Summary
Protokolle für die quantitative Bewertung der Lymphozyten Chemotaxis und Migration sind wichtige Werkzeuge für die Immunologie Forschung. Hier wird eine in-vitro- Protokoll beschrieben, dass Genehmigungen in Echtzeit, Multiplex, Bewertung von Zellwanderung sowie eine ergänzende in Vivo Technik ermöglicht Tracking von native Zellen Milz.
Abstract
Chemotaxis ist die Migration auf eine spezifische chemische Gradienten1. Chemokine sind chemotaktische Zytokine, die Förderung der zellulären Menschenhandel mit anatomischen und zeitlichen Spezifität2. Chemotaxis ist eine kritische Funktion von Lymphozyten und anderen Immunzellen, die quantitativ bewertet in Vitro. Dieses Manuskript beschreibt Methoden, die die Beurteilung der Chemotaxis, erlauben sowohl in Vitro und in Vivo, für unterschiedliche Zelltypen, einschließlich Zell-Linien und native Zellen. Die in-vitro-, Platte-basiertes Format ermöglicht den Vergleich von mehreren Bedingungen gleichzeitig in Echtzeit und können innerhalb von 1-4 h. In Vitro Assay Bedingungen manipuliert werden, vorzustellen, Agonisten und Antagonisten, wie erfolgen sowie unterscheiden Sie Chemotaxis von Chemokinese, ist die zufällige Bewegung. Für in Vivo Menschenhandel Bewertungen können für Adoptiveltern übertragen Immunzellen mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markiert und verwendet werden. Die unterschiedliche Kennzeichnung von Zellen ermöglicht gemischte Zellpopulationen im selben Tier, dadurch abnehmende Varianz und Reduzierung der Anzahl der Tiere für ein angemessen angetriebene Experiment eingefügt werden soll. Migration in lymphatischen Gewebe tritt in weniger als 1 h, und mehrere Gewebe Fächer können Sie probieren. Durchflusszytometrie Gewebe Ernte folgt ermöglicht eine schnelle und quantitative Analyse der wandernden Muster aus mehreren Zelltypen.
Introduction
Robuste Immunität erfordert die komplexe zeitliche und räumliche Koordination einer Vielzahl von Zelltypen, um entsprechend reagieren auf eine Verletzung, Infektion und Selbsttoleranz erzeugen. Mehrere Dutzend Chemokin-Rezeptoren und ihrer entsprechenden Liganden wurden entdeckt und charakterisierte die molekulare Mechanismen durch den spezifischen Zellen können zu einem bestimmten Zeitpunkt in einem bestimmten Gewebe geleitet werden. Studium Chemotaxis und Migration ist somit ein unverzichtbarer Bestandteil der Immunologie Forschung. In der Tat wurde der beschriebenen in-vitro- Test vor kurzem als Screening-Instrument zur chemotaktische Cofaktor zu identifizieren, die Chemotaxis von T-Zellen in Richtung C-C Chemokine 19 und 213beschleunigt. Der Zweck der hier beschriebenen Methoden sind quantitative Bewertungen der Immunzelle Chemotaxis in Vitro und in Vivozu ermöglichen.
Die Boyden (Zelle Migration und Invasion) Kammer-Assay ist eine kostengünstige, reproduzierbare und schnelle Methode für die Bewertung der Zelle Migration4,5. In der standard-Assay die obere Kammer ist mit Zellen ausgesät, und ist durch eine poröse Einlage aus einem unteren Kammer, in die die Zellen Wandern getrennt. Zum gewünschten Zeitpunkt können Zellen, die an der Unterseite des Einsatzes migriert wurden behoben und gebeizt für Quantifizierung von Lichtmikroskopie. Jedoch solche Messungen Datenerhebung auf einer einzigen Endpunkt, der dynamische Datenerfassung schließt zu beschränken und können erfordern umfangreiche Optimierung den optimale Zeitpunkt für die Analyse zu bestimmen. Hier werden verschiedene Anpassungen beschrieben, die in Echtzeit, quantitative und Multiplex Messungen der Chemotaxis in Vitrozu ermöglichen.
