Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

Published: October 30, 2017 doi: 10.3791/56218
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Biochemical Genetics and Metabolism, The Rockefeller University

Summary

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

Abstract

כימוטקסיס הוא העברה לאורך כימי מסוים מעבר צבע1. נוגדנים הם ציטוקינים chemotactic לקדם סחר הסלולר עם ירידה לפרטים אנטומיים, זמני2. כימוטקסיס הוא פונקציה קריטית של לימפוציטים, תאים חיסוניים אחרים זה יכול להיות באופן כמותי מוערך ב חוץ גופית. כתב יד זה מתאר שיטות המתירים הערכת כימוטקסיס, גם במבחנה וגם ויוו, עבור סוגי תאים מגוונים כולל שורות תאים ותאים מקורית. ה במבחנה, עיצוב מבוסס על צלחת מאפשר השוואת בו-זמנית בתוך מספר תנאים בזמן אמת, ואת יכולה להסתיים תוך 1-4 ח' במבחנה assay תנאים ניתן לטפל להציג אגוניסטים ו antagonists, כמו גם להבדיל כימוטקסיס chemokinesis, וזו תנועה אקראית. עבור ויוו הערכות סחר, תאים חיסוניים יכול להיות עם צבעי פלורסנט מרובים תוויות, המשמש להעברת המאמצת. תיוג דיפרנציאלית של תאים מאפשר לאוכלוסיות לתא מעורב להיות מוחדרים החיה אותו, ובכך להקטין את השונות, להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים עבור ניסוי מופעל כראוי. הגירה לתוך רקמת הלימפה מתרחשת בתוך פחות משעה ולאחר מספר תאי רקמות ניתן לטעום. Cytometry זרימה לאחר הקציר רקמות מאפשר ניתוח מהיר ולא כמותית של דפוסי הנדידה סוגי תאים מרובים.

Introduction

חסינות חסון דורש התיאום הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית מורכב של מספר עצום של סוגי תאים על מנת להגיב כראוי על פציעה, זיהום, ליצור self-tolerance. מספר הקולטנים כימוקין עשרות וליגנדים המקביל שלהם התגלו, המנגנונים המולקולריים מתן מאופיין על ידי אילו תאים מסוים ויכולה להיות מכוונת לתוך רקמה ספציפית בזמן מסוים. לפיכך, לומד כימוטקסיס והעברה היא מרכיב הכרחי של מחקר באימונולוגיה. אכן, וזמינותו שתואר במבחנה לאחרונה שימשה ככלי מיון לזיהוי קופקטור chemotactic שמאיץ כימוטקסיס של תאי-T לכיוון נוגדנים 19 ו- 21 C-C3. מטרת בשיטות המתוארות כאן הם להתיר הערכות כמותיות של תאים חיסוניים כימוטקסיס במבחנה , בתוך vivo.

וזמינותו קאמרית בוידן (נדידת תאים, הפלישה) היא שיטה זולה, הדירים מהירה להערכת תא העברה4,5. ב וזמינותו סטנדרטי, התא העליון הוא נזרע עם תאים, מופרדת באמצעות הוספה נקבובי מ. התא התחתון, שאליו העברת התאים. בזמן הרצוי, תאים היגרו בצד התחתון של הקדמי יכול להיות קבוע, עבור כימות מוכתמת מיקרוסקופ אור. אולם, מדידות כאלה להגביל איסוף נתונים נקודת סיום יחיד, שמונע את איסוף נתונים דינאמי, באפשרותך לדרוש אופטימיזציה מקיפה כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלי לניתוח. . הנה, מספר עיבודים מתוארים כי היתר בזמן אמת, כמותיים, מרובבת מדידות של כימוטקסיס במבחנה.

ללימודים ויוו , משמש נקודת סיום פונקציונלית, כלומר הצטברות תאים בתא רקמות נתון ספציפי. תאי התורם מראש שכותרתו יוכנסו חיות נמען באמצעות העברת המאמצת. אלה בתאי התורם לאחר מכן ניתן לזהות על ידי cytometry זרימה לאחר הקציר רקמות הנמען. הציג גם היא אסטרטגיה משותפת תיוג המאפשר קביעת סחר לסוגי תאים שונים בתוך חיה נמען בודד. שיטה זו מבטלת את הווריאציה בין בעלי חיים הזרקת תאים, ואת חשבונות עבור הפיזיולוגיות השתנות בין בעלי חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים אושרו על-ידי אוניברסיטת רוקפלר ' s אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש. כל החיות שוכנו בתנאים מסוימים ללא הפתוגן.

1-ב חוץ גופית כימוטקסיס

  1. תרבות THP-1 תאים 6 בשנת 1640 המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI 1640) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 4-(2-hydroxyethyl)-1- חומצה piperazineethanesulfonic (HEPES; 25 מ מ) (להשלים מדיה), שמירה על הצפיפות בין 0.5-1.0 x 10 6 תאים למ"ל.
    2. צלחת
  2. תרבית תאים 35 מ מ, תווית 3.5 x 10 תאים 5 THP-1 לכל תנאי עם acetoxymethyl calcein (calcein-אם; 2.5 מיקרומטר) או אחרים מתאימים הפלורסנט בתקשורת מלאה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות
    הערה: צבעי חייב להיות קרום התא-חדיר ותואמת לחיות תאים תיוג.
  3. חם מראש קורא צלחת כדי 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: בנוסף בקרת טמפרטורה, פונקציונליות התחתון-קריאה נדרש גם. ראה שלב 1.10.2 עבור אלטרנטיבה קורא צלחת על כימות של נדידת תאים.
  4. בעוד תאים הם תיוג, להכין את צלחת assay והרכבים נמוך. צלחת
    1. שימוש בתרבות רקמה 24-. טוב, בתנאי אחד לכל טוב. לבצע כל תנאי דולר.
    2. 750 להוסיף µL של האנק ' s Buffered תמיסת מלח (HBSS) באגירה מלאה עם 25 מ מ HEPES ו- 0.1% שור אלבומין (BSA) לצלחת 24-. טוב. זה משמש התנאי שליטה הבזליים.
      1. שימוש אחרים בארות תנאים השוואה, תמיד שמירה לנפח הכללי בתא התחתון-750 µL.
        הערה: בדוגמה זו, האדם מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1) משמש הפקד חיובי עבור כימוטקסיס 7.
        1. להרכיב התערובת מגיב על-ידי שילוב HBSS עם 25 מ מ HEPES, BSA (0.1%) ו MCP-1 (75 ng/mL). להשתמש בסרום שור למבוגרים (2.7% v / v) עם MCP-1 כפקד חיוביים נוספים של.
