Summary
Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.
Abstract
Kemotaksis geçiş boyunca belirli bir kimyasal degrade1değil. Kemokinler hücresel anatomik ve temporal özgüllük2ile ticareti teşvik kemotaktik sitokinler vardır. Kemotaksis lenfositler kritik bir fonksiyonudur ve kantitatif olabilir diğer bağışıklık hücreleri içinde vitrodeğerlendirildi. Bu el yazması Kemotaksis, değerlendirilmesi izin yöntemleri açıklar vitro ve in vivo, hücre satırları ve yerel hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre türleri için. Vitro, plaka tabanlı biçimi çeşitli koşullar aynı anda içinde karşılaştırma izin verir gerçek zamanlı, 1-4 h. vitro tahlil koşullar olarak tanıtmak agonistleri ve antagonistleri, manipüle içinde tamamlandı ve su kuyusu aynı derecede kemotaksis rasgele hareket olduğu chemokinesis ayırt etmek. Vivo kaçakçılığı değerlendirmeler için bağışıklık hücreleri birden çok floresan boyalar ile etiketli ve evlat edinen transfer için kullanılan. Fark hücrelerinin etiketleme karma hücre popülasyonlarının böylece varyans azaltmak ve hayvanlar için yeterince güçlü bir deney gerekli sayısını azaltarak aynı hayvan içine sunulmasına olanak sağlar. Az 1 h olarak geçiş içine lenfoid doku oluşur ve birden fazla doku bölmeleri tatmak mümkündür. Akış Sitometresi doku hasat takip birden çok hücre tipleri göçmen kalıpları hızlı ve nicel analiz için sağlar.
Introduction
Güçlü bağışıklık uygun şekilde karşılık vermek için yaralanma, enfeksiyon ve self-tolerance oluşturmak için hücre tiplerinin sayısız karmaşık zamansal ve mekansal koordinasyon gerektirir. Birkaç düzine Kemokin reseptörleri ve onların karşılık gelen ligandlar keşfettim ve belirli hücreleri tarafından karakterize sağlayan moleküler mekanizmaları belirli bir zamanda belirli bir doku yönlendirilebilir. Böylece, kemotaksis ve geçiş eğitim İmmünoloji araştırma vazgeçilmez bir bileşendir. Nitekim, açıklanan vitro tahlil son zamanlarda T-hücrelerin kemotaksis C-C kemokinler 19. ve 213doğru hızlandırır kemotaktik kofaktör tanımlamak için bir tarama aracı olarak kullanıldı. Yöntem tanımlamak burada amacı olan bağışıklık hücre kemotaksisi vitro ve içinde vivonicel Değerlendirmeler izin vermek için.
Boyden (hücre göç ve işgali) odası tahlil hücre geçiş4,5değerlendirmek için ucuz, tekrarlanabilir ve hızlı bir yöntemdir. Standart tahlil üst odası hücrelerle tohumlari ve içine hücrelerin göç daha düşük bir odası den gözenekli bir ekleme tarafından ayrılmış. İstediğiniz saatte ekleme alt geçiş hücreleri sabit ve Nefelometri için ışık mikroskobu ile lekeli. Ancak, bu tür ölçümleri veri toplama dinamik veri toplama engellemektedir tek bir bitiş noktası için sınırlamak ve geniş en iyi duruma getirme analizi için en uygun zaman noktayı belirlemek için gerektirebilir. Burada, çeşitli uyarlamalar gerçek zamanlı, nicel ve çoğaltılmış ölçümlerinin kemotaksisi vitroizin açıklanmıştır.
Vivo çalışmalar için işlevsel bir bitiş noktası kullanılır, yani belirli birikimi hücre içinde verilen doku bölme. Önceden etiketli donör hücreleri evlat edinen transferi yoluyla alıcı hayvanların içine tanıtıldı. Bu donör hücreleri daha sonra alıcı doku Hasattan sonra Akış Sitometresi tarafından tespit edilebilir. Ayrıca farklı hücre türleri içinde tek bir alıcı hayvan kaçakçılığı belirlenmesi için izin veren co etiketleme bir stratejidir. Bu yöntem hücre enjeksiyon ve fizyolojik arası hayvan değişkenlik hesaplarında arası hayvan varyasyon ortadan kaldırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
tüm yordamları Rockefeller Üniversitesi tarafından onaylanmıştır ' s kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi. Bütün hayvanlar patojen-Alerjik belirli koşullar altında muhafaza.
1. In Vitro kemotaksisi
- kültür THP-1 hücreleri % 10 fetal sığır serum (FBS) ve 4-(2-hydroxyethyl) -1 ile 6 ' Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 (RPMI 1640)- piperazineethanesulfonic asit (HEPES; 25 mM) (tamamlamak medya), 0.5-1.0 x 10 6 hücre/mL arasında yoğunluk bakımı.
- İçinde bir 35 mm hücre kültürü çanağı, koşulu ile calcein acetoxymethyl (calcein-AM; 2.5 µM) veya diğer uygun floresan boya tam medya 37 ° C'de 30 dakika süreyle başına etiket 3.5 x 10 5 THP-1 hücre
Not: Boyalar hücre membran geçirgen ve canlı hücre etiketleme ile uyumlu olmalıdır. - Öncesi sıcak plaka okuyucu 37 ° c
Not: sıcaklık kontrolü yanı sıra, alt-okuma işlevi de gereklidir. Geçiş adım 1.10.2 plaka okuyucu miktar için bir alternatif için bkz: hücre. - Hücreleri etiketleme iken, tahlil plaka ve alt odası hazırlamak.
- Kullanım 24-iyi doku kültürü plakalı iyi başına tek bir şartla. Her koşul nüsha gerçekleştirmek.
- Ekleyin 750 µL Hank, ' s 25 mM HEPES ve % 0.1 sığır serum albümin ile (BSA) 24-şey plakasına arabelleğe Buffered tuz solüsyonu (HBSS). Bu Bazal denetim koşulu olarak hizmet vermektedir.
- Kullanımı diğer kuyular karşılaştırıcı koşullar, her zaman toplam 750 µL adlı alt Kamara hacmindeki sürdürmek için.
Not: Bu örnekte, insan monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) kemotaksisi 7 için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.- Araya reaktif karışımı ile birleştirerek 25 mM HEPES ile HBSS, BSA (% 0,1) ve MCP-1 (75 ng/mL). Yetişkin sığır serum kullanın (% 2.7 v / v) MCP-1 ek bir olumlu denetim olarak.
Not: Kemokin ve Kemokin konsantrasyon kemotaktik ekseni altında eğitim bağlı olacaktır. Liyofilize MCP-1 50 μg/mL nihai bir konsantrasyon ile hisse senedi bir çözüm sağlamak için BSA (%0.1) ile distile suda resuspended. Bunun için çalışan bir çözüm olarak 10 μg/mL suda seyreltilmiş. Bu çözümün 5.6 μL alt odasına ekleyin.
- Araya reaktif karışımı ile birleştirerek 25 mM HEPES ile HBSS, BSA (% 0,1) ve MCP-1 (75 ng/mL). Yetişkin sığır serum kullanın (% 2.7 v / v) MCP-1 ek bir olumlu denetim olarak.
- Kullanımı diğer kuyular karşılaştırıcı koşullar, her zaman toplam 750 µL adlı alt Kamara hacmindeki sürdürmek için.
- Alt chambers bileşimi tamamlandıktan sonra her şey sekmeler ekleme plaka çentikler ile hizalamak sağlanması, gözenekli bir INSERT yerleştirin.
Not: için ekler uygun gözenek boyutu seçin. 3 mikron gözenek boyutunu monosit ve lenfositler için iyi bir performans sergiliyor. Bazı hücre tipleri ve/veya Kemokin sistemleri bir matris kaplı yüzey en iyi geçiş için gerekebilir. Örneğin, THP-1 monosit kemotaksisi MCP-1 doğru ölçmek için fibronektin veya ekler kolajen kaplı önerilir. Nefelometri için plaka okuyucu için ekleme, polietilen tereftalat gibi bir ışık impermeant kaplama sigara geçiş olarak algılanmasını önlemek için olması gerekir hücrelerin üst odası 8.
- Hücreler ile calcein-AM 30 dk için kuluçka sonra hücre süspansiyon 15 mL konik tüp aktarmak. 1000 x g 2 dakika süreyle santrifüj hücreleri kontrol edin calcein-AM ( şekil 1) alımını onaylamak için hücreleri.
- Dikkatli bir şekilde bir vakum aspiratör kullanarak süpernatant çıkarın. Serum-Alerjik RPMI HEPES 25 mM ile desteklenmiş 1640 etiketli hücreleri yıkayın. Santrifüj kapasitesi 1000 x g 2 min için hücreleri ve süpernatant atın.
- Serum-Alerjik RPMI HEPES 25 mM ile desteklenmiş 1640 hücrelerde resuspend. Say hücreleri ve böylece hücreleri 1.0-1.5 x 10 6 hücre/mL nihai bir konsantrasyon, ses seviyesini.
- Hücre süspansiyon Ekle (üst Kamara) içine dağıtmak 250 μL. Sonra tüm üst odaları doldurulmuş, yavaşça plaka kaldırın ve alt geçiş ve algılama ile girişime neden olabilir hava kabarcıkları varlığı için kontrol edin
- . Bir kabarcık kaldırmak için ilk önce Ekle yeniden konumlandırma kaldırmayı deneyin. İşlem başarısız olursa, kabarcık ponksiyon ve ekleme yeniden konumlandırmak için 27 G iğne kullanın.
- Plaka Önceden ısıtılmış 37 ° C plaka okuyucuya yerleştirin.
- Edinme Floresans okuma 1-3 dk aralıklarla alttan. Calcein-AM kullanırken, Floresans 485 uyarma ve emisyon dalga boylarında ayarla nm ve 520 nm, anılan sıraya göre. Hücre türü ve Kemokin sistemine bağlı olarak, kemotaksis genellikle 1-4 h ( şekil 2A) üzerinden ortaya çıkar.
- Sürekli ölçümler alternatif olarak plaka okuyucu kullanarak görüntü bir ters floresan mikroskop ( şekil 2B) uyarma ve ışık algılama yeteneğine sahip 485 kullanarak wells nm ve 520 nm, anılan sıraya göre. Düşük bir büyütme alt ucun çoğunluğu yakalamak için kullanın. Hücreleri ImageJ veya benzer yazılım 9 görüntülerle işleyerek ölçmek.
2. Evlat edinen Transfer, fare lenfosit
- donör hücreleri hazırlanması
- Anesthetize 8-12 hafta-bir Buharlaştırıcı kullanarak isoflurane anestezi (% 1-3) ile eski C57BL/6J erkek donör fareler. Toe-çimdik tarafından uygun anestezi derinliği onaylayın.
- , Sırtüstü pozisyonda fareyi getirin. Bir ensizyon bir neşter ile yapmak ve dalak üst sol Periton boşluğu bulun. Bütün dalak tüketim ve buz üzerinde tam medya (%10 FBS ve 25 mM HEPES RPMI; 1 mL/dalak) yerleştirin. İmzalat donör hayvanlar tarafından işten çıkarma ötenazi.
- Komple medya (1 mL /spleen) bir tek hücre süspansiyon ve transfer 15 mL konik tüp yapmak bir şırınga dalgıç sonuna kullanarak içine grind dalak doku 40 µm naylon mesh hafifçe ile.
- Amonyum klorür potasyum (ACK) lizis eklemek 4 hacimleri tampon ve eritrositler koşullar için oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- Oda sıcaklığında 2 min için 1000 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Eritrositler Pelet içinde kalırsanız, ACK lizis arabellekte resuspend, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya, santrifüj kapasitesi 1000 x g 2 min için hücreleri ve süpernatant atın.
- 2-5 x 10 7 hücre/mL bir konsantrasyon, komple medya hücrelerde resuspend, daha sonra hücre süspansiyon hücre artıkları kaldırmak için 40 µm naylon mesh ile süzün. 5-chloromethylfluorescein diacetate (son konsantrasyonu 2 mikron) 10 gibi sonraki fiksasyon üzerine korunur ve
- Etiket 1 x 10 7 hücreler/alıcı fare ile floresan boya ile uyumlu hücreleri canlı . 30 dakika süreyle 37 ° C'de kuluçkaya
Not: birden fazla hücre nüfus izlemek için ek hücre popülasyonlarının ile diğer floresan boyalar kullanın. Donör hücreleri bir kısmını 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoil ile şekillendirebilir etiketlenir) amino) tetramethylrhodamine (son konsantrasyonu 2 mikron) 11. - Eklemek 4 birimleri ile HBSS takıma 25 mM HEPES, sonra 2 dk ve atma süpernatant için 1000 x g, santrifüj. Pelet HEPES 25 mM için 1 x 10 8 hücre/mL nihai bir konsantrasyon ile takıma HBSS resuspend.