Für in Vivo Studien ist ein funktionelle Endpunkt verwendet, nämlich die spezifischen Anhäufung von Zellen in einem bestimmten Gewebe-Fach. Bereits beschriftete Spenderzellen werden in Empfänger Tiere durch Adoptiveltern Transfer eingeführt. Diese Spenderzellen können anschließend durch Durchflusszytometrie nach Empfänger Gewebe Ernte identifiziert werden. Auch ist eine Co Kennzeichnung Strategie, die für die Bestimmung des Handels mit verschiedenen Zelltypen innerhalb einer einzigen Empfänger Tier erlaubt. Diese Methode beseitigt die Inter Tiere Variation aus Zelle Injektion und Konten für physiologische Variabilität zwischen Tier.
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Protocol
alle Verfahren wurden von der Rockefeller University angenommen ' s institutionelle Animal Care und Use Committee. Alle Tiere unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen untergebracht waren.
1. Chemotaxis In vitro-
- Kultur THP-1 Zellen 6 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 4-(2-Hydroxyethyl)-1- Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES; 25 mM) (komplett Media), Aufrechterhaltung der Dichte zwischen 0,5-1,0 x 10 6 Zellen/mL.
- In ein 35-mm-Zellkultur dish, Label 3,5 x 10 5 THP-1 Zellen pro Zustand mit Calcein Acetoxymethyl (Calcein-AM; 2,5 µM) oder anderen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff in komplette Medien bei 37 ° C für 30 min.
Hinweis: Farbstoffe müssen Zellmembran durchlässig und mit live-Zelle Kennzeichnung kompatibel sein. - Pre-warme Platte Leser, 37 ° c
Hinweis: Neben der Temperaturregelung ist unten-Lesung Funktionalität auch erforderlich. Siehe Schritt 1.10.2 nach einer Alternative zu einer Platte Leser für die Quantifizierung der Migration Zellen. - Während Zellen bezeichnen, Vorbereiten der Assay-Platte und Unterhaus.
- Verwendung einer 24-Well-Zellkultur-Platte, mit einer Bedingung pro Bohrloch. Führen Sie jede Bedingung in dreifacher Ausfertigung.
- Fügen Sie 750 µL Hank ' s Buffered Salzlösung (HBSS) gepuffert mit 25 mM HEPES und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA), die 24-Well-Platte. Dies dient als der basalen Kontrollbedingung.
- Andere Brunnen für Komparator Bedingungen, immer die Aufrechterhaltung der Gesamtmenge in der unteren Kammer bei 750 µL.
Hinweis: In diesem Beispiel dient menschliche Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) als Positivkontrolle für Chemotaxis- 7.- Montieren die Reagenz Mischung kombiniert HBSS mit 25 mM HEPES, BSA (0,1 %) und MCP-1 (75 ng/mL). Verwenden Sie Erwachsene bovine Serum (2,7 % V / V) mit MCP-1 als eine zusätzliche Positivkontrolle.
Hinweis: Chemokin und Chemokin-Konzentration hängt von der chemotaktische Achse unter Studie. Lyophilisierter MCP-1 ist in destilliertem Wasser mit BSA (0,1 %) zu einer Stammlösung mit einer Endkonzentration von 50 μg/mL Nukleinsäuretablette. Dies kann in Wasser, um eine funktionierende Lösung von 10 μg/mL verdünnt werden. Die untere Kammer 5,6 μL dieser Lösung hinzufügen.
- Montieren die Reagenz Mischung kombiniert HBSS mit 25 mM HEPES, BSA (0,1 %) und MCP-1 (75 ng/mL). Verwenden Sie Erwachsene bovine Serum (2,7 % V / V) mit MCP-1 als eine zusätzliche Positivkontrolle.
- Andere Brunnen für Komparator Bedingungen, immer die Aufrechterhaltung der Gesamtmenge in der unteren Kammer bei 750 µL.
- Nach der Besetzung der unteren Kammern abgeschlossen ist, legen Sie einen poröse Einsatz in jede Vertiefung, um sicherzustellen, dass die Registerkarten des Einsatzes mit den Kerben der Platte ausrichten.
Hinweis: Wählen Sie die geeignete Porengröße für die Einsätze. Für Monozyten und Lymphozyten schneidet gut ab eine Porengröße von 3 μm. Einige Zelltypen und/oder Chemokin-Systeme erfordern eine Matrix-beschichtete Oberfläche für optimale Migration. Zum Beispiel sind für die Messung von THP-1 Monocyte Chemotaxis in Richtung MCP-1, Fibronektin oder Kollagen beschichtet Einsätze empfohlen. Für Platte Leser für Quantifizierung, muss der Einsatz eine Licht-impermeant Beschichtung, wie Polyethylenterephthalat, zur Erkennung von nicht-Migration zu verhindern Zellen in der oberen Kammer 8.
- Nach Inkubation für 30 min mit Calcein-AM Zellen, Zellsuspension auf eine 15mL konische Rohr übertragen. Zentrifuge Zellen bei 1.000 x g für 2 min. Sichtprüfung Zellen zur Bestätigung der Aufnahme von Calcein-AM ( Abbildung 1).
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Vakuum-Sauger. Waschen Sie die markierte Zellen in serumfreien RPMI 1640 mit HEPES 25 mM ergänzt. Zellen bei 1.000 x g für 2 min Zentrifugieren und entsorgen des Überstands.
- Aufschwemmen Zellen in serumfreien RPMI 1640 mit HEPES 25 mM ergänzt. Zählen von Zellen und stellen Sie die Lautstärke so, dass die Zellen eine Endkonzentration von 1,0-1,5 x 10 6 Zellen/mL werden.
- Verzichten 250 μl Zellsuspension in die Einlage (Oberhaus).
- , Nachdem alle oberen Kammern gefüllt wurden, sanft heben Sie die Platte und inspizieren die Unterseite für das Vorhandensein von Luftblasen, die Migration und Erkennung stören können. Um eine Blase zu entfernen, versuchen Sie zunächst entfernen, dann Re-Positionierung des Einsatzes. Wenn erfolglos, verwenden Sie eine 27 G Nadel zu punktieren die Blase und dann den Einsatz neu zu positionieren.
- Legen Sie die Platte in den vorgewärmten 37 ° C Platte Leser.
- Acquire Fluoreszenz Lesungen von unten in 1-3 min Abständen. Bei der Verwendung von Calcein-AM festgesetzt der Fluoreszenz Emission und Erregung Wellenlängen 485 nm und 520 nm, beziehungsweise. Je nach Zelle Art und Chemokin Chemotaxis tritt in der Regel über 1-4 h ( Abbildung 2A).
- Als Alternative zur kontinuierlichen Messungen mit einem Teller-Reader, Bild der Brunnen mit einem inversen fluoreszierende Mikroskop ( Abb. 2 b) in der Lage, der Erregung und Detektion von Licht bei 485 nm und 520 nm, beziehungsweise. Verwenden einer niedrigen Vergrößerung, um die Mehrheit an der Unterseite des Einsatzes zu erfassen. Quantifizieren der Zellen durch die Verarbeitung der Bilder mit ImageJ oder ähnliche Software 9.
2. Adoptiveltern übertragen der murinen Lymphozyten
- Vorbereitung der Spenderzellen
- Anesthetize 8-12 Woche-alten C57BL/6J männliche Spender Mäuse mit Isofluran-Narkose (1-3 %) Verwendung eines Verdampfers. Angemessene Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in die Rückenlage. Machen Sie eine Mittellinie Inzision mit einem Skalpell und suchen Sie die Milz in der oberen linken peritonealen Raum. Verbrauchssteuern Sie die ganze Milz und in komplette Medien (RPMI ergänzt mit 10 % FBS und 25 mM HEPES; 1 mL/Milz) auf Eis. Narkotisierten Spendertiere durch Enthauptung einschläfern.
- Mahlen Milz Gewebe sanft durch 40 µm-Nylon-Netzgewebe in komplette Medien (1 mL /spleen) mit dem Ende des einen Spritzenkolben eine 15 mL konische Rohr eine einzellige Federung und Transfer vorzunehmen.
- Fügen Sie 4 Bände von Ammoniumchlorid Kalium (ACK) Lyse Puffern und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur, Erythrozyten zu lysieren.
- Der Zellen bei 1.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur Zentrifugieren und überstand verwerfen. Wenn Erythrozyten im Pellet bleiben, Aufschwemmen im ACK Lyse Puffer, 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, Zentrifugieren Zellen bei 1.000 x g für 2 min und überstand verwerfen.
- Aufschwemmen der Zellen in komplette Medien in einer Konzentration von 2-5 x 10 7 Zellen/mL, dann abgießen die Zellsuspension durch eine 40 µm-Nylon-Netzgewebe, Zelle Ablagerungen zu entfernen.
- Etikett 1 x 10 7 Zellen/Empfänger Maus mit einem Fluoreszenzfarbstoff kompatibel mit Leben Zellen und bei der anschließenden Fixierung, wie z. B. 5-Chloromethylfluorescein Diacetat (Endkonzentration 2 μM) 10 einbehalten . Inkubation bei 37 ° C für 30 min.
Hinweis: Um mehr als eine Zellenbevölkerung zu verfolgen, verwenden Sie andere Fluoreszenzfarbstoffe mit zusätzlichen Zellpopulationen. Zum Beispiel kann ein Teil der Spenderzellen mit 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) Benzoyl gelabelt) amino) Tetramethylrhodamine (Endkonzentration 2 μM) 11. - Fügen Sie 4 Bände mit HBSS ergänzt 25 mM HEPES, dann Zentrifuge bei 1.000 x g für 2 min und überstand verwerfen. Aufschwemmen Sie Pellet in HBSS ergänzt mit HEPES 25 mM, eine Endkonzentration von 1 x 10 8 Zellen/mL.
- Wenn mehr als ein Fluoreszenzfarbstoff zu verwenden, halten Sie Zell-Populationen bis unmittelbar vor der Injektion getrennt.
- Eine kleine aliquoten (10 μl) der Zellen von jeder Farbe auf eine Fixativ Lösung (1 mL) für spätere Flow Cytometry Entschädigung übertragen.
- Übertragung von Lymphozyten
- 8-12 Wochen zu betäuben-alte C57BL/6J männliche Empfänger Mäuse mit Isofluran (1-3 %) Verwendung eines Verdampfers; Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen. Tier Tierarzt Salbe zuweisen ' s Augen austrocknen zu verhindern.
- Kurz Wirbel Spenderzellen (1 s) und Transfer zum 1 mL Injektionsspritze mit 27 G, 0,5 in Nadel, differentiell beschrifteten Zellpopulationen zu kombinieren, wenn anwendbar.
- Eine kleine aliquoten (10 μl) gemischte Zellen auf einem Fixativ Lösung (1 mL) für spätere Flow Cytometry Analysen übertragen.
- Spendertiere in Bauchlage zu platzieren. Milde kaudalen Druck auf die Haut dorsalen für das Auge, verursacht den Augapfel leicht hervorstehen.
- Direkt die Nadel medial und 100 µL Zellsuspension Spender Retro-Orbital in jeder Empfänger Maus injizieren. Zellen können auch über die Rute Vene injiziert werden.
- Allmählich zurückziehen die Injektionsnadel und Maus allein in einem Recovery-Käfig. Tier zu überwachen, bis er das Bewusstsein wiedererlangt hat; einmal vollständig wiederhergestellten Rückkehr des Tieres zu Sozialwohnungen.
- Sammlung und Analyse
- nach 1 h, Empfänger Mäuse mit Isofluran-Narkose (1-3 %) mit einem Vaporizer zu betäuben, Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen. Die Milz (oder anderes Gewebe von Interesse) zu ernten (Schritt 2.1.2.) von jedem Empfänger Maus und Ort in die komplette Medien (1 mL/Empfänger). Narkotisierten Tieren durch Enthauptung einschläfern.
Hinweis: Längere Intervalle vor der Ernte Gewebe erhöht Gewebe Akkumulation durch mindestens 24 Std. - Mahlen Milz Gewebe sanft durch 40 µm-Nylon-Netzgewebe in komplette Medien mit dem Ende des einen Spritzenkolben 15 mL konische Rohr eine einzellige Federung und Transfer vorzunehmen.
- Fügen Sie 4 Bände der ACK Lyse Puffer und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren die Zellsuspension bei 1.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur und überstand verwerfen.
- Aufschwemmen Zellen in der Färbung Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ergänzt mit 1 % FBS). Zellen zu zählen und auf eine Endkonzentration von 3 x 10 7 Zellen/mL einstellen. 100 µL Zellsuspension auf einer 96-Well Runde Bodenplatte übertragen.
- Fleck Zellen für gewünschte Markern (siehe Tabelle Material) für die Analyse von Durchflusszytometrie. Fluorophor-konjugierten Antikörpern (siehe die Tabelle Materialien) gegen die gewünschten Markierungen hinzufügen und bei 4 ° C für 20 Minuten im Dunkeln inkubieren. Hinzufügen von 100 µL Puffer Färbung, Zellen bei 1.000 x g für 3 min Zentrifugieren und entsorgen des Überstands.
- Aufschwemmen das Pellet in 200 µL Puffer Färbung, Zellen bei 1.000 x g für 3 min Zentrifugieren und entsorgen des Überstands.
- Das Pellet in 125 µL Färbung Aufschwemmen Puffern und Proben mit einem Durchflusszytometer mit Standardverfahren zu erwerben.
Hinweis: Der grüne Farbstoff ist begeistert von einem 488 nm Laser und die Emission mit 505 und 530/30 dichroitische Filter erkannt wird. Die orange Farbe ist begeistert durch eine 561 nm und die Emission von 582/15 dichroitische Filter erfasst wird.- Verwendung gespeichert Zellen aus 2.1.8.2 Ausgleich für jede Fluoreszenzfarbstoff.
Hinweis: Mit Wulst-Vergütung mit Fluorophore passend zur Erregung und Emissionsspektren der Kennzeichnung Farbstoffe in suboptimalen Entschädigung führen wird. - Verwenden die gespeicherten Eingabezellen aus Schritt 2.2.2.1 genau zu bestimmen, das Verhältnis von differentiell Eingabezellen beschriftet, wenn mehr als eine beschriftete Bevölkerung ( Abbildung 3). Berechnen Gewebe spezifische Migration basierend auf dem Verhältnis von beschriftet, unbeschriftete Zellen ( Abbildung 4).
- Verwendung gespeichert Zellen aus 2.1.8.2 Ausgleich für jede Fluoreszenzfarbstoff.
- nach 1 h, Empfänger Mäuse mit Isofluran-Narkose (1-3 %) mit einem Vaporizer zu betäuben, Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen. Die Milz (oder anderes Gewebe von Interesse) zu ernten (Schritt 2.1.2.) von jedem Empfänger Maus und Ort in die komplette Medien (1 mL/Empfänger). Narkotisierten Tieren durch Enthauptung einschläfern.