          הערה: ריכוז כימוקין כימוקין יהיה תלוי על ציר chemotactic במחקר. Lyophilized MCP-1 resuspended מים מזוקקים עם BSA (0.1%) כדי להפוך פתרון מניות עם ריכוז סופי של 50 μg/mL. זה יכול להיות מדולל במים לפתרון עבודה של 10 μg/mL. להוסיף 5.6 μL של פתרון זה לתא התחתון.
    3. בתום ההרכב של התאים התחתון, במקום הוספה נקבובי כל טוב, ולהבטיח הכרטיסיות של הקדמי ליישר עם החריצים של הצלחת-
      הערה: בחר את גודל הנקבוביות המתאים עבור מוסיף. עבור ומונוציטים ו לימפוציטים, גודל הנקבוביות של 3 μm מבצע טוב. כמה סוגי תאים ו/או מערכות כימוקין עשויים לדרוש משטח מצופה מטריקס עבור העברה אופטימלית. לדוגמה, למדידת THP-1 כימוטקסיס מונוציט לכיוון MCP-1, fibronectin או מוסיף מצופים קולגן מומלצים. צלחת קורא עבור כימות, הוסף חייבת להיות ציפוי impermeant-אור, כגון פוליאתילן terephthalate, כדי למנוע גילוי של אי-העברת תאים העליונה הקאמרית 8.
  5. לאחר המקננת תאים למשך 30 דקות עם calcein-AM, להעביר תא ההשעיה צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה תאים ב- 1000 g x עבור 2 דק לבדוק חזותית תאים כדי לאשר ספיגת של calcein-אם ( איור 1).
  6. הסר בזהירות את תגובת שיקוע באמצעות ליניקת אבק. רחץ תאים עם תוויות ללא סרום RPMI 1640 בתוספת HEPES 25 מ מ. צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.
  7. Resuspend תאים ללא סרום RPMI 1640 בתוספת HEPES 25 מ מ. לספור תאים, לכוונן את עוצמת הקול כך התאים נמצאים ריכוז סופי של 1.0-1.5 x 10 6 תאים למ"ל.
  8. 250 לוותר על μL של התליה תא לתוך תותב (העליון קאמרית).
  9. לאחר כל צ'יימברס העליון היו מלאים, בעדינות להרים את הצלחת לבדוק את החלק התחתון לנוכחות של בועות אוויר שעלולות לפגוע ההעברה וזיהוי. כדי להסיר בועה, נסה תחילה הסרת ואז מיצוב מחדש את תותב. אם לא מוצלח, שימוש במחט 27 G לנקב את הבועה ולאחר מכן מקם מחדש את תותב.
  10. למקם את הצלחת לקורא צלחת מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס.
    1. רכוש קריאות קרינה פלואורסצנטית מלמטה במרווחים 1-3 דקות. בעת השימוש calcein-AM, הגדר קרינה פלואורסצנטית אורכי גל עירור, פליטה-485 nm ו 520 nm, בהתאמה. בהתאם למערכת כימוקין וסוג התא, כימוטקסיס מתרחשת בדרך כלל יותר מ 1-4 h ( איור 2 א).
    2. כחלופה מדידות רציף באמצעות קורא-צלחת, תמונה הבארות באמצעות הפוכה פלורסנט במיקרוסקופ ( איור 2B) מסוגל עירור וזיהוי של אור-485 nm ו 520 nm, בהתאמה. השתמש הגדלה נמוכה כדי ללכוד את רוב החלק התחתון של הקדמי. לכמת תאים על-ידי עיבוד התמונות עם ImageJ או תוכנה דומה 9.

