Summary
يصف هذا العمل في المختبر بروتوكول التمايز لإنتاج الصباغية، الخلايا الصباغية ناضجة من خلايا جذعية المحفزة الإنسان عبر قمة العصبية وميلانينية المرحلة المتوسطة باستخدام، بروتوكول خالية من تغذية 25 يوما.
Introduction
الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) توفير منصة لتقليد التمايز الطبيعي بطريقة قابلة للنمذجة المرض، وفحص المخدرات، والعلاجات البديلة للخلية 1-6. ذات أهمية خاصة، hPSCs تفتح آفاقا لدراسة الصعب عزل أو أنواع الخلايا نادرة / عابرة حيث عينات المرضى شحيحة. وعلاوة على ذلك، التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) تمكن الباحثون لدراسة تطوير والنمذجة المرض بطريقة محددة المريض لكشف آليات فريدة 1،2،7-11. يتطلب بروتوكول نشرت سابقا عن تمايز الخلايا الصباغية من hPSCs تصل إلى 6 أسابيع من التفرقة وينطوي على خلايا زراعة مع المتوسط مكيفة من خلايا L-Wnt3a 12. بروتوكول قدمت لأول مرة من قبل ميكا وآخرون وصفت هنا تنتج الخلايا الصباغية في ثلاثة أسابيع وإزالة الغموض والتناقضات المرتبطة المتوسطة مشروط.
الخلايا الصباغية عالبريد المستمدة من قمة العصبية، والسكان المهاجرين من خلايا فريدة من نوعها لالفقاريات. يتم تعريف قمة العصبية خلال المعيدة ويمثل السكان من الخلايا على حافة لوحة العصبية، على الحدود بين العصبية والأديم الظاهر غير العصبية. أثناء تكون العصيبة، النسيج العصبي يتطور من لوحة العصبية لتشكيل طيات العصبية، التي تلتقي في خط الوسط ظهري مما أدى إلى 13،14 الأنبوب العصبي.
الخلايا قمة العصبية الخروج من لوحة سطح الأنبوب العصبي، مقابل الحبل الظهري، وتخضع لالظهارية للانتقال الوسيطة قبل أن يهاجر بعيدا أن تؤدي إلى مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا المتمايزة. وتعرف مصير الخلايا قمة في جزء من الموقع التشريحي لوحة السقف على طول محور جسم الجنين. وتشمل العصبية المشتقات خلية قمة الأنساب مميزة لكل من الأديم المتوسط (خلايا العضلات الملساء، بانيات، الخلايا الشحمية، غضروفية) وخلايا الأدمة (الخلايا الصباغية، شوان جملتعلمي اللغة اإلنكليزية، الخلايا العصبية) 14. العصبية الخلايا الجذعية قمة upregulate عامل النسخ SOX10، ويمكن أن تكون معزولة من قبل مضان تنشيط الخلايا الفرز مع الأجسام المضادة لP75 وHNK1.
الخلايا العصبية قمة الطالع أن تصبح الخلايا الصباغية تمر عبر مرحلة ميلانينية وupregulate KIT وMITF (المرتبط صغر عامل النسخ) 6،21 MITF هو منظم رئيسي للتنمية الخلايا الصباغية وهو عامل النسخ المسؤولة عن السيطرة على جزء كبير من تطوير الخلايا الصباغية 22- 24. melanoblasts الإنسان تهاجر إلى الطبقة القاعدية من البشرة التي يقيمون فيها سواء في انتفاخ الشعر أو تحيط بها الخلايا الكيراتينية في البشرة (تشكيل وحدة تصبغ) لتكون بمثابة السلائف إلى ناضجة، الخلايا الصباغية المصطبغة. والتمايز والنضج من melanoblasts إلى الخلايا الصباغية مصطبغة يحدث ما يصاحب ذلك مع الاستعمار لبصلة الشعر والتعبير عن مسار إنتاج الميلانين (TYRP1، صور، OCA2 وPMEL) 25،26.
عزل الخلايا الصباغية الإنسان وmelanoblasts من المرضى غير مكلفة، وصعبة وتحد في الكمية. يتيح هذا البروتوكول الباحثون أن نفرق hPSCs (محدث أو الجنينية) في الخلايا الصباغية أو السلائف الصباغية في طريقة واضحة المعالم، السريع، قابلة للتكرار، قابلة للتطوير، وغير مكلفة من دون فرز الخلايا. تم استخدام بروتوكول سابقا لتحديد العيوب مرض محدد عند التفريق iPSCs من المرضى الذين يعانون من اضطرابات تصبغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: بروتوكول الصباغية المذكورة هنا وقد تجلى أول مرة من قبل ميكا وآخرون.
