यह काम एक तंत्रिका शिखा के माध्यम से मानव स्टेम कोशिकाओं से pigmented, परिपक्व melanocytes उत्पादन और एक फीडर से मुक्त, 25 दिन प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए एक मध्यवर्ती चरण melanoblast इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल का वर्णन है।
Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.
मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, और सेल प्रतिस्थापन उपचार 1-6 के लिए एक स्केलेबल फैशन में सामान्य भेदभाव नकल करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। खास रुचि, hPSCs को अलग-थलग करने के लिए मुश्किल या दुर्लभ / क्षणिक प्रकार की कोशिकाओं जहां मरीज के नमूनों के अध्ययन के लिए दुर्लभ हैं अवसर खोलने होंगे। इसके अलावा, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) एक रोगी विशिष्ट ढंग से विकास और रोग मॉडलिंग का अध्ययन करने के लिए अद्वितीय तंत्र 1,2,7-11 को जानने के लिए सक्षम शोधकर्ताओं। HPSCs से melanocytes के भेदभाव के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल differentiations के 6 सप्ताह का समय की आवश्यकता है और एल Wnt3a कोशिकाओं 12 से वातानुकूलित माध्यम से संवर्धन कोशिकाओं शामिल है। प्रोटोकॉल पहले मीका एट अल द्वारा प्रस्तुत किया। और यहाँ वर्णित तीन सप्ताह में pigmented कोशिकाओं का उत्पादन और अस्पष्टता और वातानुकूलित माध्यम से जुड़े विसंगतियों को हटा।
melanocytes की गिरफ्तारीई तंत्रिका शिखा, रीढ़ के लिए अद्वितीय कोशिकाओं का एक प्रवासी आबादी से निकाली गई। तंत्रिका शिखा gastrulation के दौरान परिभाषित और तंत्रिका प्लेट के किनारे पर कोशिकाओं की आबादी का प्रतिनिधित्व करता है, तंत्रिका और गैर तंत्रिका बाहरी झिल्ली के बीच की सीमा है। Neurulation के दौरान, तंत्रिका ऊतक तंत्रिका सिलवटों, जो पृष्ठीय midline न्यूरल ट्यूब 13,14, जिसके परिणामस्वरूप पर एकाग्र फार्म के लिए एक तंत्रिका थाली से विकसित।
तंत्रिका शिखा कोशिकाओं, न्यूरल ट्यूब की छत की थाली से उभरने पृष्ठदंड विपरीत, और दूर पलायन विभेदित कोशिकाओं की एक विविध आबादी को जन्म देने से पहले mesenchymal संक्रमण के लिए एक उपकला से गुजरना। शिखा कोशिकाओं के भाग्य भाग में भ्रूण के शरीर के अक्ष के साथ छत प्लेट की शारीरिक स्थान के आधार पर परिभाषित कर रहे हैं। तंत्रिका शिखा सेल डेरिवेटिव दोनों mesoderm की विशेषता प्रजातियों (चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, अस्थिकोरक, adipocytes, chondrocytes) और बाह्य त्वक स्तर कोशिकाओं में शामिल हैं (melanocytes, श्वान गएल, न्यूरॉन्स) 14। तंत्रिका शिखा स्टेम कोशिकाओं प्रतिलेखन कारक SOX10 upregulate और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल p75 और HNK1 करने के लिए एंटीबॉडी के साथ छँटाई द्वारा अलग किया जा सकता है।
तंत्रिका शिखा कोशिकाओं melanocytes एक melanoblast मंच के माध्यम से गुजरती हैं और upregulate किट और MITF (microphthalmia जुड़े प्रतिलेखन कारक) 6,21 MITF मेलानोसाईट विकास के एक मास्टर नियामक है और एक प्रतिलेखन कारक मेलानोसाईट विकास के बहुत नियंत्रित करने के लिए जिम्मेदार है बनने के लिए 22 नसीब 24। मानव melanoblasts एपिडर्मिस जहां वे या तो बालों के उभार में या (रंजकता इकाइयों के गठन) एपिडर्मिस में केरेटिनकोशिकाओं से घिरा हुआ परिपक्व, रंजित melanocytes के लिए व्यापारियों के रूप में काम करने के लिए आने से बेसल परत की ओर पलायन। भेदभाव और pigmented melanocytes में melanoblasts की परिपक्वता मेलेनिन उत्पादन मार्ग (TYRP1, Tyr, OCA2 के बाल बल्ब के उपनिवेशवाद और अभिव्यक्ति और साथ सहवर्ती होती हैPMEL) 25,26।
रोगियों से मानव melanocytes और melanoblasts अलग, महंगा मुश्किल और मात्रा में सीमित है। इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं ने एक अच्छी तरह से परिभाषित, तेजी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्केलेबल, और सस्ती सेल छँटाई के बिना विधि में hPSCs (प्रेरित या भ्रूण) melanocytes या मेलानोसाईट व्यापारियों में अंतर करने में सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल पहले से इस्तेमाल किया गया था जब रंजकता बीमारियों के साथ रोगियों से IPSCs फर्क रोग विशिष्ट दोष की पहचान करने के लिए।
hPSCs से melanocytes के सफल भेदभाव के लिए निम्नलिखित सुझाव को ध्यान में रखा जाना चाहिए। और सबसे पहले, यह सब समय पर बाँझ संस्कृति की शर्तों के तहत काम करने के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, यह pluripotent, पूरी तरह से अविभाजि…
The authors have nothing to disclose.
इस काम जोआना एम Nicolay फाउंडेशन से मेलेनोमा शोधकर्ताओं के लिए एक फैलोशिप द्वारा और रूथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार F31 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। इस काम के लिए आगे NYSTEM और त्रि-संस्थागत स्टेम सेल पहल (स्टार फाउंडेशन) से अनुदान के माध्यम से समर्थन किया था।
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133–032 | |
DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Human insulin | Sigma | I2643 | |
ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032g in 100ml 100% ethanol |
Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
Selenite | Sigma | S5261 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |