Summary
Protokoller for kvantitativ vurdering av lymfocytt chemotaxis og migrasjon er viktige verktøy for immunologi forskning. Her, er en i vitro protokoll beskrevet at tillatelser sanntid, multiplekset evaluering av celle migrasjon og en utfyllende i vivo teknikk aktivere sporing av innfødte celler milten.
Abstract
Chemotaxis er overføring langs en bestemt kjemiske gradient1. Chemokines er chemotactic cytokiner som fremmer mobilnettet handel med anatomiske og tidsmessige spesifisitet2. Chemotaxis er en viktig funksjon av lymfocytter og andre immunceller som kan kvantitativt vurdert i vitro. Dette manuskriptet beskriver metoder som tillater evaluering av chemotaxis, både i vitro og i vivo, for ulike celletyper inkludert linjer og innfødt celler. Den i vitroplate-basert format tillater sammenligning av flere vilkår samtidig i sanntid, og kan fullføres innen 1-4 h. In vitro analysen forhold kan manipuleres til å introdusere agonister og antagonister, som samt skille chemotaxis fra chemokinesis, som er tilfeldig bevegelse. For i vivo menneskehandel vurderinger, kan immunceller være merket med flere fluorescerende fargestoffer og brukes for adopsjon overføring. Differensial merkingen av celler gir mikset-celle populasjoner introduseres inn i samme dyret, og dermed redusere variansen og redusere antall dyr kreves for et tilstrekkelig drevet eksperiment. Overføringen i lymfoidvev oppstår i så lite som 1 h og flere vev rom kan prøves. Flowcytometri etter vev harvest tillater en rask og kvantitativ analyse av den vandrende mønstre flere celletyper.
Introduction
Robust immunitet krever kompleks timelige og romlig samordning av en rekke celletyper for å besvare skade, infeksjon og generere self-tolerance. Flere dusin chemokine reseptorer og deres tilsvarende ligander har blitt oppdaget og preget gir molekylære mekanismer av hvilke bestemte celler kan rettes i en bestemt vev på et bestemt tidspunkt. Dermed er studere chemotaxis og overføring en uunnværlig del av immunologi forskning. Faktisk, beskrevet i vitro analysen ble sist brukt som en screening verktøyet for å identifisere chemotactic kofaktor som akselererer chemotaxis av T-celler mot C-C chemokines 19 og 213. Formålet med metodene som er beskrevet her er å tillate kvantitative vurderinger av immun celle chemotaxis i vitro og i vivo.
Boyden (celle migrasjon og invasjonen) kammer analysen er en billig, reproduserbare og rask metode for å vurdere celle migrasjon4,5. I standard analysen, den øvre kammeret er plantet med celler og er atskilt med en porøs sett fra en lavere kammer, der cellene overføre. Da ønskede, kan celler som har migrert til undersiden av sette fast og farget for kvantifisering av * lys. Men slike målinger begrense datainnsamling til en enkelt sluttpunktet, som utelukker dynamisk datainnsamling og kan kreve omfattende optimalisering å bestemme optimale tidspunktet for analyse. Her beskrives flere tilpasninger som tillater sanntid, kvantitative og multiplex målinger av chemotaxis i vitro.
I vivo studier, brukes en funksjonell sluttpunkt, nemlig bestemt akkumulering av celler i en gitt vev kupé. Forhåndsinnstilte merket donor cellene er introdusert i mottakerens dyr gjennom adopsjon overføring. Disse donor cellene kan senere identifiseres av flowcytometri etter mottaker vev innhøsting. Også presentert er en co merking strategi som tillater fastsetting av handel med ulike celletyper i en enkelt mottaker dyr. Denne metoden eliminerer Inter dyr variasjon fra celle injeksjon, og står for fysiologiske Inter dyr variasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle prosedyrer ble godkjent av Rockefeller University ' s institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. Alle dyrene ble plassert ved bestemte patogen uten betingelser.
1. I Vitro Chemotaxis
- kultur THP-1 celler 6 i Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic syre (HEPES, 25 mM) (komplett media), opprettholde tetthet mellom 0,5-1.0 x 10 6 celler/mL.
- i et 35 mm cellekultur parabol, etiketten 3,5 x 10 5 THP-1 celler per betingelse med calcein acetoxymethyl (calcein-AM, 2,5 µM) eller andre passende fluorescerende fargestoff i komplett medier på 37 ° C for 30 min.
Merk: Fargestoffer må cellemembranen-permeabel og kompatibel med live-celle merking. - Pre varme en plate leser til 37 ° C.
Merk: I tillegg til temperaturkontroll, bunn-lesing funksjonaliteten er også nødvendig. Se trinn 1.10.2 etter et alternativ til en plate leser for kvantifisering overføre celler. - Mens celler er merking, forberede analysen plate og nedre kammeret.
- Bruk en 24-og vev kultur plate, med én betingelse per brønn. Utføre hver betingelse i tre eksemplarer.
- Legge til 750 µL av Hank ' s Buffered Salt løsning (HBSS) buffered med 25 mM HEPES og 0,1% bovin serum albumin (BSA) til 24-vel plate. Dette fungerer som betingelsen basale kontroll.
- Andre brønner for komparator forhold, alltid å holde det totale volumet i bunnen kammeret på 750 µL.
Merk: I dette eksemplet menneskelige monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) fungerer som positive kontrollen for chemotaxis 7.- Sette reagens blandingen ved å kombinere HBSS med 25 mM HEPES, BSA (0,1%) og MCP-1 (75 ng/mL). Bruke voksen bovin serum (2,7% v / v) med MCP-1 som en mer positiv kontroll.
Merk: Chemokine og chemokine konsentrasjon vil avhenge chemotactic aksen under studien. Lyofilisert MCP-1 er resuspended i destillert vann med BSA (0,1%) gjøre en lagerløsning med en siste konsentrasjon av 50 μg/mL. Dette kan bli fortynnet i vann til en fungerende løsning 10 μg/ml. Legge til 5,6 μL av denne løsningen i nedre kammeret.
- Sette reagens blandingen ved å kombinere HBSS med 25 mM HEPES, BSA (0,1%) og MCP-1 (75 ng/mL). Bruke voksen bovin serum (2,7% v / v) med MCP-1 som en mer positiv kontroll.
- Andre brønner for komparator forhold, alltid å holde det totale volumet i bunnen kammeret på 750 µL.
- Etter sammensetningen av bunnen kammer er fullført, plassere en porøs setter i hver brønn, sikre at kategoriene av sette plasser innsnittene av tallerkenen.
Merk: Velge riktig porestørrelse for skivene. Monocytter og lymfocytter presterer en porestørrelse på 3 μm godt. Noen celletyper og/eller chemokine systemer krever en matrise-belagt overflate for optimal overføring. For eksempel for å måle THP-1 monocytt chemotaxis mot MCP-1, er fibronectin eller kollagen-belagt setter inn anbefalt. For plate leser for kvantifisering, sette må ha en lys-impermeant belegg, som polyetylentereftalat, å unngå deteksjon av ikke-migrering celler i øvre kammer 8.
- Etter rugende celler for 30 min med calcein-AM, overføre celle suspensjon slik konisk 15mL. Sentrifuger cellene på 1000 x g for 2 min. visuelt inspisere cellene for å bekrefte opptak av calcein-AM ( figur 1).
- Forsiktig fjerne nedbryting bruker et vakuum aspirator. Vask merket celler i serum-free RPMI 1640 supplert med HEPES 25 mM. Sentrifuge cellene på 1000 x g i 2 minutter og kast nedbryting.
- Resuspend celler i serum-free RPMI 1640 supplert med HEPES 25 mM. Telle celler og justere volumet slik at cellene er i en siste konsentrasjon av 1.0-1,5 x 10 6 celler/mL.
- Dispensere 250 μL celle suspensjon inn innsatsen (øvre kammer).
- Etter alle øverste kammer er fylt, forsiktig løfte platen og inspisere undersiden for tilstedeværelsen av luftbobler som kan forstyrre migrasjon og gjenkjenning. Hvis du vil fjerne en boble, først prøve å fjerne posisjonerer re innsatsen. Operasjon bruk en 27 G nål punktering boblen og deretter flytte innsatsen.
- Plasser platen i forvarmes 37 ° C plate leseren.
- Anskaffe fluorescens målinger fra bunnen i 1-3 min intervaller. Når du bruker calcein-AM, angir fluorescensen eksitasjon og utslipp bølgelengder på 485 nm og 520 nm, henholdsvis. Avhengig av celle type og chemokine systemet, chemotaxis oppstår vanligvis over 1-4 h ( figur 2A).
- Som et alternativ til kontinuerlig målinger ved hjelp av en plate-leser, bilde brønnene bruker en invertert fluorescerende mikroskopet ( figur 2B) eksitasjon og gjenkjenning av lys på 485 nm og 520 nm, henholdsvis. Bruk en lav forstørrelse for å ta mesteparten av undersiden av innsatsen. Kvantifisere celler av bildene med ImageJ eller lignende programvare 9.
2. Adopsjon overføring av Murine lymfocytter
- utarbeidelse av donor cellene
- Anesthetize 8-12 uke-gamle C57BL/6J mannlige donor mus med isoflurane anestesi (1-3%) bruker en vaporizer. Bekreft riktig dybde av anestesi ved toe-klype.
- Plasser musen i supine posisjon. Gjøre en midtlinjen snitt med en skalpell og Finn milten i øvre venstre peritoneal plass. Avgiftsdirektoratet hele milten og plasser i komplett medier (RPMI med 10% FBS og 25 mM HEPES, 1 mL/milt) på is. Euthanize bedøvet donor dyr ved halshogging.
- Slipe milt vev forsiktig gjennom 40 µm nylon maske til komplett medier (1 mL /spleen) vises ved slutten av en sprøytestempelet en enkeltcelle suspensjon og overføre slik 15 mL konisk.
- Legge til 4 mengder salmiakk kalium (ACK) lysis buffer og Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur å lysing av erytrocytter.
- Sentrifuge cellene på 1000 x g i 2 minutter ved romtemperatur og kast nedbryting. Hvis erytrocytter forblir i pellet, resuspend i ACK lyseringsbuffer, ruge i 5 minutter ved romtemperatur, sentrifuge cellene på 1000 x g i 2 minutter og forkaste nedbryting.
- Resuspend cellene i komplett medier i en konsentrasjon av 2-5 x 10 7 celler/mL, og sil celle suspensjon gjennom en 40 µm nylon maske fjerne celle rusk.
- Etikett 1 x 10 7 celler/mottaker mus med et fluorescerende fargestoff kompatibel med live celler og som beholdes på etterfølgende fiksering, for eksempel 5-chloromethylfluorescein diacetate (siste konsentrasjon 2 μM) 10 . Ruge på 37 ° C for 30 min.
Merk: For å spore mer enn én celle befolkningen, kan du bruke andre fluorescerende fargestoffer med ekstra celle populasjoner. For example, en del av donor cellene kan merkes med 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoyl) amino) tetramethylrhodamine (siste konsentrasjon 2 μM) 11. - Legge til 4 volumer HBSS supplert med 25 mM HEPES og sentrifuger 1000 x g for 2 min og Forkast nedbryting. Resuspend pellets i HBSS med HEPES 25 mM til en siste konsentrasjon av 1 x 10 8 celler/mL.
- Hvis bruker flere fluorescerende fargestoff, holde celle populasjoner skilt til umiddelbart før injeksjon.
- Overføre en liten aliquot (10 μL) celler av hver farge til en etappe, den stabiliserende løsning (1 mL) for påfølgende flyt cytometri kompensasjon.
- Overføring av lymfocytter
- bedøve 8-12 uke-gamle C57BL/6J mannlige mottaker mus med isoflurane (1-3%) bruker en vaporizer; kontrollere dybden av anestesi ved toe-klype. Veterinær salve gjelder dyr ' s øyne å hindre tørking.
- Kort vortex giver celler (1 s) og overføring til 1 mL injeksjon sprøyte med 27 G, 0,5 i p, kombinere ulikt merket celle populasjoner, hvis aktuelt.
- Overføre en liten aliquot (10 μL) blandede celler til en etappe, den stabiliserende løsning (1 mL) for påfølgende flyt cytometri analyser.
- Sett donor dyr i liggende stilling. Bruk milde caudal press på huden dorsal for øyet, forårsaker øyeeplet å stikke litt.
- Direkte nålen medialt og injisere 100 µL av donor celle suspensjon retro-orbitally i hver mottaker musen. Cellene kan også injiseres via hale venen.
- Gradvis trekke injeksjon nålen og Plasser musen alene i utvinning bur. Overvåke dyr før det har gjenvunnet bevissthet; en gang fullt gjenopprettede tilbake dyret til sosial boligbygging.
- Innsamling og analyse
- etter 1 h, bedøve mottaker mus med isoflurane anestesi (1-3%) bruker en vaporizer; kontrollere dybden av anestesi ved toe-klype. Høste milten (eller annet vev rundt) (trinn 2.1.2.) fra hver mottaker musen og sted i komplett medier (1 mL/mottaker). Euthanize bedøvet dyr ved halshogging.
Merk: Lengre intervaller før vev harvest vil øke vev akkumulering til minst 24 h. - Slipe milt vev forsiktig gjennom 40 µm nylon maske til komplett medier med slutten av en sprøytestempelet for å lage en enkeltcelle suspensjon og overføring til 15 mL konisk tube.
- Legge til 4 mengder ACK lysis buffer og ruge 5 min ved romtemperatur. Sentrifuge celle suspensjon 1000 x g i 2 minutter ved romtemperatur og kast nedbryting.
- Resuspend celler i flekker buffer (fosfat-bufret saline supplert med 1% FBS). Telle celler og justere til en siste konsentrasjon av 3 x 10 7 celler/mL. Overføre 100 µL av cellen suspensjon til en 96-brønns rundt bunnplaten.
- Flekk celler for ønskede markører (se tabell for materiale) for analyse av flowcytometri. Legg til fluorophore-konjugerte antistoffer (se tabell for materiale) mot ønskede markører og ruge på 4 ° C for 20 min i mørket. Legge til 100 µL flekker buffer, sentrifuge cellene på 1000 x g for 3 min og kast nedbryting.
- Resuspend pellet i 200 µL flekker buffer, sentrifuge cellene på 1000 x g for 3 min og kast nedbryting.
- Resuspend pellets i 125 µL flekker buffer og erverve prøver ved å bruke en flyt cytometer med standard prosedyrer.
Merk: Grønt fargestoff er opphisset av en 488 nm laser og utslipp registreres med 505 og 530/30 dichroic filtre. Oransje fargestoff er begeistret for en 561 nm og utslipp er oppdaget av et 582/15 dichroic filter.- Bruk lagret celler fra 2.1.8.2 å kompensere for hver fluorescerende fargestoff.
Merk: Bruker perle-baserte kompensasjon med fluorophores eksitasjon og utslipp spektra av merking fargestoffer vil resultere i suboptimal kompensasjon. - Bruke de lagrede innsettingscellene fra trinn 2.2.2.1 å nøyaktig bestemme forholdet mellom ulikt merket innsettingsceller hvis bruker flere merket befolkningen ( Figur 3). Beregne vev bestemt migrasjon basert på forholdet mellom merket til umerket celler ( Figur 4).
- Bruk lagret celler fra 2.1.8.2 å kompensere for hver fluorescerende fargestoff.
- etter 1 h, bedøve mottaker mus med isoflurane anestesi (1-3%) bruker en vaporizer; kontrollere dybden av anestesi ved toe-klype. Høste milten (eller annet vev rundt) (trinn 2.1.2.) fra hver mottaker musen og sted i komplett medier (1 mL/mottaker). Euthanize bedøvet dyr ved halshogging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når du bruker calcein-AM fargestoff, vil visuell inspeksjon av celler bekrefte merket uptake (figur 1). Automatisert fluorescerende målinger vil spore overføring som cellene transitt på undersiden av sette over tid. Disse dataene viser tydelig en induksjon av celle migrasjon mot MCP-1 og en styrking av dette svaret av serum (figur 2A). Avhengig av styrken vandrende stimulans, er det en forsinkelse på minst 15 minutter før en økning i signal. Fluorescerende signalet kan topp og deretter gradvis avta. Dette representerer en netto nedgang i antall celler følge undersiden av sette som celler i løsning i nedre kammeret frekvensen raskere enn cellene migrerer fra den øvre kammeret. Sterkere vandrende stimuli vanligvis føre en) tidligere utbruddet av en økning i fluorescens verdier. b) raskere veksten i fluorescens; og c) høyere peak fluorescens verdier. Representant bilder av invertert fluorescens mikroskopi vises også (figur 2B), med kvantifisering av celletall (figur 2C).
For i vivo studier utnytte flere fluorescerende etiketter, er det viktig å quantitate relative andel av celle populasjoner i input materiale. Dette står for avviket i blande celle populasjoner for injeksjon (Figur 3). I dette tilfellet var forholdet mellom grønn og oransje fluorescerende celler 0.97:1. Dermed kontoen for denne liten ubalanse, ble grønn-fluorescerende celletall delt av 0,97 å indeksere sine tall til input materialet. Etter kvantifisering merket celler av flowcytometri, kan menneskehandel kvantifiseres antall merkede celler igjen delt etter antall celler utvinnes.
Disse resultatene viser fordelen med to farger strategien, som eliminerer effekten av varierende injeksjon effekt; mens det er betydelig avvik gjenopprettede celler mellom dyr, for alle gitt dyr grønn-fluorescerende til oransje-fluorescerende celler er omtrent lik (Figur 4). Disse resultatene er ventet, som to celle populasjoner ble behandlet likt, men ulike forstyrrelser kan bli testet for deres effekt på lymfocytt homing. Avvik fra linjen av identitet indikerer ulike trekkfugler evner mellom de bestemt celle. I tillegg kan flere celle undergrupper bestemmes av flekker gjenopprettede celler for ønsket proteiner. T-celler, angitt av CD3 flekker, og B-celler, angitt av CD19 flekker gjenopprettes her, også med like andeler av grønn til oransje fluorescerende celler.
Figur 1: cellen merking. Visuell inspeksjon av cellen pellet etter merking bekrefter tilstrekkelig opptak av fluorescerende fargestoff (venstre), i motsetning til før merking (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kvantifisering av i vitro migrasjon. (A) representant data (gjennomsnittlig ± standardfeilen) i sanntid fra en plate leser sammenligne 3 forhold: media (kontroll), chemokine (MCP-1, 75 ng/mL) og chemokine med serum (MCP-1, 75 ng/mL og storfe serum, 2,7% v/v i buffer). Målinger ble kjøpt fra undersiden av platen hver 3 minutter med et eksitasjon bølgelengden til 485 nm og oppdagelsen bølgelengden til 520 nm. (B) representant micrographs på 4 X forstørrelse på undersiden av sette på 1t, som tillater direkte visualisering overføre celler. Skalere barer = 500 µm (gul). (C) kvantifisering av celle nummer per lavspent felt (LPF, 4 X) bruke ImageJ programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: farget innsettingsceller. Flow cytometri plot viser forholdet mellom to ulikt farget celle populasjoner i injisert celle inndataene fra trinn 2.2.2.1. Forholdet avhenger fra denne tomten serverer korrigere avvik introdusert under første blanding av de to populasjonene, og brukes til å justere celletall under nedstrøms dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: forholdet merket celleområde utvinnes fra spleens av mottakeren dyr. Andelen grønn-fluorescerende eller oransje-fluorescerende presenteres som en prosent av den totale gjenopprettede splenocytes, med hvert datapunkt som representerer en enkelt mottaker dyr. Totalen merket cellene er vist (trekant), samt delsettene også farget positivt på celle overflaten markører CD19 (firkantet) eller CD3 (sirkel). Stiplet linje er linjen identitet hvor forholdet mellom farger er lik 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantifisering av immun celle migrasjon kan oppnås ved hjelp av enkle og raske søk både i vitro og i vivo. Vi viser i vitro chemotaxis av menneskelig monocytter svar til et MCP-1 gradering og styrking av serum. I vivo, donor murine splenocytes var ulikt merket og etter adoptivforeldre overføring, gjenvunnet fra mottakeren dyr.
Bruke en plate leser har fordelen av prøvetaking flere tidspunkt (så ofte som hvert 30 s) og automatisere kvantifisering overføre cellene. Dette obviates behovet for å velge en enkelt tidspunkt for evaluering og unngå mer arbeidskrevende metoder for manuell telling av individuelle brønner. Videre er gir denne metoden mer dynamisk informasjon enn kan samles ved mikroskopi. Under analyse må den oppbevares i tankene som vil falle på Sett inn på bunnen kammer og ikke vil bidra til fluorescens intensiteten. Dermed vil antall celler på undersiden av innsatsen, som indikert av relativ fluorescens, være en funksjon av frekvensen av overføring og hastigheten som cellene faller innsatsen.
Større celler kan kreve et innstikk med større porer og 8 μm porøse setter er tilgjengelig. Mindre celler (inkludert innfødte lymfocytter) kan ikke være lys nok til å være pålitelig oppdaget av en fluorimeter og kan kreve evaluering av mikroskopi, spesielt for små endringer i chemotaxis. Noen celletyper kan passere raskt i nedre kammeret løsningen og ikke har en lang nok botid på innsatsen å bli oppdaget, noe som resulterer i en flat kurve. I dette tilfellet celler kan kvantifiseres av cytometri direkte fra nedre kammeret løsningen, eller en matrise-belagt setter kan brukes til å forlenge transittiden i tillegg til å bruke insert med mindre porer (f.eks 1 μm).
Kritisk til disse analyser er identifikasjonen av robust trekkfugler. Hvis i vitro studier, hvilken celle studerte må være i stand til å svare på en chemoattractant og nødvendige co-faktorer må vurderes. Optimalisering kan være nødvendig for cellen tetthet i det øvre kammeret. Generelt, en høyere tetthet vil føre til et sterkere signal, men dette må være balansert mot et høyere uspesifisert migrasjon signal. Hvor en rekke chemoattractant konsentrasjoner kan også identifisere en passende timelige vinduet for å fange migrasjon.
Denne metoden kan også tilpasses til å bruke flere farger. Dette vil tenkes redusere variasjon, samt øke antall betingelser som kan inkluderes i en enkelt analysen. Den primære vurderingen her er lysstyrken på fluorescerende fargestoffer. Calcein-AM er svært lyse og derfor lett oppdaget av både mikroskop og plate skjermleser programmer. Mens fargestoffer brukes for i vivo studier var ikke lett oppdaget av mikroskopi og produserte høy bakgrunn; Dette ville antagelig også utelukke nøyaktig plate leser gjenkjenning.
I vivo studier er helse donor cellene viktig å bevare deres vandrende funksjon. Avlingen av donor cellene bør gjøres som en del av ikke-overleve kirurgi, snarere enn å ofre donor dyr og deretter høste celler, noe som øker sannsynligheten for iskemi og celle død. Tiden mellom injeksjon og høsting er en viktig faktor for eksperimenter der ulike celle populasjoner brukes; divergens eller likheten mellom celle populasjoner endres over tid. Prosesseringstid etter innhøsting fra donor til injeksjon i mottakeren bør minimaliseres. Også er donor/mottaker kompatibilitet også kritisk. Menneskelige celler blir raskt forkastet av mus, om intra-arter allogene celler er godt tolerert i korte tidsperioder. For eksempel vi ikke finner en forskjell i å migrere celler med C57BL/6J eller BALB/cJ givere brukes med C57BL/6J mottakere over en periode på 1 time.
Denne i vivo -metoden er nyttig for å vurdere forskjeller i vandrende evne. Både input celler og mottaker dyr kan bli farmakologiske eller andre forstyrrelser. Tilsvarende kan mottaker dyr bli utsatt for smittsomme eller inflammatorisk stimuli eller andre behandlinger som påvirker lymfocytt menneskehandel12. Denne protokollen kan også lett brukes på transgene musen linjer. Spesielt de uttrykker fluorescerende proteiner ville obviate behovet for merking og kan forsterke multipleksing strategier.
Det er viktig å merke seg at tiden der ulike celle populasjoner er blandet før injeksjon skal reduseres så mye som mulig. Ulikt merket celle populasjoner skal blandes etter mottaker dyrene har vært fullt anesthetized og er klar for injeksjon. Fargestoffer i de ulike befolkningsgrupper kan blande, resulterer i uklart skille mellom to når analysert av flowcytometri. I tillegg kan forskjellsbehandling forhold påvirke ubehandlet cellene i denne perioden. For eksempel overføres agenter som binder seg til celleoverflaten til ubehandlet celler, og dermed confounding resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Bernard L. Schwartz programmet for lege forskere ved The Rockefeller University, Robertson terapeutiske utvikling fondet ved Rockefeller University, og Sackler Center for biomedisin og ernæring forskning på den Rockefeller University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
- Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
- West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
- Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).