1. إعداد الثقافة المتوسطة، المغلفة أطباق وصيانة hPSCs
- إعداد المتوسطة
ملاحظة: مخزن جميع المتوسطة في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 2 أسابيع. تصفية جميع المتوسطة للتعقيم.- إعداد DMEM / FBS 10٪. مزيج 885 مل DMEM، 100 مل FBS، 10 مل القلم / بكتيريا و 5 مل L-الجلوتامين. مرشح للتعقيم.
- إعداد HESC متوسطة. مزيج 800 مل DMEM / F12، 200 مل KSR، 5 مل L-الجلوتامين، 10 مل MEM الحد الأدنى الضروري حل الأحماض الأمينية، 1 مل β-المركابتويثانول، و 5 مل القلم / بكتيريا. بعد تصفية إضافة 10 نانوغرام / مل جمعية جيل المستقبل-2.
- إعداد المتوسطة KSR-التمايز: اخلطي 820 مل خروج المغلوب DMEM، 150 مل KSR، 10 مل L-الجلوتامين، 10 مل القلم / بكتيريا، 10 مل MEM الحد الأدنى الضروري حل الأحماض الأمينية و 1 مل β-المركابتويثانول. مرشح للتعقيم.
- إعداد المتوسطة N2-التمايز. حل 12 ز DMEM / F12 مسحوق طن 980 مل درهم 2 O. إضافة 1.55 ز الجلوكوز، 2 غرام بيكربونات الصوديوم و 100 ملغ APO ترانسفيرين الإنسان. مزيج 2 مل O 2 درهم مع 25 ملغ الأنسولين البشري و 40 ميكرولتر 1 N هيدروكسيد الصوديوم. مرة واحدة المنحل، إضافة الخليط إلى المتوسطة. إضافة 100 ميكرولتر هيدروكلوريد بوتريسين، 60 سيلينات ميكرولتر، 100 البروجسترون ميكرولتر. جلب الحجم النهائي إلى 1 لتر مع DH 2 O قبل الترشيح.
- إعداد المتوسطة الصباغية كامل. الجمع بين 50٪ Neurobasal المتوسطة، و 30٪ انخفاض DMEM الجلوكوز، و 20٪ MCDB201. لهذه الإضافة: 0.8٪ ITS +، 250 نانومتر L-الجلوتامين، و 100 ميكرومتر حمض الأسكوربيك (L-AA)، 50 نانوغرام / مل الكوليرا السم، 50 نانوغرام / مل SCF، 0.05 ميكرومتر ديكساميثازون، 100 نانومتر EDN3، 4 نانوغرام / FGF2 مل . تصفية العقيمة ثم إضافة الكواشف المتبقية: 2٪ B27 الملحق، 25 نانوغرام / مل BMP4، CHIR99021 3 ميكرومتر، 500 ميكرومتر المخيم.
- طلاء من أطباق الثقافة
- تنفيذ الطلاء باستخدام بروتين هلامي مثل Matrigel. عند فتح قسامة، وتجميد Matrigel إلى 1 مل أجزاء لتجنب تكرار تجميد ذوبان الجليد جycles. ذوبان الجليد وإعادة تعليق 1 مل المجمدة قسامة مع 19 مل DMEM / F12. لوحة 5 مل على طبق 10 سم. احتضان الأطباق لمدة 1 ساعة على RT. نضح البروتين هلامي فورا قبل طلاء الخلايا ويغسل مع DMEM / F12.
- تنفيذ الطلاء باستخدام بولي-L ornithin هيدروبروميد / الماوس Laminin-I / فبرونيكتين (أ ف ب / لام / الجبهة الوطنية). طبق معطف مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 15 ميكروغرام / مل بولي-L ornithin هيدروبروميد. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب. نضح الحل وتغسل الصحون مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات قبل طلاء مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ميكروغرام / مل الماوس Laminin-I و 2 ميكروغرام / مل فبرونيكتين. احتضان الأطباق O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب.
- قبل طلاء الخلايا، ونضح الحل والسماح لوحات تجف تماما من دون غطاء في نسيج الثقافة هود. السماح لوحات لتجف لمدة حوالي 10-15 دقيقة.
ملاحظة: أطباق جافة وجاهزة للطلاء الخلية عندما تظهر هياكل الكريستال على السطح عن طريق العين. بلاتوفاق يمكن أن تظل مع برنامج تلفزيوني تحتوي على لام / الجبهة الوطنية في الحاضنة لمدة أسبوعين، طالما لا يتبخر السائل. يمكن أن تبقى لوحات المجففة في RT لبضع ساعة.
- قبل طلاء الخلايا، ونضح الحل والسماح لوحات تجف تماما من دون غطاء في نسيج الثقافة هود. السماح لوحات لتجف لمدة حوالي 10-15 دقيقة.
- صيانة hPSCs
يتم الاحتفاظ hPSCs على الجيلاتين 0.1٪ والفأرة المعطل ميتوتيكلي الخلايا الليفية الجنينية (MEFS) في HESC المتوسطة: مذكرة. يجب تقسيم الخلايا كل 6-8 أيام.- معطف طبق 10 سم مع الجيلاتين 0.1٪ في برنامج تلفزيوني على RT لمدة 5 دقائق.
- ذوبان الجليد MEFS المجمدة بسرعة في حمام الماء 37 درجة مئوية.
- نضح الجيلاتين ولوحة الخلايا. MEFS لوحة في كثافة ~ 50000 خلية / سم 2 في DMEM / FBS 10٪. احتضان MEFS عند 37 درجة CO / N قبل إضافة hPSCs.
- نضح٪ FBS DMEM / 10 من لوحة MEF مستعدة، وغسل لوحة مع برنامج تلفزيوني وإضافة 10 مل HESC متوسطة مع hPSCs. تمرير hPSCs في نسبة 1: 5/10 اعتمادا على كثافة قبل الركض.
ملاحظة: إذا كان يتم إذابة hPSCs أو passaged كما الخلايا وحيدة، سوبplement مع 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد (ROCKi) حتى مرور الأول. - تغذية خلايا يوميا مع الطازجة 10 مل HESC متوسطة.
- قبل بدء المفاضلة إزالة أي مستعمرات المحفزة التي يبدو أنها تحتوي على خلايا متباينة، حدود غير منتظمة، أو مراكز شفافة 28. ميكانيكيا طرد ونضح المستعمرات غير النظامية مع ماصة تحت غطاء تدفق الصفحي مع المجهر تشريح.
2. طلاء من hPSCs للتمايز
ملاحظة: يتم وصف الظروف التمايز عن 10 سم الأطباق.
- إعداد 10 سم أطباق Matrigel قبل بدء المفاضلة كما هو موضح في الخطوة 1.3.1.
- عندما تصفيح hPSCs للتمايز تبدأ مع لوحة من hPSCs في مناطق ذات كثافة جاهزة للمرور (~ 80٪ متموجة) نضح HESC المتوسطة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل من التربسين 0.05٪-EDTA على الخلايا.
- هزة بقوة الأفقية طبقذ لمدة 2 دقيقة في حين تصور تحت المجهر حتى رفع MEFS قبالة كما الخلايا وحيدة. يجب أن تظل المستعمرات hPSC تعلق كما المستعمرات.
- نضح التربسين بعد أن رفع MEFS ولكن قبل فصل المستعمرات hPSCs.
- إضافة 10 مل من HESC متوسطة تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد لوحة وفصل الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا على المستعمرات.
- نضح الحل Matrigel من الطبق 10 سم أعدت في الخطوة 2.1 ويغسل مع DMEM / F12 لإزالة كتل. لوحة للhPSCs في نسبة 1: 2 على لوحة Matrigel. إضافة HESC متوسطة تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد حتى 10ML. احتضان عند 37 درجة CO / N.
ملاحظة: هذا الطلاء ينبغي أن يؤدي إلى ما يقرب من 100،000 خلية / سم 2.
3. تحريض العصبية التمايز
ملاحظة: يجب أن تبدأ في التمايز (يوم 0) عندما hPSCs هي 80٪ متموجة. الخلايا ويمكن تغذية يوميا مع HESC المتوسطةتحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد حتى بداية التمايز.
- في اليوم 0 ويوم 1، تغذية الخلايا مع 10 مل من المتوسط KSR-التمايز تحتوي على 100 LDN193189 نانومتر و 10 ميكرومتر SB431542.
- في يوم 2، تغذية الخلايا مع 10 مل من المتوسط KSR-التمايز تحتوي على 100 نانومتر LDN193189، 10 ميكرومتر SB431542 و 3 ميكرومتر CHIR99021.
- في يوم 3، وإطعام الخلايا مع 10 مل من المتوسط KSR-التمايز تحتوي على 10 ميكرومتر SB431542 و 3 ميكرومتر CHIR99021.
- في أيام 4 و 5 تغذية الخلايا مع 15 مل من 75٪ المتوسطة KSR-التفاضل و 25٪ متوسطة N2 تمايز تحتوي على 3 ميكرومتر CHIR99021.
ملاحظة: لا تندهش لرؤية كمية كبيرة من موت الخلايا من حيث الخلايا العائمة. وهذا أمر طبيعي ومتوقع. - في أيام 6 و 7 تغذية الخلايا مع 15 مل من 50٪ المتوسطة KSR-التفاضل و 50٪ متوسطة N2 تمايز على حد سواء التي تحتوي على 3 ميكرومتر CHIR99021، 25 نانوغرام / مل BMP4، و 100 نانومتر EDN3.
- في أيام 8و9 تغذية الخلايا مع 20 مل من 25٪ المتوسطة KSR-التفاضل و 75٪ متوسطة N2 تمايز على حد سواء التي تحتوي على 3 ميكرومتر CHIR99021، 25 نانوغرام / مل BMP4، و 100 نانومتر EDN3.
- في أيام 9 و 10 إعداد أطباق PO / لام / FN كما هو مبين في 1.2.2 لإعادة الطلاء للخلايا في يوم 11.
- في يوم 10 خلايا تغذية مع 20 مل من المتوسط N2 تمايز تحتوي على 3 ميكرومتر CHIR99021، 25 نانوغرام / مل BMP4، و 100 نانومتر EDN3.
4. Replating في قطرات للمواصفات NC
- في يوم 11 نضح لام / FN من PO / لام / لوحات FN مستعدة ويجف تماما.
- إزالة المتوسطة اعتبارا من يوم 11 خلية، وغسل مع برنامج تلفزيوني وإضافة 4 مل من محلول خلية مفرزة مثل Accutase في صحن 10 سم. احتضان لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 5 مل من الصباغية كاملة المتوسطة إلى الطبق وresuspend الخلايا بواسطة pipetting يدويا صعودا وهبوطا مع ماصة 10 مل حتى رفع جميع الخلايا قبالة اللوحة. نقل تعليق على أنبوب 15 مل.
- تدورخلايا لمدة 5 دقائق في 200 x ج و resuspend الخلايا في 2 × 10 6 خلايا لكل مل في الصباغية كاملة المتوسطة. عد الخلايا باستخدام استبعاد التريبان الأزرق على عدادة الكريات أو تقنية مماثلة.
- قطرات لوحة 10 ميكرولتر قريبة من بعضها البعض (دون أن لمس) على المجففة PO / لام / FN 10 سم الأطباق. إذا كانت لوحة تم تجفيفها بشكل كاف، يجب قطرات حددت جيدا الحواف ويتم تشغيل.
ملاحظة: هذا يخلق بيئة المحلية ذات الكثافة العالية للخلايا، وهو أمر مهم عندما replating الخلايا، مع الحفاظ على غرفة داخل صحن للتوسع. - السماح لقطرات للوقوف على RT لمدة 10-20 دقيقة للسماح للخلايا على الانضمام، ثم ببطء (لا تعكر صفو خلايا المرفقة) إضافة 10 مل من الصباغية كاملة المتوسطة. نقل الطبق إلى الحاضنة.
5. التوسع الصباغية أسلاف
- تواصل تغذية مع متوسط الصباغية كامل كل 2 إلى 3 أيام.
ملاحظة: التصبغ ينبغي أن تبدأ لتكون واضحة ثithin مجموعات من الخلايا في نهاية الأسبوع الأول وأصبح واضحا جدا في الأسبوع الثاني. عرض لوحة على خلفية بيضاء مثل ورقة لتمييز هذه في وقت مبكر، مجموعات صغيرة مظلمة. وسوف تصبح الخلايا تدريجيا أكثر المصطبغة مع مرور الوقت، حتى لوحة كلها مصطبغة موحد (انظر الشكل 2B). - خلايا مرور مرة واحدة في الأسبوع على نسبة من ~ 1: 6 (الطلاء كما قطرات لم يعد من الضروري في هذه المرحلة). استخدام Accutase لفصل الخلايا ويغسل مرتين مع المتوسطة Neurobasal عادي قبل إعادة الطلاء في الصباغية كاملة المتوسطة. الحفاظ على الخلايا على PO / لام / لوحات FN.