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Representative Results
Bei der Verwendung von Calcein-AM Farbstoff bestätigen Sichtprüfung der Zellen Label Aufnahme (Abbildung 1). Automatisierte fluoreszierende Lesungen werden Migration als Zellen Transit auf der Unterseite des Einsatzes im Laufe der Zeit verfolgen. Diese Daten zeigen eindeutig eine Induktion der Zellwanderung in Richtung MCP-1 sowie eine Aufwertung dieser Reaktion durch Serum (Abbildung 2A). Je nach Stärke des wandernden Stimulus, gibt es eine Verzögerung von mindestens 15 min vor der Zunahme von Signal. Das Fluoreszenzsignal kann ihren Höhepunkt erreichen und dann langsam zurückgehen. Dies entspricht einem Netto Rückgang in der Anzahl der Zellen, die an der Unterseite des Einsatzes wie Zellen in die Lösung in die untere Kammer mit einer Rate schneller als die der Zellen, die Migration von der oberen Kammer übergehen. Stärkere wandernden Reize führen in der Regel eine) früherer Beginn von einem Anstieg der Fluoreszenz-Werte; (b) schneller Anstieg der Fluoreszenz; und c) höhere Spitzenwerte Fluoreszenz. Repräsentative Bilder von invertierten Fluoreszenzmikroskopie erworben werden (Abb. 2 b), auch mit Quantifizierung der Zellzahlen (Abbildung 2) angezeigt.
Für in Vivo Studien nutzen mehr als eine fluoreszierende Label ist es wichtig, den relativen Anteil der Zell-Populationen in das Inputmaterial quantitate. Diese Konten für die Varianz in mischenden Zellpopulationen Injektionslösung (Abbildung 3). In diesem Fall war das Verhältnis von Grün und Orange fluoreszierend Zellen 0.97:1. So wurden um diese leichte Unwucht berücksichtigen, grün-fluoreszierende Zellenzahlen von 0,97, ihre Zahl im Verhältnis zu den input-Material zu indizieren unterteilt. Nach der Quantifizierung der markierter Zellen durch Durchflusszytometrie, kann Drogenhandel quantifiziert werden wie die Anzahl der markierten Zellen erholt durch die Gesamtzahl der Zellen wiederhergestellt geteilt.
Diese Ergebnisse zeigen den Vorteil der Verwendung der zweifarbige-Strategie, die die Wirkung der unterschiedlichen Injektion Wirksamkeit beseitigt; Zwar gibt es erhebliche Unterschiede der wiederhergestellten Zellen zwischen Tieren, für jede gegebene Tier ist das Verhältnis von grün-fluoreszierende, Orange fluoreszierend Zellen etwa gleich (Abbildung 4). Diese Ergebnisse werden erwartet, wie die zwei Zelle Bevölkerungen identisch behandelt wurden, aber verschiedene Störungen können für ihre Wirkung auf Lymphozyten Homing getestet werden. Abweichung von der Linie der Identität würde unterschiedliche wandernden Fähigkeiten die spezifische Zellpopulationen hinweisen. Darüber hinaus können mehrere Zelle Teilmengen durch Färbung der wiederhergestellten Zellen für die gewünschten Proteine bestimmt werden. Hier werden T-Zellen, angezeigt durch CD3 Färbung, und B-Zellen, angezeigt durch CD19 Färbung auch mit gleichen Anteilen von Grün zu Orange fluoreszierend Zellen wiederhergestellt.
Abbildung 1: Zelle beschriften. Sichtprüfung des Pellet-Zelle nach Kennzeichnung bestätigt ausreichende Aufnahme von der Fluoreszenzfarbstoff (links), im Gegensatz zu vor der Kennzeichnung (rechts). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Quantifizierung der in-vitro- Migration. (A) repräsentative Daten (Mittelwert ± Standardfehler) erwarb in Echtzeit von einem Teller Leser vergleichen 3 Bedingungen: Medien (Kontrolle), Chemokin (MCP-1, 75 ng/mL) oder Chemokin mit Serum (MCP-1, 75 ng/mL und Bovine Serum, 2,7 % V/V im Puffer). Lesungen wurden erworben von der Unterseite der Platte alle 3 min mit einer Erregung Wellenlänge von 485 nm und Detektion Wellenlänge von 520 nm. (B) repräsentative Mikrographen bei 4 X Vergrößerung von der Unterseite des Einsatzes um 1 Uhr, die direkten Visualisierung der Migration ermöglicht Zellen. Skalieren von Balken = 500 µm (gelb). (C) Quantifizierung der Zellzahl pro Niedrigstrom-Feld (LPF; 4 X) mit ImageJ-Software. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: gebeizt Eingabezellen. Flow Cytometry Plot zeigt das Verhältnis der beiden differentiell gebeizt Zellpopulationen in der injizierten Zelle Eingabe von Schritt 2.2.2.1. Das Verhältnis aus dieser Handlung bestimmt dient zur Varianz eingeführt, bei der ersten Mischung der beiden Populationen zu korrigieren und dient zum Einstellen der Zellzahlen während der nachgeschalteten Datenanalyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Verhältnis von markierten Zellen von Milz Empfänger Tiere erholt. Die Proportionen des grün-fluoreszierende oder Orange fluoreszierend Zellen werden als Prozentsatz der gesamten wiederhergestellten Splenocyten mit einzelnen Datenpunkte repräsentieren ein Empfängers Tier vorgestellt. Die Summe mit der Bezeichnung Zellen werden gezeigt (Dreieck), sowie die Teilmengen, die auch für die Zelle Oberfläche Marker CD19 (Quadrat) oder CD3 positiven gebeizt (Kreis). Gestrichelte Linie ist die Linie der Identität, wo ist das Verhältnis zwischen Farben gleich 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Quantifizierung der Immunzelle Migration kann erreicht werden, mit einfachen und schnellen Tests in Vitro und in Vivo. Wir zeigen die in Vitro Chemotaxis von menschlichen Monozyten als Reaktion auf eine MCP-1 Steigung und Vermehrung von Serum. In Vivo, Spender murinen Splenocyten waren differentiell beschriftet und anschließend Adoptiveltern waren Empfänger Tiere erholt.
Mit einem Teller-Reader hat den Vorteil, mehrere Zeit Probenahmestellen (so oft wie alle 30 s) und Automatisierung der Quantifizierung der Migration-Zellen. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, einen einzigen Zeitpunkt zur Bewertung und Vermeidung von arbeitsintensiven Methoden der manuellen Zählung der einzelnen Vertiefungen zu wählen. Darüber hinaus bietet diese Methode mehr dynamischen Informationen als Mikroskopie erfasst werden können. Während der Analyse muss es im Verstand gehalten werden, die Zellen werden die Einlage in die untere Kammer abfallen, und trägt nicht zur Fluoreszenzintensität. Die Anzahl der Zellen an der Unterseite des Einsatzes, wird wie durch relative Fluoreszenz, also eine Funktion der Rate der Migration und der durch die Zellen von den Einsatz fallen.
Größere Zellen erfordern ein Insert mit größeren Poren und 8 µm poröse Einsätze stehen zur Verfügung. Kleinere Zellen (einschließlich native Lymphozyten) möglicherweise nicht hell genug, um von einem Fluorimeter zuverlässig erkannt werden und erfordern Bewertung von Mikroskopie, insbesondere für kleine Änderungen in Chemotaxis. Einige Zelltypen können schnell passieren, in die untere Kammer-Lösung und nicht haben eine lange Verweilzeit auf dem Einsatz erkannt werden, wodurch eine abgeflachte Kurve. In diesem Fall Zellen durch Zytometrie direkt aus der unteren Kammer Lösung quantifiziert werden können, oder ein Matrix-beschichtete einfügen kann zur Laufzeit zusätzlich zur Verwendung eines Einsatzes mit kleineren Poren (z. B. 1 μm) zu verlängern.
Entscheidend für diese Tests ist die Identifizierung von robusten wandernden Bedingungen. Für in-vitro- Studien studierte Zelltyp muss auf eine Lockstoffgradient reagieren und notwendige Co-Faktoren berücksichtigt werden. Optimierung sein für Zelldichte eingeführt in der oberen Kammer erforderlich. In der Regel eine höhere Dichte führt ein stärkeres Signal, aber dies muss abgewogen werden gegen eine höhere unspezifische Migration-Signal. Testen eine Reihe von Lockstoffgradient Konzentrationen kann auch helfen, eine geeignete zeitliche Fenster zur Erfassung von Migration zu identifizieren.
Diese Methode könnte auch mit mehreren Farben angepasst werden. Dies würde unter Umständen reduzieren Variabilität sowie die Erhöhung der Anzahl der Bedingungen, die in einer einzigen Probe aufgenommen werden können. Hier der wichtigste Aspekt ist die Helligkeit der Fluoreszenz-Farbstoffen. Calcein-AM ist sehr hell und daher leicht von Mikroskop und Platte Leser Anwendungen erkannt. Während die Farbstoffe für verwendet in Vivo Studien wurden nicht ohne weiteres von Mikroskopie erkannt und produziert hohe Hintergrund; vermutlich würde dies auch genaue Platte Leser Erkennung ausschließen.
Für in-Vivo -Studien ist die Gesundheit der Spenderzellen wichtig, ihre wandernden Funktion zu bewahren. Die Ernte der Spenderzellen erfolgt im Rahmen des Operation nicht überleben, anstatt Spendertieres zu Opfern und dann ernten Zellen, das erhöht die Wahrscheinlichkeit von Ischämie und Zelle Tod. Die Zeit zwischen Injektion und Ernte ist ein wichtiger Aspekt für Experimente, in denen unterschiedliche Zellpopulationen verwendet werden; die Divergenz oder Ähnlichkeit zwischen Zellpopulationen können im Laufe der Zeit ändern. Bearbeitungszeit nach der Ernte vom Spender bis Injektion in den Empfänger minimiert werden sollte. Spender/Empfänger-Kompatibilität ist auch kritisch. Menschliche Zellen werden schnell durch Mäuse, zurückgewiesen, obwohl innerhalb derselben Art allogenen Zellen über kurze Zeiträume gut verträglich sind. Zum Beispiel finden wir keinen Unterschied bei der Migration Zellen mit C57BL/6J oder BALB/cJ Spender mit C57BL/6J Empfänger über einen Zeitraum von 1 h verwendet werden.
Diese in-Vivo -Methode eignet sich für die Beurteilung der Unterschiede in der wandernden Fähigkeit. Beide Zellen eingeben und Empfänger Tiere können pharmakologische oder anderen Störungen unterliegen. In ähnlicher Weise können Empfänger Tiere ausgesetzt werden infektiöse oder entzündliche Reize oder andere Behandlungen, die Lymphozyten des Drogenhandels12beeinflussen. Dieses Protokoll kann auch ohne weiteres auf transgene Mauslinien angewendet werden. Insbesondere diejenigen ausdrücken fluoreszierende Proteine würde vermeiden die Notwendigkeit für die Kennzeichnung und multiplexing Strategien potenzieren konnte.
Es ist wichtig zu beachten, dass die Zeit, in der unterschiedliche Zellpopulationen vor der Injektion gemischt werden, so weit wie möglich reduziert werden sollte. Differentiell beschrifteten Zellpopulationen sollten gemischt werden, erst nachdem die Empfänger Tiere vollständig betäubt haben und sind bereit für die Injektion. Die Farbstoffe vorhanden in den verschiedenen Populationen können mischen, wodurch unklar Trennung zwischen den beiden, wenn von Durchflusszytometrie analysiert. Darüber hinaus können unterschiedliche Behandlungsbedingungen während dieser Zeit der unbehandelten Zellen beeinflussen. Zum Beispiel können Agenten, die an der Zelloberfläche binden zu den unbehandelten Zellen übertragen werden, so verwirrende Ergebnisse.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Bernard L. Schwartz Programm für Arzt-Wissenschaftler an der Rockefeller University, des therapeutischen Entwicklungsfonds Robertson an der Rockefeller University und die Sackler Center für Biomedizin und Ernährungsforschung an unterstützt die Rockefeller Universität.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
- Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
- West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
- Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).