2. המאמצים העברה של מאתר לימפוציטים

  1. הכנה תאי התורם
    1. Anesthetize בשבוע 8-12-C57BL/6J הישן תורם זכר עכברים עם הרדמה איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של. לאשר עומק ההרדמה המתאימה על ידי הבוהן-קמצוץ.
    2. הנח את העכבר במצב פרקדן. עושים חתך קו האמצע עם איזמל ואתר הטחול בחלל הצפק השמאלי העליון. לסלק כל הטחול, למקם את המדיה מלאה (RPMI בתוספת 10% FBS עד 25 מ מ HEPES; 1 mL/טחול) על קרח. המתת חסד התורם מרדימים בעלי חיים על ידי עריפת ראש.
    3. לטחון רקמת טחול בעדינות דרך רשת ניילון מיקרומטר 40 לתוך מדיה מלאה (1 מ"ל /spleen) באמצעות סוף פומפה מזרק כדי להפוך תא בודד השעיה והעברה של צינור חרוטי 15 mL-
    4. להוסיף 4 כרכים של אמוניום כלוריד האשלגן (ACK) פירוק מאגר ואת תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי lyse אריתרוציטים.
    5. Centrifuge התאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע. אם אריתרוציטים נשארים בגדר, resuspend במאגר פירוק ACK, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.
    6. Resuspend התאים בתקשורת מלאה-ריכוז של 2-5 x 10 7 תאים למ"ל, ואז מסננים התליה תא דרך רשת ניילון 40 µm כדי להסיר שאריות תאים.
    7. תווית 1 x 10 7 תאים/נמען עכבר עם תואם הפלורסנט חיים תאים, זה יוסיף להישמר על קיבוע עוקבות, כגון 5-chloromethylfluorescein diacetate (ריכוז סופי 2 μM) 10 . דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות
      הערה: כדי לעקוב אחר אוכלוסיית תא אחד או יותר, השתמש אחרים צבעי פלורסנט עם אוכלוסיות תאים נוספים. For example, חלק של תאי התורם יכול להיות מסומן באמצעות בנזואיל 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)) אמינו) tetramethylrhodamine (ריכוז סופי 2 μM) 11-
    8. להוסיף 4 כרכים HBSS בתוספת 25 מ מ HEPES, ולאחר מכן צנטריפוגה ב g 1,000 x עבור 2 דקות ו להשליך תגובת שיקוע. Resuspend צנפה ב HBSS בתוספת HEPES 25 מ"מ עד ריכוז סופי של עונה 1 פרק 10 8 תאים/מ ל....
      1. אם משתמש אחד או יותר הפלורסנט, לשמור על אוכלוסיות תאים מופרדים עד מייד לפני הזרקת.
      2. העברה של aliquot קטן (10 μL) של תאים של כל צבע פתרון מקבע (1 מ"ל) פיצויים cytometry זרימה עוקבות.
  2. העברה של לימפוציטים
    1. עזים ומתנגד בשבוע 8-12-בת C57BL/6J זכר הנמען עכברים עם איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של; לאשר עומק הרדמה על ידי הבוהן-קורט. חלות וטרינרי משחה חיה ' s עיניים כדי למנוע ייבוש.
    2. בקצרה מערבולת תורם תאי (1 s), העברת 1 מ"ל הזרקת מזרק עם G 27, 0.5 ב המחט, שילוב אוכלוסיות תאים עם תוויות באופן שונה, אם הדבר ישים.
      1. העברה של aliquot קטן (10 μL) של תאים מעורב פתרון מקבע (1 מ"ל) עבור ניתוחים cytometry זרימה עוקבות.
    3. מקום חיות לתורם בשכיבה. הפעילו לחץ מתון סימטרית על העור הגבי לעין, גורם של גלגל העין לבלוט מעט.
    4. לכוון את המחט medially, להזריק 100 µL של התורם תא השעיה רטרו-orbitally לתוך עכבר לכל הנמענים. גם יכול להיות מוזרק התאים דרך הווריד זנב של.
    5. בהדרגה לשלוף את המחט הזרקה, הנח העכבר לבד בתוך כלוב ההתאוששות. צג חיה עד זה שהכרתו; שהחלמת באופן מלא פעם לשוב החיה דיור חברתי.
  3. איסוף וניתוח
    1. לאחר 1 h, עזים ומתנגד הנמען עכברים עם הרדמה איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של; לאשר עומק הרדמה על ידי הבוהן-קורט. הקציר הטחול (או רקמות אחרות עניין) (שלב 2.1.2.) של כל הנמענים העכבר ומקום לתוך המדיה מלאה (mL/נמען 1). המתת חסד מרדימים בעלי חיים על ידי עריפת ראש.
      הערה: מרווחי לפני הקציר רקמות יגדל הצטברות רקמת דרך לפחות 24 ח'
    2. לטחון רקמת טחול בעדינות דרך רשת ניילון מיקרומטר 40 לתוך מדיה מלאה באמצעות סוף פומפה מזרק כדי להפוך תא בודד השעיה והעברה של צינור חרוטי 15 mL-
    3. להוסיף 4 כרכים של פירוק ACK מאגר, דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. Centrifuge התליה תא ב 1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע.
      4. מאגר
    4. תאים resuspend מכתים (תמיסת מלח באגירה פוספט בתוספת 1% FBS). לספור תאים ולהתאים את ריכוז הסופי של 3 x 10 7 תאים/מ ל.... להעביר 100 µL תא השעיה 96-ובכן סביב הצלחת התחתונה.
    5. הכתם תאים עבור סמני הרצוי (ראה טבלה של החומרים) לניתוח על ידי cytometry זרימה. מוסיפים נוגדנים fluorophore מצומדת (ראה טבלה של החומרים) נגד הסמנים הרצויים, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך. להוסיף 100 µL מכתים מאגר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.
    6. Resuspend בגדר ב 200 µL מכתים מאגר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.
    7. Resuspend בגדר ב 125 µL מכתים מאגר ולרכוש דוגמאות שימוש cytometer זרימה באמצעות הליכים סטנדרטיים.
      הערה: הצבע הירוק הוא נרגש על ידי 488 ננומטר לייזר, הפליטה ומתגלה עם מסננים ודיקרואיק זוהר 505 ו- 530/30. הצבע הכתום נרגש 561 nm ו הפליטה מזוהה באמצעות מסנן ודיקרואיק זוהר 582/15.
      1. שימוש הציל תאים מכל 2.1.8.2 כדי לפצות על כל הפלורסנט.
        הערה: באמצעות פיצוי מבוסס-חרוז עם fluorophores תואמים את עירור ואת ספקטרום הפליטה של צבעים תיוג תגרום פיצוי שיוצרת.
      2. השתמש תאי קלט ששמרת משלב 2.2.2.1 במדויק לקבוע את היחס שבין באופן שונה עם התווית תאי קלט אם משתמש אחד או יותר שכותרתו האוכלוסייה ( איור 3). לחשב רקמות ספציפיות ההעברה המבוססים על היחס של תווית לתאים ללא תווית ( איור 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעת שימוש calcein-אם צבע, בדיקה ויזואלית של תאים יאשר תווית ספיגת (איור 1). קריאות פלורסנט אוטומטיות יעקבו הגירה כמו תאי המעבר אל החלק התחתון של הקדמי לאורך זמן. נתונים אלו מראים בבירור אינדוקציה של נדידת תאים לכיוון MCP-1, כמו גם על הגדלת של תגובה זו על ידי סרום (איור 2 א). בהתאם על כוחו של הגירוי נודדות, יש פער לפחות 15 דקות לפני עלייה אות. האות פלורסנט ייתכן שיא ולאחר מכן בהדרגה ירידה. זה מייצג ירידה נטו מספר התאים הקפדה על החלק התחתון של הוספה תאים עוברים בתוך תמיסת אל החדר התחתון בקצב מהר יותר של תאים נודדים מהתא העליון. גירויים חזקים יותר נודדים בדרך כלל התוצאה) התפרצות קודמת של עלייה פלורסצנטיות ערכים; b) מהיר של עליית זריחה; ו- c) ערכים גבוהים יותר של קרינה פלואורסצנטית שיא. להחליפן בתמונות נרכשה על-ידי קרינה פלואורסצנטית הפוכה מיקרוסקופ מוצגים גם (איור 2B), עם כימות של ספירת (איור 2C).