ملاحظة: لقد وجدنا أن المتوسط الصباغية كامل الأنسب للحفاظ على وتوسيع HESC والخلايا الصباغية المستمدة التوجيهية. ومع ذلك، يمكن أن تكون الخلايا مثقف لفترة وجيزة في المتوسط M254 المتاحة تجاريا ولكن وسائل الإعلام مبسطة يزيد من خطر الخلايا الميتة ورفع قبالة لوحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوفر هذا البروتوكول طريقة لاستخلاص المصطبغة تماما، الخلايا الصباغية ناضجة من hPSCs في في المختبر خالية المغذية، فعالة من حيث التكلفة، وقابلة للتكرار الطريقة. وعلى النقيض من فانغ بروتوكول آخرون المحددة سابقا لالخلايا الصباغية المستمدة hPSC، بروتوكول المبينة لا تتطلب المتوسطة مكيفة ويقلل من متطلبات الوقت. بروتوكول فانغ وآخرون الاستفادة المتوسطة مشروط من خط خلايا الفئران المنتجة للWNT3A واستغرق مدة تصل إلى 6 أسابيع لتصور تصبغ 6،12. للانحياز الخلايا قمة الجذعية العصبية نحو مصير الخلايا الصباغية (melanoblasts)، ونحن إزالة مثبطات BMP وTGFβ (LDN وSB على التوالي) بعد نبضة في وقت مبكر وبعد ذلك أن يقدم BMP4 خارجي وEDN3 يشير في اليوم السادس مع الحفاظ على تفعيل WNT (CHIR) 6. وmelanoblasts الناتجة يمكن وصف تعبير عن KIT وMITF، وكذلك صيانة SOX10 EXPRession 6. التعبير عن SOX10 يمكن تصور في المناطق الطبق الثقافة التي تشكل التلال يوم 11 الثقافة (الشكل 1B - C).
بعد تحريض ميلانينية، و passaged الخلايا على PO / لام / لوحات FN وتتغذى على الصباغية كاملة المتوسطة. هذا هو وسيلة غنية للغاية أن لديه فائدة إضافية تتمثل في كونها انتقائية للسكان الصباغية، مما يلغي الحاجة لأية خلية الفلورسنت المنشط فرز 6. أثناء نضوج الخلايا الصباغية، الخلية upregulates الجينات الميلانين صور وTYRP1 مع الحفاظ على العديد من الجينات ميلانينية، بما في ذلك TYRP2. Day25 الخلايا الجذعية المستمدة الخلايا الصباغية وصمة عار على نحو ملائم للبروتينات إنتاج الميلانين TYRP1 وTYRP2 (الشكل 2). هذا البروتوكول هو قوي واستخدمت مع خط HESC H9 وعبر عدة خطوط التوجيهية. وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام هذا البروتوكول لإعادة إنتاج بأمانة المجاهدين ميزات trastructural من الأمراض تصبغ باستخدام خطوط التوجيهية المريض محددة 6.
الشكل 1. خطوات حاسمة في البروتوكول الصباغية التمايز المستمدة HESC. (A) مخطط بروتوكول التمايز. KSR: KSR-التمايز المتوسطة، N2: N2 تمايز المتوسطة، LDN: LDN193189، SB: SB431542، CHIR: CHIR99021، BMP4: العظام تخلقية البروتين 4، EDN3: endothelin-3، ROCKi: Y-27632 هيدروكلوريد B - C. يظهر brightfield (ب) وGFP مضان (C) صورة من التمايز في يوم 11 قبل replating باستخدام pSOX10 المعدلة وراثيا: خط GFP HESC. يتم إثراء التلال المظلمة مرئية في الصور brightfield لSOX10 + الخلايا التي سوف تؤدي إلى melanoblasts والخلايا الصباغية في نهاية المطاف. تحميل / 53806 / 53806fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الصباغية والمراحل المتوسطة. (A) اليوم المصطبغة 25 خلية (يمين) يمكن تصور بسهولة ومتميزة من يوم 11 خلية (يسار) عندما مكعبات. (ب) بعد يوم 20 من البروتوكول ثقافة سيحتوي على حد سواء unpigmented، تستحق الخلايا الصباغية وناضجة تماما، الخلايا الصباغية المصطبغة. (C - D) والخلايا الصباغية يمكن تصور تحت مشرق الميدان وكلا من النضج والخلايا الصباغية المصطبغة تماما وصمة عار للعلامة TYRP2 ميلانينية / الصباغية. (E - F) فقط الخلايا الصباغية وصمة عار المصطبغة للمرحلة متأخرة الصباغية علامة TYRP1.الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لالتمايز الناجح الخلايا الصباغية من hPSCs ينبغي أن تؤخذ في الاقتراحات التالية بعين الاعتبار. أولا وقبل كل شيء، لا بد من العمل في ظل ظروف ثقافة عقيمة في جميع الأوقات. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أن تبدأ مع المحفزة، hPSCs غير متمايزة تماما. إذا كان السكان بدءا يحتوي على خلايا متباينة العائد سوف ينخفض دائما كما الملوثات لا يمكن أن تكون موجهة نحو الخلايا الصباغية وحتى قد تزيد من تعطيل الخلايا التفريق بشكل صحيح.
