Ce travail décrit un protocole de différenciation in vitro pour produire pigmentées, mélanocytes matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines par une crête neurale et mélanoblaste étape intermédiaire en utilisant un protocole de 25 jours sans alimentation.
Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.
Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) fournissent une plate – forme pour imiter la différenciation normale de façon évolutive pour la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues, et les thérapies de remplacement cellulaire 1-6. D'un intérêt particulier, hPSCs ouvrent des pistes pour l'étude difficile d'isoler ou de types rares / transitoires cellulaires où les échantillons des patients sont rares. Les cellules souches pluripotentes En outre, induites (CSPi) permettent aux chercheurs d'étudier le développement et la modélisation de la maladie d'une manière spécifique au patient de démêler les mécanismes uniques 1,2,7-11. Le protocole précédemment publié pour la différenciation des mélanocytes de hPSCs nécessite jusqu'à 6 semaines de différenciations et implique la culture de cellules avec un milieu conditionné à partir de cellules L-Wnt3a 12. Le premier protocole présenté par Mica et al. Et décrit ici produit des cellules pigmentées en trois semaines et supprime l'ambiguïté et les incohérences associées à un milieu conditionné.
mélanocytes are dérivé de la crête neurale, une population migratoire des cellules uniques aux vertébrés. La crête neurale est définie lors de la gastrulation et représente une population de cellules sur le bord de la plaque neurale, en bordure entre le neuronal et ectoderme non-neural. Au cours de la neurulation, le tissu nerveux évolue à partir d' une plaque de neurones pour former des plis neuraux, qui convergent vers la ligne médiane dorsale entraînant la 13,14 du tube neural.
Les cellules de la crête neurale émergent de la plaque de toit du tube neural, opposée à la notochorde et subissent une transition épithélio-mésenchymateuse avant de migrer loin de donner lieu à une population diverse de cellules différenciées. Le sort des cellules de la crête sont définies en partie par la localisation anatomique de la plaque de toit le long de l'axe du corps de l'embryon. les dérivés de cellules neurales comprennent des crêtes caractéristiques des deux lignées mésoderme (cellules musculaires lisses, les ostéoblastes, les adipocytes, les chondrocytes) et les cellules ectodermiques (mélanocytes, c Schwannaunes, neurones) 14. Les cellules souches de la crête neurale régulation positive du facteur de transcription SOX10 et peuvent être isolés par des cellules activées par fluorescence de tri avec des anticorps dirigés contre p75 et HNK1.
Les cellules de la crête neurale Fated pour devenir mélanocytes passent par un stade de mélanoblaste et régulent positivement KIT et MITF (microphtalmie associée facteur de transcription) 6,21 MITF est un régulateur maître du développement des mélanocytes et est un facteur de transcription responsable du contrôle beaucoup du développement des mélanocytes 22- 24. mélanoblastes humaines migrent vers la couche basale de l'épiderme où ils résident soit dans le renflement de cheveux ou entouré par les kératinocytes de l'épiderme (unités formant pigmentaires) pour servir de précurseurs des mélanocytes, pigmentées matures. La différenciation et la maturation des mélanoblastes dans les melanocytes pigmentés se produit concomitant avec la colonisation du bulbe pileux et l'expression de la filière de production de mélanine (TYRP1, TYR, et OCA2PMEL) 25,26.
Isoler mélanocytes humains et mélanoblastes des patients est coûteux, difficile et de limiter en quantité. Ce protocole permet aux chercheurs de différencier hPSCs (induite ou embryonnaire) dans les mélanocytes ou des précurseurs de mélanocytes dans un procédé rapide, reproductible, évolutive et économique bien défini sans tri cellulaire. Le protocole a été précédemment utilisé pour identifier des défauts spécifiques de la maladie lors de la différenciation iPSCs des patients atteints de troubles de la pigmentation.
Pour la différenciation réussie de mélanocytes de hPSCs les suggestions suivantes devraient être prises en considération. Tout d'abord, il est essentiel de travailler dans des conditions de culture stériles en tout temps. En outre, il est important de commencer par pluripotentes, hPSCs complètement indifférenciées; si la population de départ contient des cellules différenciées, le rendement sera invariablement tomber que les contaminants ne peuvent pas être dirigées vers mélanocytes et peuvent encore …
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par une bourse pour les chercheurs de mélanome de la Fondation M. Joanna Nicolay et par les Instituts nationaux de la santé en vertu de Ruth L. Award Research Service national Kirschstein F31. Ce travail a également été soutenu par des subventions de NYSTEM et l'initiative sur les cellules souches Tri-institutionnelle (Starr Foundation).
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133–032 | |
DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Human insulin | Sigma | I2643 | |
ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032g in 100ml 100% ethanol |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
Selenite | Sigma | S5261 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |