Kvantificering af humane monocyt Chemotaxis In Vitro og Murine lymfocyt handel In Vivo

Summary

Protokoller for kvantitativ vurdering af lymfocyt chemotaxis og migration er vigtige værktøjer for immunologi forskning. Her, er en in vitro- protokollen beskrevet, at tilladelser real-time, multipleksede evaluering af celle migration, såvel som en supplerende i vivo teknik muliggør sporing af indfødte celler til milten.

Abstract

Chemotaxis er migration langs en særlige kemiske gradient¹. Kemokiner er kemotaktisk cytokiner, der fremmer cellulær handel med anatomiske og tidsmæssige specificitet². Chemotaxis er en kritisk funktion af lymfocytter og andre immunceller, der kan være kvantitativt vurderet in vitro. Dette manuskript beskriver metoder, der foretages evaluering af chemotaxis, både in vitro- og i vivo, for forskellige celletyper, herunder cellelinjer og indfødte celler. In vitro-, plade-baseret format tillader sammenligning af flere betingelser samtidig i realtid, og kan afsluttes inden for 1-4 h. In vitro assay betingelser kan manipuleres til at introducere agonister og antagonister, som godt som differentiere chemotaxis fra chemokinesis, som er tilfældig bevægelse. For i vivo menneskehandel vurderinger, kan immunceller mærket med flere fluorescerende farvestoffer og bruges til adoptiv overførsel. Den differentierede mærkning af celler giver mulighed for blandet cellepopulationer skal føres ind i de samme dyr, dermed faldende varians og reducere antallet af dyr, der er nødvendige for et tilstrækkeligt powered eksperiment. Migration til lymfoid væv forekommer i så lidt som 1 h, og flere tissue rum kan smages. Flowcytometri efter væv høst giver mulighed for en hurtig og kvantitativ analyse af de vandrende mønstre af flere celletyper.

Introduction

Robust immunitet kræver komplekse tidsmæssige og rumlige koordinering af et utal af celletyper for at reagere hensigtsmæssigt på skade, infektion og generere self-tolerance. Flere dusin chemokine receptorer og deres tilsvarende ligander er blevet opdaget og karakteriseret giver molekylære mekanismer af hvilke specifikke celler kan rettes til en bestemt væv på et bestemt tidspunkt. Således, at studere chemotaxis og migration er en uundværlig bestanddel af immunologi forskning. Faktisk beskrevet i vitro assay for nylig blev brugt som en screeningsværktøj til at identificere en kemotaktisk cofaktor, der accelererer chemotaxis af T-celler mod C-C kemokiner 19 og 21³. Formålet med metoderne beskrevet her er at tillade kvantitative vurderinger af immunforsvar celle chemotaxis in vitro- og in vivo.

Boyden (celle migration og invasion) kammer assay er en billig, reproducerbare og hurtig metode til at vurdere celle migration^4,5. I den standard assay, den øverste kammer er seedet med celler, og er adskilt af en porøs indsætte fra en nedre kammer, hvori cellerne vandrer. På det ønskede tidspunkt, kan celler, der har migreret til undersiden af insertet fast og farves til kvantitering af lysmikroskopi. Men sådanne målinger begrænse dataindsamling til et enkelt slutpunkt, som udelukker dynamisk dataindsamling og kan kræve omfattende optimering til at fastslå det optimale tidspunkt for analyse. Her, er flere tilpasninger beskrevet som tillader real-time, kvantitative og multipleksede målinger af chemotaxis i vitro.

For i vivo undersøgelser, bruges en funktionel slutpunkt, nemlig specifik akkumulering af celler i et givet væv rum. Forud mærket donor celler er indført i modtagerens dyr gennem adoptiv overførsel. Disse donor celler kan efterfølgende identificeres ved flowcytometri efter modtagerens væv høst. Også præsenteret er en co mærkning strategi, der giver mulighed for bestemmelse af handel med forskellige celletyper inden for en enkelt modtager dyr. Denne metode fjerner Inter animalske variationen fra celle indsprøjtning, og tegner sig for fysiologisk Inter animalske variabilitet.

Protocol

alle procedurer blev godkendt af Rockefeller University ' s institutionelle Animal Care og brug udvalget. Alle dyr har været opstaldet på specifikt patogenfrie betingelser.

1. In Vitro Chemotaxis

1. kultur THP-1 celler ⁶ i Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic syre (HEPES, 25 mM) (komplet media), opretholde tætheden mellem 0,5-1,0 x 10 ⁶ celler/mL.
2. i et 35 mm cellekultur parabol, etiket 3,5 x 10 ⁵ THP-1 celler pr. betingelse med calcein acetoxymethyl (calcein-AM, 2,5 µM) eller andre egnede fluorescerende farvestof i komplet media ved 37 ° C i 30 min.
   Bemærk: Farvestoffer skal cellemembranen-gennemtrængelige og kompatibel med live-celle mærkning.
3. Før varm en Pladelæser til 37 ° C.
   Bemærk: Ud over temperaturkontrol, bunden-læsning funktionalitet er også påkrævet. Se trin 1.10.2 for et alternativ til en Pladelæser til kvantificering af overflytning celler.
4. Mens celler mærkning, forberede assay plade og nedre kammer.
   1. Brug en 24-godt vævskultur plade, med én betingelse pr. brønd. Udføre hver tilstand i tre eksemplarer.
   2. Tilføje 750 µL af Hank ' s Buffered saltopløsning (HBSS) bufferet med 25 mM HEPES og 0,1% bovint serumalbumin (BSA) til 24-godt pladen. Dette tjener som basal kontrol tilstand.
      1. Brug andre brønde for Komparator betingelser, altid at opretholde den samlede volumen i bunden kammer på 750 µL.
         Bemærk: I dette eksempel tjener humane monocyt chemoattractant protein-1 (MCP-1) som den positive kontrol for chemotaxis ⁷.
         1. Saml reagens blandingen ved at kombinere HBSS med 25 mM HEPES, BSA (0,1%) og MCP-1 (75 ng/mL). Bruge voksen bovint serum (2,7% v / v) med MCP-1 som en supplerende positiv kontrol.
            Bemærk: Chemokine og chemokine koncentration vil afhænge af den kemotaktisk akse under undersøgelsen. Frysetørret MCP-1 er genopslemmes i destilleret vand med BSA (0,1%) til at gøre en stamopløsning med en slutkoncentration på 50 μg/mL. Dette kan fortyndes i vand til en brugsopløsning på 10 μg/mL. Tilføje 5,6 μL af denne løsning til det nederste kammer.
   3. Efter sammensætningen af den nederste kamre er færdig, placere en porøs indsætte i hver brønd, at sikre, at fanerne insertets Juster med hak af plade.
      Bemærk: Vælg den passende porestørrelse for indsætter. For monocytter og lymfocytter fungerer en porestørrelse på 3 μm godt. Nogle celletyper og/eller chemokine systemer kan kræve en matrix-belagt overflade for optimal migration. For eksempel, til måling af THP-1 monocyt chemotaxis mod MCP-1, er fibronektin eller kollagen-belagte skær anbefalet. For Pladelæser til kvantitering, skæret skal have en lys-impermeant belægning, som polyethylenterephthalat, at forhindre påvisning af ikke-overflytning celler i øverst kammer ⁸.
5. Efter inkubation celler i 30 min med calcein-AM, overføre cellesuspension til en 15mL konisk slange. Centrifuge celler ved 1.000 x g i 2 min. Inspicér visuelt celler for at bekræfte optagelsen af calcein-AM ( figur 1).
6. Fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af et vakuum indsugningsventil. Vask mærket celler i serumfrit RPMI 1640 suppleret med HEPES 25 mM. Centrifugeres celler på 1.000 x g i 2 min. og supernatanten.
7. Resuspend celler i serumfrit RPMI 1640 suppleret med HEPES 25 mM. Tælle celler og justere lydstyrken, således at cellerne er i en endelig koncentration på 1,0-1,5 x 10 ⁶ celler/mL.
8. Give afkald på 250 μL af cellesuspension til Indsæt (øverste kammer).
9. Efter alle øverste kamre har været fyldt, forsigtigt løfte pladen, og inspicere undersiden for tilstedeværelsen af luftbobler, der kan forstyrre migration og afsløring. Hvis du vil fjerne en boble, først prøve at fjerne, derefter igen placere indsatsen. Hvis mislykket, bruge en 27 G nål til at punktere boblen og derefter igen placere indsatsen.
10. Pladen anbringes i pre varmede 37 ° C-Pladelæser.
    1. Erhverve fluorescens aflæsninger fra bunden med 1-3 min. mellemrum. Når du bruger calcein-AM, angive fluorescens excitations- og bølgelængder på 485 nm og 520 nm, henholdsvis. Afhængigt af celle type og chemokine system, chemotaxis opstår typisk over 1-4 h ( figur 2A).
    2. Som et alternativ til kontinuerlige målinger ved hjælp af en plade-læser, billede brøndene ved hjælp af en omvendt fluorescerende mikroskop ( figur 2B) i stand til magnetisering og påvisning af lys på 485 nm og 520 nm, henholdsvis. Brug en lav forstørrelse til at fange fleste af undersiden af indsatsen. Kvantificere celler ved behandling af billeder med ImageJ eller lignende software ⁹.

2. Adoptiv overførsel af Murine lymfocytter

1. forberedelse af donor celler
   1. Anesthetize 8-12 ugers-gamle C57BL/6J mandlige donor mus med isofluran anæstesi (1-3%) ved hjælp af en vaporizer. Bekræft passende dybde af anæstesi ved tå-knivspids.
   2. Placere musen i den liggende stilling. Gøre en midterlinjen snit med en skalpel og Find milten i den øverste venstre peritoneal plads. Punktafgifter hele milten og placere i komplet media (RPMI suppleret med 10% FBS og 25 mM HEPES, 1 mL/milten) på is. Aflive bedøvede donordyr ved halshugning.
   3. Male milt væv blidt gennem 40 µm nylon mesh til komplet media (1 mL /spleen) ved hjælp af slutningen af en sprøjte stemplet til at gøre en enkelt celle suspension og overførsel til en 15 mL konisk tube.
   4. Tilføje 4 bind af ammoniumklorid kalium (ACK) lysis buffer og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur til at lyse erytrocytter.
   5. Centrifugeres celler ved 1.000 x g i 2 min. ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Hvis erytrocytter forbliver i pellet, resuspend i ACK lysisbuffer, inkuberes i 5 min. ved stuetemperatur, centrifugeres celler på 1.000 x g i 2 min. og kassér supernatanten.
   6. Resuspend celler i komplet medier i en koncentration på 2-5 x 10 ⁷ celler/mL og derefter stamme cellesuspension gennem en 40 µm nylon mesh til at fjerne celle debris.
   7. Etiket 1 x 10 ⁷ celler/recipient mus med et fluorescerende farvestof kompatibel med levende celler og der vil blive bevaret ved efterfølgende fiksering, såsom 5-chloromethylfluorescein diacetat (slutkoncentration 2 μM) ¹⁰ . Der inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
      Bemærk: For at spore mere end én celle population, bruge andre fluorescerende farvestoffer med yderligere cellepopulationer. For example, en del af donor celler kan være mærket med 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoylperoxid) amino) tetramethylrhodamine (slutkoncentration 2 μM) ¹¹.
   8. Tilføje 4 bind HBSS suppleret med 25 mM HEPES, så centrifuger på 1.000 x g i 2 min og Fjern supernatanten. Resuspend pellet i HBSS suppleret med HEPES 25 mM til en endelig koncentration på 1 x 10 ⁸ celler/mL.
      1. Hvis du bruger mere end én fluorescerende farvestof, holde cellepopulationer adskilt indtil umiddelbart før injektion.
      2. Overføre en lille delprøve (10 μL) af celler i hver farve til en Fikseringsvæske løsning (1 mL) for efterfølgende flowcytometri strømningskompensation.
2. Overførsel af lymfocytter
   1. bedøver 8-12 ugers-gamle C57BL/6J mandlige recipient mus med isofluran (1-3%) ved hjælp af en vaporizer; bekræfte dybde af anæstesi ved tå-knivspids. Anvende veterinære salve til dyr ' s øjne til at forhindre udtørring.
   2. Kort vortex donor celler (1 s) og overførsel til 1 mL injektion sprøjte med 27 G, 0,5 i nålen, kombinere varierende mærket cellepopulationer, hvis det er relevant.
      1. Overføre en lille delprøve (10 μL) af blandede celler til en Fikseringsvæske løsning (1 mL) for efterfølgende flow flowcytometri analyser.
   3. Sted donordyr i liggende stilling. Anvende mild caudale pres på huden dorsal til øjet, forårsager øjeæblet til rager lidt.
   4. Direkte nålen medialt og tilføre hver modtager musen 100 µL af donor cellesuspension retro-orbitally. Celler kan også injiceres via hale vene.
   5. Gradvist trække injektion nålen og placere musen alene i et opsving bur. Overvåge dyr, indtil den har genvundet bevidsthed; én gang fuldt gendannede tilbagevenden dyret til socialt boligbyggeri.
3. Indsamling og analyse
   1. 1 h, bedøver recipient mus med isofluran anæstesi (1-3%) ved hjælp af en vaporizer; bekræfte dybde af anæstesi ved tå-knivspids. Høste milten (eller andre væv af interesse) (trin 2.1.2.) fra hver modtager mus og sted i komplet media (1 mL/modtager). Aflive bedøvede dyr ved halshugning.
      Bemærk: Længere intervaller før væv høst vil øge væv akkumulering gennem mindst 24 h.
   2. Male milt væv blidt gennem 40 µm nylon mesh til komplet media ved hjælp af slutningen af en sprøjte stemplet til at gøre en enkelt celle suspension og overførsel til 15 mL konisk tube.
   3. Tilføje 4 bind af ACK lysis buffer og Inkuber 5 min ved stuetemperatur. Centrifugeres cellesuspension ved 1.000 x g i 2 min. ved stuetemperatur og kassér supernatanten.
   4. Resuspend celler i farvning buffer (fosfatbufferet saltopløsning suppleret med 1% FBS). Tælle celler og tilpasse sig til en endelig koncentration på 3 x 10 ⁷ celler/mL. Overføre 100 µL af cellesuspension til en 96-brønd runde bundplade.
   5. Plet celler for ønskede markører (se tabel materiale) analyseres ved flowcytometri. Tilføj fluorophore-konjugerede antistoffer (se tabel materialer) mod ønskede markører og inkuberes ved 4 ° C i 20 min. i mørke. Tilsæt 100 µL farvning buffer, centrifugeres celler ved 1.000 x g i 3 min og supernatanten.
   6. Resuspenderes i 200 µL farvning buffer, centrifugeres celler ved 1.000 x g i 3 min og supernatanten.
   7. Resuspend pellet i 125 µL farvning buffer og erhverve prøver ved hjælp af en flow Flowcytometret ved hjælp af standardprocedurer.
      Bemærk: Den grønne farve er begejstrede en 488 nm laser og emission registreres med 505 og 530/30 dichroic filtre. Den orange farve er begejstrede en 561 nm og emission registreres af en 582/15 dichroic filter.
      1. Brug gemt celler fra 2.1.8.2 til at kompensere for hver fluorescerende farvestof.
         Bemærk: Ved hjælp af perle-baseret erstatning med fluorophores matchende excitation og emission spektre af mærkning farvestoffer vil resultere i suboptimal kompensation.
      2. Bruge de gemte input celler fra trin 2.2.2.1 til præcist bestemme forholdet mellem varierende mærket inputceller hvis bruger mere end én mærket befolkning ( figur 3). Beregne væv specifikke migration baseret på forholdet mellem mærket til umærkede celler ( figur 4).

Representative Results

Når du bruger calcein-AM farvestof, vil besigtigelse af celler bekræfte etiket optagelse (figur 1). Automatiseret fluorescerende aflæsninger vil spore migration som celler transit på undersiden af indsatsen over tid. Disse data viser klart en induktion af celle migration mod MCP-1 og en forstærkning af responset ved serum (figur 2A). Afhængigt af styrken af den migrerende stimulus, er der en forsinkelse på mindst 15 min. før en forøgelse af signal. Den fluorescerende signal kan peak, og derefter gradvist falde. Dette repræsenterer en netto fald i antallet af celler at overholde undersiden af indsatsen som celler passere ind løsning i den nedre kammer med en hastighed hurtigere end celler migrerer fra den øverste kammer. Stærkere vandrende stimuli typisk resultere i en) tidligere udbrud af en stigning i fluorescens værdier; b) hurtigere stigningstakt i fluorescens; og c) højere peak fluorescens værdier. Repræsentative billeder erhvervet af inverteret Fluorescens mikroskopi er også vist (figur 2B), med kvantitering af celletal (figur 2 c).

For i vivo undersøgelser udnytte mere end én fluorescerende etiket, er det vigtigt at kvantificere den relative andel af cellepopulationer i input materiale. Dette er baggrunden for variansen i blande cellepopulationer til injektion (figur 3). I dette tilfælde var forholdet mellem grøn og orange fluorescerende celler 0.97:1. Dermed, at tage højde for denne lille ubalance, grønt-fluorescerende celletal blev divideret med 0,97 indeksere deres numre i forhold til de input materiale. Efter kvantificere mærket celler ved flowcytometri, kan handel kvantificeres, da antallet af mærket celler inddrives divideret med det samlede antal celler inddrevet.

Disse resultater viser fordelen ved at bruge dual-farve-strategi, som fjerner effekten af varierende injektion virkning; mens der er betydelig afvigelse af gendannede celler mellem dyr, for enhver given dyr forholdet mellem grønt-fluorescerende til orange-fluorescerende celler er ca lig (figur 4). Disse resultater forventes, som de to celle populationer blev behandlet ens, men forskellige perturbationer kan testes for deres effekt på lymfocyt homing. Afvigelse fra linjen af identitet angiver forskellige vandrende kapaciteter af de specifikke cellepopulationer. Derudover kan flere celle subsets bestemmes ved farvning gendannede cellerne for de ønskede proteiner. Her, er T-celler, anført af CD3 farvning, og B-celler, anført af CD19 farvning også kommet med lige andele af grøn-orange-fluorescerende celler.

Figur 1: celle mærkning. Besigtigelse af celle pellet efter mærkning bekræfter passende optagelse af de fluorescerende farvestof (venstre), i modsætning til før mærkning (højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Kvantificering af in vitro- Migration. (A) repræsentative data (gennemsnit ± standardafvigelse) erhvervede i realtid fra en pladelæseren sammenligne 3 betingelser: medier (kontrol), chemokine (MCP-1, 75 ng/mL) eller chemokine med serum (MCP-1, 75 ng/mL og kvæg serum, 2,7% v/v i buffer). Aflæsninger er anskaffet fra undersiden af pladen hver 3 min med en excitation boelgelaengden 485 nm og påvisning bølgelængde af 520 nm. (B) repræsentative micrographs på 4 X forstørrelse af undersiden af Indsæt på 1 h, som giver mulighed for direkte visualisering af overflytning celler. Skalere barer = 500 µm (gul). (C) kvantificering af celle nummer pr. laveffekt felt (LPF; 4 X) ved hjælp af ImageJ software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: farves inputceller. Flow flowcytometri plot viser forholdet mellem to varierende farves cellepopulationer i injiceres celle input fra trin 2.2.2.1. Forholdet bestemmes ud fra dette komplot tjener til at korrigere for variansen indført under den oprindelige blanding af de to befolkninger og bruges til at justere celletal under downstream dataanalyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: forholdet mellem mærket celler inddrives fra milt modtager dyr. Andelen af grønt-fluorescerende eller orange-fluorescerende celler er præsenteret som en procentdel af den samlede gendannede splenocytes, med hvert datapunkt, der repræsenterer en enkelt modtager dyr. Den samlede mærket celler er vist (trekant), samt de delmængder, der også farves positive for celle celleoverflademarkører CD19 (firkantet) eller CD3 (cirkel). Stiplet linje er linjen af identitet hvor forholdet mellem farver er lig med 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Kvantificering af immun celle migration kan opnås ved hjælp af simple og hurtige undersøgelser både in vitro og i vivo. Vi vise i vitro chemotaxis af humane monocytter som svar på en MCP-1 forløb og brystforstørrelse serum. In vivo, donor murine splenocytes var varierende mærket og efter adoptiv overførsel, blev inddrevet fra modtagere dyr.

Ved hjælp af en Pladelæser har fordel af prøveudtagningssteder i flere tid (så ofte som hver 30 s) og automatisere kvantitering af overflytning celler. Dette overflødiggør behovet for at vælge en enkelt tidspunkt for evaluering og undgå de mere arbejdskrævende metoder til manuel optælling af individuelle brønde. Desuden giver denne metode mere dynamisk information end kan være samlet ved mikroskopi. Under analysen må det holdes for øje, at celler falder af insertet i bunden kammer, og vil ikke bidrage til fluorescens-intensiteten. Således vil antallet af celler på undersiden af indsatsen, som angivet af relative fluorescens, være en funktion af migration og den sats, hvormed celler falder af indsatsen.

Større celler kan kræve et indstik med større porer, og 8 μm porøse skær er tilgængelige. Mindre celler (herunder native lymfocytter) kan ikke lys nok til at være pålideligt opdaget af en fluorimeter og kan kræve evaluering af mikroskopi, især for små ændringer i chemotaxis. Nogle celletyper kan passere hurtigt til den nederste kammer løsning og ikke har en tilstrækkelig lang opholdstid på Indsæt til at blive opdaget, hvilket resulterer i en flad kurve. I dette tilfælde celler kan kvantificeres ved flowcytometri direkte fra den nedre kammer løsning, eller en matrix-belagt indsætte kan bruges til at forlænge transporttiden ud over at bruge et indstik med mindre porer (f.eks. 1 μm).

Kritisk til disse assays er identifikation af robust vandrende betingelser. For in vitro- undersøgelser, celletype studerede skal være i stand til at reagere på en chemoattractant og nødvendige fælles faktorer skal overvejes. Optimering kan være påkrævet for celle tæthed indført i det øverste kammer. Generelt en højere tæthed vil resultere i et stærkere signal, men dette skal opvejes mod et højere signal i non-specifik migration. Test en række chemoattractant koncentrationer kan også hjælpe med at identificere et egnet tidsmæssige vindue til at indfange migration.

Denne metode kan også tilpasses til bruge flere farver. Dette ville tænkes reducere variabiliteten, samt øge antallet af forhold, der kan indgå i en enkelt assay. De primære overvejelser her er lysstyrken af de fluorescerende farvestoffer. Calcein-AM er meget lyse og derfor let opdages af både mikroskop og plade skærmlæser applikationer. Farvestofferne, der anvendes i vivo undersøgelser var ikke umiddelbart påvises ved mikroskopi og fremstillet høj baggrund; formodentlig ville dette også udelukke nøjagtig plade læser påvisning.

For i vivo undersøgelser er donor celler sundhed vigtigt at bevare deres vandrende funktion. Høsten af donor celler bør ske som led i ikke-overlevelse kirurgi, snarere end at ofre donordyret og derefter høst celler, hvilket øger sandsynligheden for iskæmi og celle død. Tid mellem injektion og høst er en vigtig overvejelse for forsøg, hvor der anvendes forskellige cellepopulationer; niveauet for divergens eller ligheden mellem cellepopulationer kan ændre sig over tid. Bearbejdelses tid efter høst fra donor indtil injektion i modtageren bør minimeres. Derudover er giver/modtager kompatibilitet også kritisk. Menneskelige celler vil hurtigt blive afvist af mus, selvom intra-arter allogene celler er veltolereret i korte perioder. For eksempel, vi ikke kan finde en forskel i migrere celler med C57BL/6J eller BALB/cJ donorerne bruges med C57BL/6J modtagere over en periode på 1 time.

Denne i vivo metode er nyttig for at vurdere forskelle i migrerende kapacitet. Både input celler og modtager dyr kan være underlagt farmakologiske eller andre forstyrrelser. Ligeledes kan modtager dyr blive udsat for infektiøse eller inflammatoriske stimuli, eller andre behandlinger, der påvirker lymfocyt menneskehandel¹². Denne protokol kan også anvendes let på Transgene mus linjer. Navnlig dem at udtrykke fluorescerende proteiner ville fjerne behovet for mærkning og kunne forstærke multiplexing strategier.

Det er vigtigt at bemærke, at den tid, hvori forskellige cellepopulationer blandes før injektion skulle reduceres så meget som muligt. Varierende mærket cellepopulationer bør være blandet, når de modtager dyr har været fuldt bedøvede og er klar til injektion. Farvestoffer findes i de forskellige befolkninger kan blande, hvilket resulterer i uklare adskillelse mellem to når analyseret ved flowcytometri. Derudover kan forskellige behandling betingelser påvirker de ubehandlede celler i løbet af denne tid. Agenter, der binder sig til cellens overflade kan eksempelvis overføres til de ubehandlede celler, hvorved forstyrrende resultater.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Cell culture flask	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish	Corning	1007
24 well plate	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin Insert	Corning	CB354597
15 mL conical tube	Corning	352097
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technology	9998S
Human Recombinant MCP-1	Peprotech	300-04
Adult bovine Serum	Sigma	B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e plate reader	Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope	Olympus
Isothesia	Henry Schein animal health	11695-6776-2	Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo Fisher Scientific	C2925	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe	BD Syringe	309646
1ml TB syringe	BD Syringe	309625
THP-1 cell line	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100228	Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody	Biolegend	115540	Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		Flow cytometer