- Birden fazla floresan boya kullanıyorsanız, hemen önce enjeksiyon kadar ayrılmış hücre popülasyonlarının devam.
- Küçük aliquot (10 μL) sonraki Akış Sitometresi tazminat için bir sabitleştirici çözüm (1 mL) her renk hücrelerinin transfer.
- Lenfositler transfer
- 8-12 hafta anestezi-eski C57BL/6J erkek alıcı fareler bir Buharlaştırıcı; kullanarak isoflurane (% 1-3) ile ayak-çimdik tarafından anestezi derinliği onaylayın. Hayvan veteriner merhem uygulamak ' kurutma önlemek için gözleri.
- Kısaca girdap donör hücreleri (1 s) ve 1 mL enjeksiyon şırınga ile 27 G, iğne, 0.5 differentially etiketli hücre popülasyonlarının, varsa birleştirerek aktarmak.
- Küçük aliquot (10 μL) sonraki Akış Sitometresi Analizi için sabitleştirici çözüm (1 mL) karışık hücrelerinin transfer.
- Yüzükoyun sígara donör hayvanlar koyun. Biraz çıkıntı gözün neden göze dorsal cilt hafif Kaudal basınç uygulamak.
- İğne da doğrudan ve donör hücre süspansiyon, 100 µL retro-orbitally her alıcı fare enjekte. Hücre-de var enjekte kuyruk damar yolu ile.
- Yavaş yavaş enjeksiyon iğne geri çekilin ve fare kurtarma kafeste tek başına yerleştirin. Bilinci yerine geldi kadar hayvan izlemek; bir kez tam olarak kurtarılan dönüş hayvan sosyal konut.
- Toplama ve analiz
- sonra 1 h, isoflurane anestezi (1-%3) ile alıcı fareler bir Buharlaştırıcı kullanarak anestezi; anestezi derinliği toe-çimdik tarafından onaylamak. Dalak (ya da diğer doku ilgi) hasat (Adım 2.1.2.) her alıcı fare ve komple medya (1 mL/alıcı) yerine. İmzalat hayvanlar tarafından işten çıkarma ötenazi.
Not: Doku hasat öncesinde daha uzun aralıklarla en az 24 h ile doku birikimi artacak - Eziyet dalak doku 40 µm naylon mesh ile yavaşça içine bir tek hücre süspansiyon ve transfer için 15 mL konik tüp yapmak bir şırınga dalgıç sonuna kullanarak komple medya. ACK lizis
- eklemek 4 hacimleri tampon ve oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya. 1000 x g oda sıcaklığında 2 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
- Boyama resuspend hücreler arabellek (fosfat tamponlu tuz %1 ile desteklenmiş FBS). Hücreleri saymak ve 3 x 10 7 hücre/mL nihai bir konsantrasyon için ayarlayın. Bir 96-kuyu alt plaka yuvarlak hücre süspansiyon, 100 µL transfer.
- Leke hücreler için istediğiniz işaretçileri (malzemeleri tablo görmek) göre Akış Sitometresi Analizi için. Fluorophore-Birleşik antikorlar (malzemeleri tablo görmek) karşı istediğiniz işaretleyicileri ekleyin ve 20 dakika içinde belgili tanımlık karanlık 4 ° C'de kuluçkaya. 100 µL eklemek arabellek boyama, santrifüj kapasitesi 1000 x g 3 dk için hücreleri ve süpernatant atın.
- Pelet 200 µL resuspend tampon boyama, santrifüj kapasitesi 1000 x g 3 dk için hücreleri ve süpernatant atın.
- Resuspend 125 µL boyama içinde Pelet tampon ve Standart prosedürler kullanarak Akış Sitometresi kullanarak örnekleri elde.
Not: Yeşil boya 488 nm lazer tarafından heyecan ve emisyon 505 ve 530/30 dikroik filtreleriyle algılanır. Turuncu boya tarafından 561 heyecanlı nm ve emisyon 582/15 dikroik filtre tarafından algılandı.- Kaydedilmiş hücreleri floresan her boya için telafi etmek için 2.1.8.2 gelen.