ללימודים ויוו ניצול תווית פלורסנט אחד או יותר, חשוב quantitate חלקם היחסי של אוכלוסיות תאים בחומר קלט. וזה מסביר השונות תוך ערבוב האוכלוסיות תא להזרקה (איור 3). במקרה זה, היחס של תאים פלורסנט ירוק כתום היה 0.97:1. לפיכך, להסביר חוסר איזון קלה, ירוק-פלורסנט תא ספירת חולקו על ידי 0.97 למדד מספרם בפרופורציה החומר קלט. לאחר לכימות תאים עם תוויות על-ידי cytometry זרימה, סחר בבני אדם ניתן לכמת כמו מספר תאים עם תוויות התאושש מחולק על ידי המספר הכולל של תאים התאושש.

תוצאות אלו ממחישות את היתרון של שימוש באסטרטגיה כפולה-צבע, מה שמבטל את השפעת יעילות הזרקת בדרגות שונות; אמנם יש סטיה ניכרת של תאים התאושש בין בעלי חיים, עבור כל חיה נתונה שהיחס של תאים ירוק-פלורסנט כדי כתום-פלורסנט הוא כ שווה (איור 4). תוצאות אלו צפויים, כתא שתי אוכלוסיות טופלו באופן זהה, אבל לפליטת שונים ניתן לבחון את השפעתם על יונת לימפוציטים. סטייה מן הקו של זהות מצביע על יכולות נודדות שונות של אוכלוסיות תאים מסוים. בנוסף, מספר תת-ערכות של התא יכול להיקבע על ידי מכתימה את התאים המשוחזר של החלבונים הרצוי. כאן, תאי T, המצוין על-ידי CD3 מכתים, ו- B-תאים, המצוין על-ידי CD19 מכתים יימצאו גם עם יחסי שווה של תאים ירוק - עד כתום-פלורסנט.

Figure 1
איור 1: תיוג תא. בדיקה ויזואלית של בגדר תא לאחר תיוג מאשר ספיגת נאותה של הפלורסנט (משמאל), בניגוד ל לפני תיוג (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: כימות במבחנה ההעברה. (א) נציג נתונים (זאת אומרת ± תקן שגיאה) רכשה ב בזמן אמת מקורא צלחת השוואת תנאים 3: מדיה (בקרה), כימוקין (MCP-1, 75 ng/mL) או כימוקין עם סרום (MCP-1, 75 סרום ng/mL ושור, 2.7% v/v במאגר). קריאות נרכשו מן החלק התחתון של כל 3 דקות הצלחת עם אורך גל עירור של 485 גל nm וזיהוי של 520 ננומטר. Micrographs נציג (B)-4 X ההגדלה של החלק התחתון של הקדמי ב- h 1, אשר מאפשרת פריט חזותי ישיר מעביר תאים. גודל ברים = 500 מיקרומטר (צהוב). (ג) כימות של מספר הטלפון הנייד לכל שדה מאפיק נמוך (LPF; 4 X) באמצעות תוכנת ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: צבעונית תאי קלט. מגרש cytometry זרימה מציג את היחס בין השניים באופן שונה מוכתם תא אוכלוסיות בקלט תא מוזרק משלב 2.2.2.1. היחס מחילופי עלילה זו מגישה לתיקון הסטייה הציג במהלך ערבוב ראשוני של שתי האוכלוסיות, משמש להתאמת תא ספירת במהלך ניתוח נתונים במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: יחס של תאים עם תוויות התאוששה טחולים של חיות הנמען. הפרופורציות של תאים פלורסנט ירוק או כתום-פלורסנט מוצגים כאחוז splenocytes המשוחזר, הכולל עם כל נקודת נתונים המייצג חיה נמען בודד. סה עם התווית תאים הם המוצגות (משולש), כמו גם קבוצות משנה גם צבעונית חיובית סמני פני השטח של התא CD19 (מרובע) או CD3 (עיגול). קו מקווקו הוא הקו של זהות שבו היחס בין צבעים הוא שווה ל- 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כימות של נדידת תאים חיסוניים יכול להתבצע באמצעות פשוטה, מהירה מבחני גם בתוך vitro וגם ויוו. נדגים את כימוטקסיס במבחנה של ומונוציטים האדם בתגובה שיפוע MCP-1 ו הגדלת מאת סרום. In vivo, splenocytes מאתר התורם באופן שונה עם תווית, בעקבות העברת המאמצת, ששוחזרו מחיות הנמען.

