Name: α-테스트 : 전체 타액을 사용하여 빠른 셀 프리 CD4의 열거 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 배우세요 전체 타액을 이용한 α-테스트로 CD4 세포를 신속하게 계수하는 방법을. 이 비침습적 기법은 혈액 채취 없이 HIV 질환 모니터링을 위한 현장 진단에 적합합니다.

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연구는 해리 윈스턴 학술 진흥 재단에 의해 지원되었다.

1. 신선한 워킹 솔루션을 준비한다 <ol><li> TBS : 0.05 M 트리스는 식염, 산도에게 7.8 (TBS)을 버퍼. 60 ML TBS / microplate를 준비합니다. </li><li> PPE : 돼지의 췌장의 엘라스타제, 유형 1 (PPE) 정학로 제공됩니다. 잘 흔들 약 0.01 U / ML에 TBS에서 PPE를 희석. 6 ML)이 솔루션 / microplate 일을 준비합니다. </li><li> SA 3 NA : Succinyl, L 살라-L-살라-L-살라-P-nitroanilide (SA 세 없음). 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 0.1 M 주식 SA 3 NA 솔루션을 준비하고 -20 ° C. 즉시 사용하거나 저장 주식 SA 3 NA 솔루션 TBS에서 100분의 1을 diluting하여 6ml 작업 솔루션 / microplate를 준비합니다. </li><li> COOMASSIE 블루 : TBS에서 10 % Coomassie 브릴리언트 블루 R-250 (Coomassie 파랑)의 주식 솔루션을 준비하고 -20 ° C. 즉시 또는 상점 사용 TBS 주식 솔루션 1천분의 1을 diluting하여 6 ML 작업 솔루션을 준비합니다. </li></ol> 2. 타액을 준비 <oL&gt; <li> 침이 컬렉션 서있는 위치에서, 같은 입안에 구연산 산성이나 껌 같은 sialogogue을 배치하여 타액으로 혈청 스며 나옴을 자극. 무설탕 레몬 드롭 자주 edentulous와 껌을 씹을 수없는 HIV-1 환자 편리합니다. 처음 3 분 동안 필요에 따라 삼키는하고, 다음 3 분위한 덮힌 컵에 전체 입을 타액을 수집합니다. 이것은 타액의 약 2 ML을 제공합니다. -80시 즉시 사용하거나 저장 ° C. </li><li> 타액 처리 :면 37 ° C와 얼음 장소에 냉동, 해동의 표본. 2-4에서 신선한 또는 해동 표본을 저장 ° C ~ 삼일 이상 더 이상은 아니야. 와동하지 타액 수행되며 혈청 exudate를 포함하지 mucin을 pipetting하지 마십시오. 침이 취급시주의 사항 표준을 사용 <a href="http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf" target="_blank">http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf를</a> . </li></ol> 3. Microplate 설정까지 <ol><li><str긴 사연&gt; 버퍼 : 측정은 세중의로 진행됩니다. microtiter 접시의 각도에 130 μL TBS에 추가됩니다. </li><li> 표본 : 각 시험에 잘, 150 μl / 우물의 최종 부피 20 μL 타액이 추가됩니다. 거품을 도입하지 않고 pipetting하여 섞는다. </li><li> 제어 : 긍정적인 컨트롤 PPE를 포함하지만 아무 타액. 부정적인 컨트롤은 타액을 포함하지만 아무 PPE.To는 긍정적인 컨트롤이 그래요, 20 μL TBS를 추가하지 않습니다. 부정적인 컨트롤 그래요, 20 μL 타액에 추가됩니다. </li><li> PPE 보육 : PPE 작업 솔루션을 잘 흔들어. 물론 부정적인 제어 우물 제외한 각 50 μL PPE 작동 솔루션을 추가합니다. 부정적인 제어 우물로, 50 μL TBS를 추가합니다. 23 ° C.에 10 분 알을 품다 </li><li> 기판 보육 : 각 잘 ~ 50 μL SA 3 NA 작업 솔루션을 추가합니다. 23 ° C.에 45 분 품어 </li><li> COOMASSIE 블루 :. 50 μL Coomassie 파랑 작업 솔루션을 추가 &lt;/ 리&gt; <li> - 읽기 : microplate 리더의 흡광도, 활성 α 한 PI 및 단백질 함량을 나타내는 Coomassie 파랑을 감지하기 위해 595 nm의를 대표하는 SA 3 NA 절단을 감지하기 위해 405 nm의를 참조하십시오. </li></ol> 4. α 1 PI 지수를 계산 <ol><li> 평균 405 nm의 및 595 nm의을 정상화 : 각 세중의 경우, 평균을 계산합니다. 표본 평균에서 제외 제어 평균을 뺍니다. 플레이트 - 투 - 플레이트 편차를 최소화하려면 다음과 같이 긍정적인 제어 평균하여 각 표본 평균을 나누어 평균을 정상화 : </li></ol><img alt="등식 1" src="/files/ftp_upload/3999/3999eq1.jpg" /> <ol start="2"><li> α 1 PI INEX를 계산 : 표준 595 nm의 의한 405 nm의 정규 나누기 : </li></ol> 5. 대표 결과 지방병, 리소스 제한된 지역에서 CD4 카운트를 모니터링하는 시점의 케어 선별 검사로 α-테스트 용도 적합 여부를 확인하려면 자극 타액 20 여성에서 수집되었다 11 남성의 HIV-1 과목 참석 클리닉에 대해 카메룬의 일상적인 관리. 뉴욕시에서 수집된 타액을 사용하는 α-시험 개발하는 동안 예비 관찰과 일치, 타액의 α 1 PI 지수는 CD4 카운트 (R 2 = 0.91, P &lt;0.0001. N = 31)와 상호 카메룬에서 수집했습니다. 관계는 선량 - 반응 관계 (그림 2A)과 일치 3 - 매개 변수 sigmoidal 곡선에 의해 정의되었다. 95 %의 신뢰와 예측 간격이 각각 파란색과 빨간색 선, (그림 2B)로 표시됩니다. 에이전의 연구, 우리는 CD4 + T 세포는 주기성 23 sinusoidal 사이클링 ± HIV-1 과목과 α 1 PI 결핍증 (PIZZ) 3 상속된 버전 과목 3.5 일 전시 사실을 확인했습니다. 묘사 본 27 일간의 주기성 (그림 3A)를 전시가 아닌 HIV-1 건강한 통제 사이클링 CD4의 컴퓨터가 만든 사인 곡선 분석의 대표적인 예입니다. CD4의 컴퓨터가 만든 사인 곡선 분석 + 6 과목 T 세포 변화는 진동 3의 피크 - 투 - 피크 진폭 및 축에 대한 가치관이 나왔고. 예상되어지는대로 진동 축이 진폭 (R 2 = 0.96, P = 0.009, N = 6) (그림 3B)와 상호되었습니다. 환자 것입 낮은 CD4 T + 셀 카운트는 CD4 T 세포 카운트의 주기적 변화가 작았, 높은 CD4 + T 세포 카운트 환자에서 주기적 변화가 큰 있었다. 때문에그림 2에 묘사된 회귀 선 진동과 진동 축 축이 진폭이에 의해 변경할함으로써 회귀 선 CD4 + T 세포가 예상되어지는 얼마만큼 위 아래 추정 회귀 선에 대해 계산할 수, 진폭과 서로 관련되어 추정 사이클링 (그림 3C). 그림 3C와 그림 2B에서 계산된 신뢰 구간 계산 진폭 오버레이, 그것은 진폭이 (녹색 라인) 95% 내에 놓여 것으로 나타났다 신뢰 구간 (파란색 선) (그림 3D). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3999/3999fig1.jpg" /> 1 그림. 절차 요약 : 입안에 장소 구연산 산성과 타액을 수집합니다. 세중의에 microplate의 우물로 희석 타액을 추가합니다. 각도에 PPE를 추가하고 23 ° C.에 15 분 동안 품어 각도에 PPE 기판을 추가하고 23 ° C에서 45 분 동안 품어. Coomassie 블루를 추가하고 PPE 활동을 감지하고 595 nm의에서 단백질을 감지하는 405 nm의에서 읽어보세요. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3999/3999fig2.jpg" /> 그림 2. 표준 CD4 열거 방식으로 α-테스트의 비교. ) α-시험이 자극된 전체 입을 타액에서 α 한 PI 지수를 quantitating에 의해 수행되었다. CD4 카운트는 표준 유동세포계측법를 사용하는 독립 의학 연구소에 의해 수행되었다. 유동세포계측법과 타액을위한 혈액은 같은 병원 방문에서 수집된되었다. α 1 PI 지수와 CD4 카운트 사이의 관계는 3-파라미터 sigmoidal 곡선 (R 2 = 0.91, P &lt;0.0001, N = 31). B) 95 %의 신뢰와 예측 간격은 파란색과 빨간색으로 그려져있다 정의한 각각 선,. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3999/3999fig3.jpg" /> 그림 3. CD4에게 C를 계산의 정확성α1PI Index.A를 사용 ounts)은 CD4 + T 세포가 아닌 HIV-1 건강 관리 27 일간의 주기성으로 sinusoidal 자전거를 전시. 진동 축이 그려져있다 (빨간 점선). B) T 세포 사이클이 4 HIV-1 과목 진동 피크 - 투 - 피크 진폭과 축을 계산하는 데 사용되었다 CD4, 1 이외의 HIV의 컴퓨터 생성된 사인 웨이브 분석 -1 PIzz 제목과 부품 A에서 CD4 간의 관계를 묘사되지 않은 HIV-1 건강 관리 T + 세포 진폭과 진동 축 3 - 매개 변수 sigmoidal 곡선 (R 2 = 0.96, P = 0.009, N에 의해 정의되었다 = 6). C) 부분 B)에서 파생되는 진동의 진폭과 축 사이의 sigmoidal 관계는 그림 2에서 회귀 선 (검은 선)을 따라 포인트의 예상 진폭 (녹색 라인)을 계산하는 데 사용되었다. D) 예상 진폭 간격 (녹색 라인)는 95 % 신뢰 구간 (에서 크게 달랐다로 맨 휘트니 순위 합 시험과 진폭 선과 회귀 선 (37 세포 사이의 평균 차이 (95 % 신뢰 구간과 회귀 선 (63 셀 / μl 사이의 평균 차이 비교 기준)에 따라 결정 파란색 라인) / μl), P = 0.001).

<ol><li>Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+LDL-cholesterol+from+total+cholesterol%2C+triglyceride+and+HDL-cholesterol%3A+a+comparison+of+methods+in+the+Jerusalem+Lipid+Research+Clinic+Prevalence+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Isr.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study.</a> Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).</li>
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 <a target="_blank" href="http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html">http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html</a> (2010).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Undiluted 혈청은 평균 36 μm의를 포함 α 한 PI 및 3.6 μm의 α 2 macroglobulin (α 2 M) 10 배 차이 8. 두 단백질은 PPE에 바인딩을 위해 경쟁합니다. 이러한 두 가지 특성, 농도 및 PPE 친화력은 특별히 α 2 M 8을 경쟁의 존재에 정상 혈청에서 α 한 PI를 측정할 수있는 방법을 개발하기 위해 악용되었습니다. 이 방법은 0.3 % 혈청에서와 같은 작은 50 나노미터 μ 한 PI를 검색할 수 있습니다. 2.5 %의 혈청 희석에서 PPE에 대한 α 2 M의 바인딩은 감지되고,이 희석은 약 900 nm의 α 1 PI 및 90 nm의 α 2 M. 포함되어 있습니다 α 2 M, 전체 입을 타액은 20 배...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Sialogogue, 0.05M 시트르산 </td><td> 에다의 Sugarfree 캔디, 4900 후면 N.20th 거리, 필라델피아, PA 19144 </td><td> 무설탕 레몬 물방울 </td></tr><tr><td> 돼지의 췌장의 엘라스타제, 유형 1 (EC 3.4.21.36) </td><td> 시그마 - 올드 리치, 세인트 루이스, 미주리 63,103 </td><td> E1250 </td></tr><tr><td> Succinyl-L-살라-L-살라-L-살라-P-nitroanilide </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S4760 </td></tr><tr><td> Coomassie 브릴리언트 블루 R-250 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> B7920 </td></tr><tr><td> 조직 문화 - 대우, 96 잘 microplates </td><td> Becton 디킨슨, 프랭클린 호수, 뉴저지 07417-1886 </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> 405 nm의 및 595 nm의 용 필터 Microplate Reader를 </td><td> MTX 랩 시스템, 8456 Tyco 번지 부이lding D, 비엔나, 버지니아 22182 </td><td> Dynex P97277 </td></tr></tbody></table>

