per rimuovere un centimetro di rivestimento su entrambe le estremità dei capillari. Quindi, utilizzare etanolo e un panno molle per pulire le estremità dei capillari e le finestre di rilevamento. Installare un capillare nel sistema CE con la finestra di rilevamento vicino alla presa.

Dopo aver preparato le soluzioni, secondo il protocollo di testo, utilizzare una soluzione di cloruro di calcio da 250 micromolari per riempire una siringa da 10 millilitri. Quindi collegare un filtro PVDF da 0,2 micron alla siringa e spingere 2 millilitri di soluzione attraverso il filtro per scartarlo. Utilizzare il cloruro di calcio rimanente nella siringa per riempire 10 flaconcini fino al volume massimo consentito.

Etichettare ogni fiala come flaconcino di ingresso della soluzione di cloruro di calcio da 250 micromolari. Quindi, utilizzando la soluzione di cloruro di calcio, riempire 10 fiale a metà. Contrassegnare ciascuno come flaconcino di uscita della soluzione di cloruro di calcio da 250 micromolari.

Quindi, con altre soluzioni contenenti sale metallico, riempire le fiale in modo simile. Inoltre, per ogni coppia di fiale di ingresso e uscita, utilizzare 30 tampone Tris micromolare per preparare un set simile di fiale di ingresso e uscita. Con 60 marcatori micromolari di acetanilide EOF, riempire 10 flaconcini.

Quindi utilizzare la soluzione campione da un milligrammo per millilitro per riempire una fiala. Dopo aver preparato l'analisi, secondo il protocollo di testo, eseguire la separazione iniettando idrodinamicamente la soluzione campione per gli esperimenti CGE e applicando 0,1 bar per quattro minuti all'ingresso. Quindi, applicare 16,5 kilovolt negativi e una pressione di 2,0 bar su entrambe le estremità del capillare per 25 minuti.

Dopo aver preparato il metodo per le misurazioni senza ligandi, preparare il metodo per le misurazioni con ligandi utilizzando prima una soluzione di EDTA 0,1 molare per sciacquare il capillare a 2,5 bar per 1 minuto. Quindi utilizzare acqua deionizzata per risciacquare il capillare. Quindi, equilibrare il capillare utilizzando la soluzione di legante per risciacquarlo a 2,5 bar per 1,5 minuti.

Quindi, iniettare la soluzione di acetanilide a 0,05 bar per 6 secondi e sostituire i flaconcini di ingresso e di uscita con il ligando contenente i flaconcini tampone. Applicare 0,05 bar per 2,4 secondi per spingere la soluzione di acetanilide più in profondità dalla punta del capillare. Applicare 10,0 kilovolt per 6 minuti e rilevare il picco dell'acetanilide a una lunghezza d'onda di 200 nanometri.

Dopo aver risciacquato il capillare con acqua deionizzata EDTA e la soluzione di ligando, come prima, iniettare il campione proteico e sostituire le fiale di ingresso e di uscita con fiale di ligando fresche contenenti fiale tampone. In alternativa, ripetere le misurazioni con e senza leganti. Quindi, ripetere il metodo utilizzando le soluzioni di leganti alcalino-terrosi.

Infine, utilizzare le seguenti soluzioni per eseguire lo stesso metodo. Quindi, calcola la variazione dei rapporti di dimensione della carica per le varie interazioni proteina-ione metallo. Qui è mostrato l'elettroferogramma per il campione AtHIRD11 ottenuto durante gli esperimenti CGE.

La dimensione del peptide aumenta da sinistra a destra. Il picco numero quattro ha la massa più grande e indica la proteina intatta. I picchi più piccoli, due e tre, rappresentano impurità più piccole.

Questa figura rappresenta l'elettroferogramma per l'acetanilide durante gli esperimenti ACE. La soluzione di acetanilide mostra un solo picco elevato poiché non dovrebbe avere impurità. Il tempo di rilevamento per il picco massimo indica il tempo di migrazione del flusso elettroosmotico e viene utilizzato per il calcolo dell'interazione.

Questo elettroferogramma del campione AtHIRD11 durante l'esperimento ACE è stato eseguito in assenza di SDS e ioni metallici. Oltre alle due impurità dell'elettroferogramma CGE, sono presenti almeno cinque picchi, che sono correlati alla proteina stessa. Qui viene mostrata una valutazione grafica degli spostamenti temporali di migrazione misurati in presenza dei vari ioni metallici per il picco sei.

È rappresentato dal valore calcolato Delta R su RF. Ogni risultato indica l'intensità di uno spostamento in base al suo valore e al suo segno, come indicato dal cambiamento complessivo nella carica dei complessi ionici metallici proteici. Una volta padroneggiata, la tecnica può essere eseguita per un partner di interazione in otto ore, inclusa l'interazione CGE, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di cambiare le soluzioni proteiche per misurazioni a lungo termine poiché i prodotti di degradazione possono aumentare nel tempo e di cambiare le soluzioni tampone Tris per ottenere risultati più precisi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come tagliare e pulire un capillare, nonché impostare un metodo di elettroforesi capillare di affinità, al fine di valutare il comportamento di legame delle proteine intrinsecamente disordinate.