שימוש בקורא צלחת יש את היתרון של דגימה מספר נקודות זמן (לעתים קרובות כמו כל 30 s) אוטומציה של כימות של העברת תאי. זה obviates הצורך לבחור נקודה פעם והערכת הימנעות שיטות יותר שדורשת ספירה ידנית של בארות בודדים. יתר על כן, שיטה זו מספקת מידע דינמיות יותר ממה יכול להיות שנאספו על ידי מיקרוסקופ. במהלך ניתוח זה חייב להישמר כי תאים תיפול את תותב לתוך החדר התחתון, לא אתרום עוצמת קרינה פלואורסצנטית. לפיכך, מספר התאים בצד התחתון של הקדמי, כמצוין על-ידי קרינה פלואורסצנטית היחסי, יהיה פונקציה של קצב העברה וקצב שבו תאים ליפול את תותב.

תאים גדולים עשויים לדרוש מוסף עם נקבוביות גדולות יותר, מוסיף נקבובי μm 8 הינם זמינים. תאים קטנים יותר (כולל ילידי לימפוציטים) לא יכול להיות מספיק פיקח באופן אמין יזוהו על-ידי fluorimeter ועשויה הערכה על ידי מיקרוסקופ, במיוחד עבור שינויים קטנים ב כימוטקסיס. כמה סוגי תאים עשויים יחלוף במהירות בתוך תמיסת קאמרית נמוכה יותר ואין זמן מגורים מספיק זמן על תותב שהוא זוהה, וכתוצאה מכך עיקול שעברו שיטוח. במקרה זה, ניתן לכמת תאים על-ידי cytometry ישירות מן הפתרון קאמרית התחתון, או הוספה מצופים מטריצה יכול לשמש כדי להאריך את זמן העברה בנוסף לשימוש מוסף עם נקבוביות קטנות יותר (למשל 1 μm).

קריטי כדי מבחני אלה הוא הזיהוי של תנאים נודדות חזקים. ללימודים במבחנה , על סוג התא למד להיות מסוגל להגיב chemoattractant, יש לקחת בחשבון גורמים שותף נחוץ. אופטימיזציה עשויות להידרש צפיפות תא הציג בחדר העליון. באופן כללי, צפיפות גבוהה יותר תגרום אות חזק, אבל זה צריך להיות מאוזנת כנגד אות שאינם ספציפיים העברה גבוהה יותר. בדיקת טווח ריכוזים chemoattractant עשוי גם לסייע לזהות חלון טמפורלית מתאימים עבור לכידת ההעברה.

שיטה זו יכול גם להיות מותאם כדי להשתמש בצבעים מרובים. זה יפחית שכעיקרון השתנות, כמו גם הגדלת מספר תנאים ניתן לכלול וזמינותו יחיד. השיקול כאן הוא הבהירות של צבעי פלורסנט. Calcein-אם הוא בהיר מאוד ולכן בקלות שזוהו על-ידי יישומים קוראי מיקרוסקופ וגם צלחת. בעוד הצבעים המשמשים ויוו מחקרים שלא זוהו בקלות על ידי מיקרוסקופ והפיק רקע; ככל הנראה זה גם למנוע זיהוי הקורא צלחת מדויק.

ללימודים ויוו , הבריאות של תאים תורם חשוב לשמר את תפקוד הנדידה שלהם. הקציר תאי התורם צריך להיעשות במסגרת של הניתוח ההישרדות, ולא להתפשר על החיה תורם, ואז קציר תאים, אשר מגבירה את הסבירות של איסכמיה התא מוות. הזמן בין הזרקת הקציר הוא שיקול חשוב עבור ניסויים שבהם משמשים אוכלוסיות תאים שונים; הרמה של סטייה או הדמיון בין אוכלוסיות תאים עשויים להשתנות עם הזמן. זמן עיבוד לאחר הקציר מהתורם עד זריקה לתוך המטופל צריך להיות ממוזער. גם, התורם/נמען תאימות גם הוא קריטי. תאים אנושיים במהירות יידחו על ידי עכברים, למרות תאים allogeneic אינטרה-מינים הם נסבל היטב על פני תקופות קצרות. לדוגמה, לא נמצא הבדל נדידת תאים עם תורמים C57BL/6J או BALB/cJ שנמצאים בשימוש עם C57BL/6J הנמענים על פני תקופה של 1 h.