لضمان بقاء الخلايا المحفزة تأخذ الرعاية إلى الالتزام بقواعد راسخة لصيانة الخلايا الجذعية. تغذية والمرور بانتظام والعريس الثقافات لإزالة خلايا متمايزة قبل الركض. عندما الركض على البروتين هلامي للتمايز من المهم أن طبق المغلفة بشكل صحيح لمنع الخلايا من رفع قبالة خلال التمايز.
وميلانينية تختلفينبغي الشروع entiation حول كثافة الخلية 80٪. سيؤدي كثافة عالية جدا لزيادة موت الخلايا في حين كثافة منخفضة جدا سوف تؤثر سلبا على التمايز. عندما الركض، يجب غسل الخلايا مرتين لإزالة أي حل الخلية المفرزة قبل الطلاء. لتحقيق أقصى قدر من البقاء على قيد الحياة في يوم 11، من المهم أن مرور الخلايا في ذات الكثافة السكانية العالية، قطرات متباعدة بشكل جيد التي لم يمسها لمدة 20 دقيقة، بحيث الخلايا تتجمع والالتزام.
هذا البروتوكول هو فعال في توليد أعداد كبيرة من الخلايا الصباغية، وسوف تكون ذات قيمة عند دراسة عينات من المرضى الإنسان من كمية محدودة. وعلاوة على ذلك، حيث أن السكان الصباغية المستمدة PSC انتقائي وتوسيع السكان الصباغية يمكن أن تتضاعف أعداد كبيرة جدا من الخلايا حتى لو كانت عائدات التمايز انخفاض أعداد أو نسب الخلايا الصباغية. بدء بروتوكول مع iPSCs يفتح إمكانية لدراسة الأمراض التنموية وعينات محددة للمرضى. واحد لىmitation من هذا البروتوكول هو حقيقة وتستمد الخلايا الصباغية كما الأحادية دون كل أنواع الخلايا الأخرى الموجودة التي تشكل مكانة طبيعية في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك البروتوكول يتطلب خبرة في تقنيات زراعة والتمايز hPSC. ومع ذلك، مع التطورات الأخيرة في hPSCs إنتاج الحقل IPSC أصبح التحكم فيها على نحو متزايد، وأصبحت طرق hPSCs زراعة روتين. حتى الآن، وقد تم استخدام بروتوكول في مختبرنا لإنتاج الخلايا الصباغية من خط حس H9، وكذلك من 14 خطوط الجذع ولدت من 5 جهات مانحة مختلفة.
الميكا وآخرون تستخدم هذا البروتوكول بنجاح لاشتقاق الخلايا الصباغية من HESC البشري وiPSCs 6. وأظهرت الصحيفة أن iPSCs المستمدة من المرضى الذين يعانون من عيوب وتصبغ يمكن أن تكون متباينة في الخلايا الصباغية وبروتوكول إنتاج بأمانة الأجسام الصباغية من حجم المظهرية وكمية المرتبطة بهذا المرض.
ثORK يتضح واحدة من العديد من التطبيقات الممكنة لبروتوكول مع استخدام الخلايا الصباغية المستمدة التوجيهية لدراسة آليات المرض وعرض إمكانية رفع مستوى الإنتاج لفحص المخدرات 6،29. الأهم من ذلك، أظهرت الصحيفة عن متانة واستنساخ بروتوكول لإنتاج الخلايا الصباغية من مجموعة كبيرة من خطوط hiPSC متميزة وراثيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل الزمالة للباحثين سرطان الجلد من مؤسسة جوانا م نيكولاي ومن قبل المعاهد الوطنية للصحة تحت روث L. جائزة الخدمة القومي للبحوث كيرشتاين F31. وأيد هذا العمل كذلك من خلال المنح المقدمة من NYSTEM ومبادرة الخلايا الجذعية ثلاثي المؤسسية (مؤسسة ستار).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
References
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