Not: boncuk tabanlı tazminat eşleme uyarma ve emisyon spectra etiketleme boyalar, fluorophores ile kullanılması olarak suboptimal tazminat sonuçlanır. - Adım 2.2.2.1 kaydedilen giriş hücrelerden doğru oranını belirlemek için birden fazla etiketli nüfus ( şekil 3) kullanıyorsanız giriş hücresi differentially etiketli kullanın. Etiketlenmemiş hücrelere ( şekil 4) etiketli doku belirli geçiş oranı üzerinde dayalı hesaplamak.
- Kaydedilmiş hücreleri floresan her boya için telafi etmek için 2.1.8.2 gelen.
- sonra 1 h, isoflurane anestezi (1-%3) ile alıcı fareler bir Buharlaştırıcı kullanarak anestezi; anestezi derinliği toe-çimdik tarafından onaylamak. Dalak (ya da diğer doku ilgi) hasat (Adım 2.1.2.) her alıcı fare ve komple medya (1 mL/alıcı) yerine. İmzalat hayvanlar tarafından işten çıkarma ötenazi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Calcein-AM boya kullanırken, hücre görsel muayene etiketi alımı (şekil 1) onaylayın. Otomatik floresan okuma zaman içinde ucun alt üzerine hücreleri transit olarak geçiş izler. Bu veriler, serum (şekil 2A) tarafından bir indüksiyon hücre göç MCP-1 doğru hem de bu yanıt bir büyütme açıkça gösteriyor. Göçmen uyarıcı gücüne bağlı olarak, en az 15 dk önce sinyal artışı bir gecikme yoktur. Floresan sinyal zirve ve sonra yavaş yavaş düşüş. Bu hücreler bir hızda düşük odasına çözüm içine Üst odasından geçiş hücreleri daha hızlı geçerken ekleme alt kalarak hücre sayısı net bir düşüş gösterir. Genellikle daha güçlü göçmen uyaranlara neden bir) önceki başlangıçlı bir artış Floresans değerleri; b) daha hızlı Floresans artış oranı; ve c) daha yüksek tepe Floresans değerler. Ters Floresans mikroskobu tarafından alınan temsilcisi görüntüleri de (şekil 2B), hücre sayısı (şekil 2C) Nefelometri ile gösterilir.
Birden fazla floresan etiket kullanan in vivo çalışmalar için hücre popülasyonlarının giriş malzeme göreli oranı quantitate önemlidir. Bu hücre popülasyonlarının enjeksiyon (şekil 3) için karıştırma varyans için hesaplar. Bu durumda, yeşil ve turuncu floresan hücreleri oranını 0.97:1 oldu. Böylece, hafif bu dengesizliği için hesap için yeşil-floresan hücre sayımları 0,97 sayıları giriş malzeme ile orantılı olarak dizin tarafından ayrıldı. Etiketli hücreleri iyileşti iyileşti hücreleri toplam numarasına göre bölünmüş olarak etiketli hücreleri tarafından Akış Sitometresi miktarının sonra ticareti sayısal.
Bu sonuçlar değişen enjeksiyon etkinliği etkisini ortadan kaldırır çift renkli strateji kullanmanın avantajı göstermek; hayvanlar arasında kurtarılan hücrelerinin önemli farkı ise, yeşil-floresan turuncu-floresan için hücre oranı yaklaşık de verilen herhangi bir hayvan için (şekil 4) eşit. Bu sonuçlar bekleniyor, iki hücresi olarak nüfus aynı şekilde tedavi edildi, ama çeşitli tedirginlikler lenfosit posta üzerindeki etkileri için test edilebilir. Sapma kimlik satırından belirli hücre popülasyonlarının farklı göçmen yeteneklerini gösterir. Ayrıca, birden çok hücre alt kümeleri istenen proteinler için kurtarılan hücreleri boyama tarafından belirlenebilir. Burada, T-hücrelerin CD3 boyama tarafından belirtilen ve B-hücreleri CD19 boyama tarafından belirtilen, yeşil-turuncu floresan hücreleri eşit oranlarda kazanılmaktadır.
Şekil 1: hücre etiketleme. Etiketleme sonra hücre Pelet görsel muayene yeterli (sağ) etiketleme önce (solda) floresan boyalar, aksine alımını onaylar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Miktar in vitro geçiş. (A)temsilcisi veri elde (ortalama ± standart hata) gerçek zamanlı 3 koşullar karşılaştırarak bir plaka okuyucu: medya (kontrol), Kemokin (MCP-1, 75 ng/mL) veya Kemokin serum (MCP-1, 75 ng/mL ve sığır serum, % 2.7 v/v arabelleği) ile. Okuma plaka her 3 dakikada alt bir uyarma dalga boyu 485 nm ve algılama dalga boyu 520 ile üzerinden satın aldı nm. (B) temsilcisi filmler 4 X büyütme, 1 h, geçiş doğrudan görselleştirme sağlar Ekle alt hücreleri. Ölçek çubukları 500 µm (sarı) =. (C) miktar başına düşük güç hücre sayının (LPF; 4 X) ImageJ yazılımını kullanarak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: giriş hücresi lekeli. Akış Sitometresi arsa differentially iki oranını gösteren hücre popülasyonlarının enjekte hücre giriş--dan adım 2.2.2.1 lekeli. Bu arsa belirlenen oranı ilk iki nüfus karıştırma sırasında sunulan sapma düzeltmek için hizmet vermektedir ve hücre sayısı aşağı akım veri çözümleme sırasında ayarlamak için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: etiketli hücre oranı yeniden elde etmek--dan alıcı hayvanların dalağı. Yeşil flüoresan veya turuncu-floresan hücreleri oranlarını toplam kurtarılan splenocytes yüzdesi olarak tek bir alıcı hayvan temsil eden her bir veri noktası ile sunulmaktadır. Hücreleri etiketli toplam gösterilen (üçgen) yanı sıra aynı zamanda hücre yüzey işaretleri için CD19 (kare) veya CD3 pozitif lekeli alt kümeleri vardır (Daire). Kesikli çizgi renkleri arasındaki oran 1'e eşit nerede kimlik çizgidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miktar bağışıklık hücre göç basit kullanılarak gerçekleştirilebilir ve hızlı içinde in vitro ve in vivodeneyleri. Serum tarafından bir MCP-1 degrade ve büyütme karşısında insan monosit vitro kemotaksisi göstermektedir. Vivo, donör fare splenocytes differentially etiketli ve evlat edinen transferi alıcı hayvanlardan ele geçmiştir.
Bir plaka okuyucu kullanarak birkaç zaman Puan örnekleme avantajı vardır (her 30 olarak sık s) ve geçiş Nefelometri otomatikleştirme hücreleri. Bu değerlendirme ve el ile bireysel kuyu sayma daha emek yoğun yöntemleri kaçınmak için bir tek zaman noktası seçmek gerek namussuz. Ayrıca, bu yöntem mikroskobu tarafından toplanan daha fazla dinamik bilgi sağlar. Çözümleme sırasında Hücre Ekle alt Kamara düşecek ve floresan yoğunluğu katkıda bulunmayacağım unutmayın tutulması gerekir. Böylece, hücreleri Ekle alt göreli Floresans tarafından belirtildiği şekilde geçiş oranı ve hangi tarafından INSERT hücre düşmek hızı bir fonksiyonu olacaktır.
Daha büyük hücreleri bir ekleme daha büyük gözenekli gerektirebilir ve 8 mikron gözenekli ekler kullanılabilir. Daha küçük hücreler (yerel lenfositler de dahil olmak üzere) güvenilir bir fluorimeter tarafından algılanması için parlak olmayabilir ve değerlendirme mikroskobu, özellikle için küçük değişiklikler kemotaksisi tarafından gerektirebilir. Bazı hücre tipleri alt odası çözüm içine hızla geçmek ve yeterince uzun bir ikamet süresi algılanabilmesi için Ekle-düzleştirilmiş eğrideki kaynaklanan sahip değildir. Bu durumda, hücreleri tarafından doğrudan doğruya--dan alt odası çözüm sitometresi sayısal veya bir matris kaplı eklemek bir ekleme daha küçük gözenekleri (örneğin 1 mikron) kullanarak ek olarak transit süresini uzatmak için kullanılabilir.
Sağlam göçmen koşulları tanımlaması bu deneyleri için önemlidir. Vitro çalışmalar, okudu hücre tipi bir chemoattractant yanıt kapasitesine sahip olmalı ve gerekli etkenler dikkate alınmalıdır. En iyi duruma getirme üst odasında tanıttı hücre yoğunluğu için gerekli olabilir. Genel olarak, yüksek yoğunluklu daha güçlü sinyal neden olur, ama bu daha yüksek bir non-spesifik geçiş sinyal karşı dengeli olması gerekiyor. Chemoattractant konsantrasyonları bir dizi test de geçiş yakalamak için uygun bir zamansal pencereyi yardımcı olabilir.
Bu yöntem aynı zamanda birden fazla renk kullanmak için adapte olabilir. Bu makul değişkenliği gibi tek bir tahlil dahil için koşullar artırıldığında azaltacaktır. Burada temel düşüncedir floresan boyalar parlaklık olduğunu. Calcein-AM çok parlak ve bu nedenle kolayca tespit mikroskop ve plaka okuyucu uygulamalar tarafından. Boya için kullanılan, ancak in vivo çalışmalar kolayca mikroskobu tarafından algılanmadı ve yüksek arka plan üretilen; Muhtemelen bu da doğru plaka okuyucu algılama engel.
Vivo çalışmalar için donör hücreleri sağlık göç işlevlerine korumak önemlidir. Donör hücreleri hasat iskemi ve hücre ölüm olasılığını artıran hayatta kalma sigara cerrahi, yerine donör hayvan ödün ve sonra hücreleri, hasat bir parçası olarak yapılmalıdır. Enjeksiyon ve hasat arasındaki zaman farklı hücre popülasyonlarının kullanıldığı deneyler için önemli bir noktadır; Iraksak evrim süreçleri sonucu veya hücre popülasyonlarının arasındaki benzerliği düzeyde zaman içinde değişebilir. Hasat donörden alıcı içine enjeksiyon indirilmelidir kadar sonra işlem zamanı. Ayrıca, donör/alıcı uyumluluk da önemlidir. Intra-türler allojeneik hücreleri kısa sürelerle iyi tolere olsa insan hücreleri hızla fareler tarafından reddedilir. Örneğin, biz geçiş bir fark bulmuyorum hücreleri C57BL/6J veya BALB/cJ bağış ile bir 1 saat boyunca C57BL/6J alıcılar ile kullanılır.
Bu vivo içinde yöntem göçmen yeteneği farklılıkları değerlendirmek için yararlı olur. Her ikisi de hücreleri giriş ve alıcı hayvanlar farmakolojik veya diğer tedirginlikler tabi olabilir. Benzer şekilde, alıcı hayvanlar bulaşıcı veya inflamatuar uyaranlara veya lenfosit kaçakçılığı12etkileyen diğer tedaviler gösterilebilir. Bu iletişim kuralı da transgenik fare satırlarına kolayca uygulanabilir. Özellikle, o floresan proteinler ifade etiketleme ihtiyacını önlemek ve çoğullama stratejileri artırmak.
Farklı hücre popülasyonlarının enjeksiyon önce karıştırılır zaman mümkün olduğu kadar azaltılmalıdır unutmamak gerekir. Sadece alıcı hayvanlar tam anestezi ve enjeksiyon için hazır olduktan sonra differentially etiketli hücre popülasyonlarının karışık. Akış Sitometresi tarafından analiz zaman ikisi arasında belirsiz ayrılık sonuçlanan farklı popülasyonlar mevcut boyalar karıştırabilirsiniz. Buna ek olarak, farklı tedavi koşulları bu dönemde tedavi edilmezse hücreleri etkileyebilir. Örneğin, hücre yüzeyine bağlamak ajanlar tedavi edilmezse hücrelere, böylece sonuçları semptomlarıdır devredilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa yoktur
Acknowledgments
Bu eser Bernard L. Schwartz Program tarafından Rockefeller Üniversitesi, Robertson terapötik geliştirme Fonu, Rockefeller Üniversitesi ve Sackler Merkezi'nde hekim bilim adamları için Biyomedikal ve beslenme araştırmaları için desteklenen Rockefeller Üniversitesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
- Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
- West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
- Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).