בשיטה זו אין ויוו שימושית לשם הערכת הבדלים יכולת הנדידה. שניהם קלט תאי, נמענים בעלי חיים יכולים להיות כפופים לפליטת תרופתי או אחר. באופן דומה, ניתן לחשוף חיות הנמען גירויים זיהומיות או דלקתיים, או טיפולים אחרים המשפיעים על סחר לימפוציט12. פרוטוקול זה ניתן בקלות להחיל גם לקווי הטרנסגניים העכבר. בפרט, ביטוי חלבונים פלורסנט ולייתר את תיוג, יכול פלאטין ריבוב אסטרטגיות.

חשוב לציין כי הזמן שבו אוכלוסיות תאים שונים מעורבבים לפני הזריקה צריך להיות מופחת ככל האפשר. צריך להיות מעורב אוכלוסיות תאים עם תוויות באופן שונה רק לאחר החיות נמען יש כבר מורדם לחלוטין והם מוכנים להזרקה. צבעים נוכח האוכלוסיה השונות יכול לערבב, וכתוצאה מכך הפרדה לא ברורה בין השניים כאשר מנותח על ידי cytometry זרימה. בנוסף, טיפול שונה תנאים יכול להשפיע על התאים שלא טופלו במהלך תקופה זו. לדוגמה, סוכנים לאגד פני השטח של התא עשוי להיות מועבר לא מטופל התאים, ובכך משתנה מתערב תוצאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית ברנרד שוורץ ל' עבור הרופא מדענים האוניברסיטה רוקפלר, הקרן לפיתוח טיפולית רוברטסון באוניברסיטה רוקפלר, ואת מרכז ע ש סאקלר וההתערבות ומחקר תזונה- אוניברסיטת רוקפלר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630-080
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
Cell culture flask Corning 353136
Calcein AM Thermo Fisher Scientific C1430 Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish Corning 1007
24 well plate Corning 353504
Fluoroblok Fibronectin Insert Corning CB354597
15 mL conical tube Corning 352097
Bovine Serum Albumin Cell Signaling Technology 9998S
Human Recombinant MCP-1 Peprotech 300-04
Adult bovine Serum Sigma B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red Thermo Fisher Scientific 14025-092
SpectraMax M2e plate reader Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope Olympus
Isothesia Henry Schein animal health 11695-6776-2 Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon Falcon Corning 352340
ACK lysing buffer Quality Biological 118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye Thermo Fisher Scientific C2927 Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo Fisher Scientific C2925 Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe BD Syringe 309646
1ml TB syringe BD Syringe 309625
THP-1 cell line ATCC TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody Biolegend 100228 Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody Biolegend 115540 Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate Corning 353077
LSRII BD Biosciences Flow cytometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
  2. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
  3. Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
  4. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
  5. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  6. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  7. Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
  8. Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
  9. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  10. Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
  11. West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
  12. Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).

Tags

אימונולוגיה גיליון 128 לימפוציט מונוציט כימוטקסיס הקאמרית ההעברה ופלישה תא cytometry זרימה המאמצת העברה העברה assay
לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס <em>במבחנה</em> , לימפוציט מאתר סחר <em>In Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prangley, E., Kumar, T., Ponda, M.… More

Prangley, E., Kumar, T., Ponda, M. P. Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo. J. Vis. Exp. (128), e56218, doi:10.3791/56218 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter