α-테스트 : 전체 타액을 사용하여 빠른 셀 프리 CD4의 열거

자원 제한 지역에서 HIV 질환을 모니터링하기 위해 저렴한 CD4 수치 측정법이 절실히 필요합니다. 본 영상에서는 타액 내 단백질 분해 효소 억제제인 Alpha one PI의 존재 여부를 기반으로 CD4 수치를 결정하는 저비용 현장 진단 스크리닝 테스트를 시연합니다. 이를 위해, 먼저 피험자 또는 환자에게 레몬 캔디를 제공하여 타액으로 장액이 분비되도록 유도합니다.

타액을 검체 컵에 수집하여 96웰 분석 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 포화량의 단백질 분해 효소인 porcine pancreatic elastase를 타액에 첨가하여 alpha one pi와 결합 및 억제하도록 합니다. 이어서 비색 elastase 기질을 첨가합니다.

결합되지 않고 남은 엘라스테이스(elastase)가 기질을 분해하여 투명한 색에서 노란색으로 변색됩니다. 웰에 쿠마시 블루(Kumasi blue)를 첨가하여 총 단백질을 염색하고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 비색 측정을 수행합니다. 최종적으로, 총 단백질 대비 alpha one PI의 비율을 결정하고 이를 인덱스 값에 기반하여 CD four 수치를 정확하게 평가하는 데 사용합니다.

이 기술은 기존 방법인 유세포 분석법(flow cytometry)에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 이 분석법은 혈액 채취라는 외상성 및 고비용 과정 없이 현장에서 수행할 수 있으며, 고가의 단클론 항체를 사용할 필요가 없고, 전문적인 기술 교육이나 냉장 보관 및 검체 운송이 필요하지 않습니다. 이 방법은 AIDS 중재의 결정적인 장벽을 극복하며, 환자의 비용 및 건강 결과, 그리고 HIV 전염 빈도에 큰 영향을 미칠 것이며, 이 모든 요소는 세계 경제에 중대한 영향을 줍니다.

이 방법은 Alpha와 PI가 부착 및 이동을 통해 CD4 T 세포 수를 어떻게 조절하는지에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 다른 단백질 억제제가 다른 세포 유형의 부착 및 세포 이동을 어떻게 조절하는지 등 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 저희는 HIV 감염 환자에게서 Alpha 1 PI 수치가 매우 낮아 실제 혈액으로 유입되는 CD4 T 세포 수가 제한된다는 점을 발견했을 때 처음으로 이 방법 아이디어를 얻었습니다. 사용할 각 마이크로플레이트에 필요한 작업 용액을 준비하여 프로토콜을 시작하십시오.

pH 7.8의 0.05 M tris buffered saline(TBS) 60 mL를 준비합니다. 또한, 각 마이크로플레이트당 porcine pancreatic elastase type one(PPE) 6 mL를 준비합니다. PPE 현탁액을 잘 흔든 다음, TBS로 희석하여 농도가 약 0.01 units/mL가 되도록 합니다.

다음으로, DMSO에서 0.1 M 농도의 발색 기질 SA 3NA 스톡 용액을 준비합니다. 이 스톡 용액은 즉시 사용하거나, 즉시 사용하지 않을 경우 -20 °C에서 보관해야 합니다. TBS로 100배 희석하여 각 마이크로플레이트당 6 mL의 작동 용액을 준비합니다. 마지막으로, TBS로 10% Coomassie Brilliant Blue R-250 스톡 용액을 준비하여 즉시 사용하거나, 즉시 사용하지 않을 경우 -20 °C에서 보관합니다.

스톡 용액을 TBS로 1,000배 희석하여 각 마이크로플레이트당 6 mL씩 준비합니다. 타액을 취급할 때는 피험자 또는 환자가 선 자세에서 장갑과 실험복을 착용하는 등 적절한 주의 사항을 준수하는 것이 중요합니다. 혈청 삼출을 자극하기 위해 입안에 SGO를 배치합니다.

본 시연에서 HIV 환자의 역할은 연구 보조원이 수행하고 있습니다. 무설탕 레몬 드롭 캔디는 치아가 없거나 껌을 씹을 수 없는 HIV 환자에게 유용합니다. 처음 3분 동안은 필요에 따라 삼키며 입안에 머금고, 이후 3분 동안은 구강 전체의 타액을 검체 컵에 수집하십시오. 이렇게 하면 약 2 mL의 타액을 얻을 수 있습니다.

타액을 즉시 사용하지 않을 경우, 처리 당일에 분주하여 -80 °C에서 보관하십시오. 검체는 37 °C에서 해동합니다. 해동된 타액은 2~4 °C에서 최대 3일 동안 보관할 수 있습니다. 분석 설정을 위해 각 시료와 대조군을 96-well 평저 플레이트에 3회 반복 분주하며, 각 시료 well과 대조군 well에 130 µL의 TBS를 넣습니다.

그 후, 점성이 있고 혈청 삼출물이 포함되지 않은 뮤신을 피하여, 각 3개의 테스트 웰과 3개의 음성 대조군 웰에 타액 20 µL씩을 옮깁니다. 그런 다음 양성 대조군 웰에 TBS 20 µL를 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다.

이 단계에서는 타액을 피펫팅할 때 기포가 생기도록 볼텍싱하는 것을 피하고, 고체 입자와 점액질이 피펫팅되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 다음으로, 양성 대조군 췌장 엘라스타제(pancreatic elastase) 또는 PPE 작업 용액을 잘 흔들어 섞은 후, 샘플 및 양성 대조군 웰과 음성 대조군 웰에 50 µL씩 첨가합니다.

TBS 50 µL를 첨가합니다. 첨가된 부피가 충분하여 타액 혼합물에 고르게 분포되므로 별도로 섞을 필요는 없습니다. 플레이트를 상온에서 10분 동안 배양합니다.

배양 후, 각 웰에 50 µL의 elastase substrate SA three NA 작동 용액을 첨가합니다. 그런 다음 23 °C에서 45분 동안 추가로 배양합니다. 45분이 지나면, 각 웰에 50 µL의 Kumasi blue 작동 용액을 첨가합니다.

그 다음, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서 SA-III-NA 절단을 검출하고, 총 단백질 함량을 나타내는 595 nm에서 쿠마시 블루(kumasi blue)의 흡광도를 측정합니다. alpha 1 PI 지수를 계산하려면, 먼저 다음 공식에 따라 각 파장의 정규화된 흡광도를 구합니다. 이는 검체 평균과 음성 대조군 평균의 차이를 양성 대조군 평균과 음성 대조군 평균의 차이로 나누어 계산합니다. 그 후, 여기에 표시된 바와 같이 405 nm에서의 정규화된 흡광도를 595 nm에서의 정규화된 흡광도로 나누어 alpha 1 PI 지수를 산출하며, 이를 통해 alpha 테스트가 자원이 제한된 풍토병 지역에서 CD4 수치를 모니터링하기 위한 현장 진단(point of care) 스크리닝 검사로 사용하기에 적합한지 판단합니다.

카메룬의 클리닉에서 정기 진료를 받는 여성 20명과 남성 11명의 HIV 1 감염자로부터 자극 타액을 수집하였습니다. 이는 뉴욕시에서 수집한 타액을 이용한 알파 테스트 개발 당시의 예비 관찰 결과와 일치하며, 카메룬에서 수집한 타액의 alpha one PI 지수는 CD four 수치와 R squared 값 0.91, P 값 0.0001 미만으로 상관관계를 보였습니다. 이 관계는 용량 반응 관계와 일치하는 3매개변수 시그모이드 곡선으로 정의되었습니다. 95% 신뢰 구간과 예측 구간은 각각 파란색과 빨간색 선으로 표시되었습니다.

이전 연구에서, 우리는 HIV 1 감염자와 유전성 alpha one PI 결핍증(PIZZ) 환자에게서 CD four 양성 T 세포가 23 ± 3.5일의 주기로 사인파 형태의 순환을 보인다는 것을 확인했습니다. 여기에 제시된 것은 27일 주기를 보이는 비 HIV 건강 대조군에서 CD four 순환의 컴퓨터 생성 사인 곡선 분석의 대표적인 예시입니다. 6명의 피험자를 대상으로 CD four 양성 T 세포의 변화에 대해 컴퓨터 생성 사인 곡선 분석을 수행한 결과, 예상대로 피크 간 진폭(peak-to-peak amplitude)과 진동 축(axis of oscillation) 값이 산출되었습니다. 진동 축은 진폭과 상관관계가 있었으며, R-squared 값은 0.96, p 값은 0.009였습니다.

CD4 양성 T-세포 수가 적은 환자의 경우 CD4 T-세포 수의 주기적 변화가 작았으며, CD4 양성 T-세포 수가 많은 환자의 경우 주기적 변화가 컸습니다. 이는 여기에 표시된 회귀선이 진동축을 추정하며, 진동축이 진폭과 상관관계가 있기 때문입니다. 회귀선에 대해 진폭을 계산하여, 주기적 변동으로 인해 CD4 양성 T-세포가 회귀선 상하로 어느 정도 변동할 것으로 예상되는지 추정할 수 있습니다. 계산된 진폭과 신뢰 구간을 겹쳐 보았을 때, 녹색선으로 표시된 진폭이 청색선으로 표시된 95% 신뢰 구간 내에 있음이 확인되었습니다.

이 기술에 숙달되면 타액 수집부터 환자에게 CD4 세포 수치를 제공하기까지 90분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 CD4 수치를 모니터링하기 위한 선별 검사로 사용하도록 고안되었습니다. 환자의 CD4 수치에 큰 변화가 나타나는 경우, CD4 수치 측정값이 유효한지 확인하고 치료 결정을 돕기 위해 유세포 분석법(flow cytometry)을 통해 추적 관찰을 실시해야 합니다.

다음 개발 단계에서는 마이크로플레이트 분석법을 딥스틱(dipstick) 기술로 발전시켜, 기기나 전력 없이도 검사를 수행할 수 있도록 할 예정입니다. 타액을 통해 HIV가 전염될 가능성은 낮으나, HIV 환자들은 결핵이나 C형 간염과 같은 다른 감염성 질환을 동반하는 경우가 많습니다. 따라서 타액을 다루는 것은 혈액을 다루는 것과 마찬가지로 미지의 감염 입자로 인해 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 본 절차를 수행하는 동안에는 장갑 및 기타 개인 보호 장구를 착용하는 등 항상 주의를 기울여야 합니다.