α-테스트 : 전체 타액을 사용하여 빠른 셀 프리 cd4의 열거

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

HIV 질환을 모니터링하기 위해 저렴한 CD4 열거를위한 긴급 필요가있다. CD4 열거는 혈액 세포, 오직 현재 결제 방법에 대한 CD4를 측정하기위한 특정 단클론 항체의 시간 및 온도 제한, 기술 세련미와 시약 비용으로 인해 자원이 제한된 지역에 범위 밖입니다. 일반적으로 사용되는 비용 절감 및 시간 절약 실험실 전략은 오히려 측정 특정 혈액 값보다 계산하는 것입니다. 예를 들어, LDL 수치는 총 콜레스테롤, HDL 및 트리 글리세 리드가 1 측정된 수준을 사용하여 계산됩니다. 따라서 직접 CD4의 개수 + T 세포는 CD4을 계산하는 정확한 방법을 제공할 수를 조절 세포가없는 상호의 신분은 상호의 생리 관련으로 인해 계산됩니다. 혈액을 입력하고 CD4에게 + T 세포를 순환이되도록 운명되는 줄기 세포의 수는 케모카인 CXCL12에 의해 결정됩니다ND는 수용체는 운동 2 자신의 영향력으로 인해 CXCR4. 혈액으로 줄기 세포 운동의 과정은 또한 세포 표면에 인간 백혈구 엘라스타제 (HLE CS) 및 HLE CS-반응성 활성 α 1 proteinase 억제제 (α 한 PI, α 1 antitrypsin, SerpinA1) 3에 의해 규제됩니다. HIV-1 질환에서 α 한 PI는 질병 프로세스 4 ~ 인해 inactivated있다. HIV-1 질병의 조기 asymptomatic 카테고리에서 활성 α 한 PI는 치료 HIV-1 환자 (평균 = 12 μm의, 그리고 증상 범주 4, 5 중 정상적인 수준을 달성하는 100 % 아래 정상적인 것으로 발견되었다.이 패턴이 아닌 부족한 합성, proteolytic 불활 성화 또는 산소로, 면역 불활 성화에 기인되었습니다. 우리는&gt; 220 CD4 세포 / μl와 HIV-1 과목에서 CD4 카운트가 (R 2 개 활성 α 한 PI의 혈청 수준과 상호 것으로 관찰 = 0.93, P &amp;그건, 0.0001, N = 26) 및 비활성 α 한 PI (R 2 = 0.91, P &lt;0.0001, N = 26) 5. HIV-1 감염과 감염되지 않은 과목에 대한 α 1 PI의 행정은 α 한 PI는 CD4의 수를 규제에 참여 + T 세포가 혈액 3에서 제안 CD4 카운트 극적으로 증가 결과. 자극을 통해 전체 타액 활성 α 한 사설 탐정이 측정의 상관 관계의 측정 그것이 CD4 카운트를 계산하는 정확한 방법이라는 증거입니다 있도록 충분한 묽은 exudate을 (플라즈마가 타액으로 혈관 벽을 통과 proteinaceous 재료를 포함)가 포함되어 있습니다. 간단히 같은 껌이나 구연산 등의 산성 sialogogues은 전체 입을 타액으로 혈청 스며 나옴을 자극. 혈청 스며 나옴을 자극 후 타액의 혈청 α 한 PI의 활동 엘라스타제 활동을 억제하기위한 능력에 의해 측정됩니다. 돼지의 췌장 엘라스타제 (PPE)엘라스타제의 즉시 사용할 수 저렴한 소스입니다. PPE는 특정 기판, colorimetric 펩타이드입니다 중 하나, succinyl, L 살라-L-살라-L-살라-P-nitroanilide (SA를 cleaving에서 PPE을 방지 일대일 복잡한을 형성 α 한 PI에 바인딩 3 NA). 상온에서 10 분 용 보호구의 포화 농도와 타액을 잠복기 것은 타액에있는 모든 활성 α 한 PI에 PPE의 바인딩이 가능합니다. 활성 α 한 PI에 의해 PPE의 결과 억제는 PPE 기판 SA 3 NA합니다. (그림 1)를 추가하여 측정할 수 있습니다. CD4 카운트는 혈액 부피 (CD4 세포 / μl)의 측면에서 측정하고 있지만, 타액의 α 1 PI의 농도는 볼륨이 날짜와 사람 중에 상당히 달라질 수없는 타액의 볼륨 때문에, 타액의 혈청 농도와 관련되어 사람 6. 그러나, 타액의 거의 모든 단백질은 혈청 컨텐츠로 인해이며, 타액의 단백질 함량은 내 잘못이다7 surable. 따라서 타액에서 활동중인 α 한 PI는 타액 단백질 콘텐츠에 대한 비율로 계산되며, α 1 PI 인덱스 되나있다. 결과는 본 α 한 PI 지수는 CD4 카운트를 계산하기위한 정확하고 정밀한 physiologic 방법을 제공하는 입증 제시.

CD4 열거 방법, α-테스트는 신속하고 정확한 CD4 카운트를 제공하기 위해 전체 타액을 사용하는 설명되어 있습니다. α-테스트 비용 동전과 같은 단클론 항체, 계측, 냉동, 샘플 운송뿐만 아니라 수집 및 혈액의 처리와 같은 기술 교육, 값비싼 시약의 필요성을 없애줍니다.

α-테스트 : 전체 타액을 사용하여 빠른 셀 프리 CD4의 열거

HIV 질환을 모니터링하기 위해 비용 효율적인 CD4 수치 측정법이 시급히 필요합니다. 자원이 제한된 지역에서는 시간상의 이유로 CD4 수치 측정이 어렵습니다...

자원 제한 지역에서 HIV 질환을 모니터링하기 위해 저렴한 CD4 수치 측정법이 절실히 필요합니다. 본 영상에서는 타액 내 단백질 분해 효소 억제제인 Alpha one PI의 존재 여부를 기반으로 CD4 수치를 결정하는 저비용 현장 진단 스크리닝 테스트를 시연합니다. 이를 위해, 먼저 피험자 또는 환자에게 레몬 캔디를 제공하여 타액으로 장액이 분비되도록 유도합니다.타액을 검체 컵에 수집하여 96웰 분석 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 포화량의 단백질 분해 효소인 porcine pancreatic elastase를 타액에 첨가하여 alpha one pi와 결합 및 억제하도록 합니다. 이어서 비색 elastase 기질을 첨가합니다.결합되지 않고 남은 엘라스테이스(elastase)가 기질을 분해하여 투명한 색에서 노란색으로 변색됩니다. 웰에 쿠마시 블루(Kumasi blue)를 첨가하여 총 단백질을 염색하고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 비색 측정을 수행합니다. 최종적으로, 총 단백질 대비 alpha one PI의 비율을 결정하고 이를 인덱스 값에 기반하여 CD four 수치를 정확하게 평가하는 데 사용합니다.이 기술은 기존 방법인 유세포 분석법(flow cytometry)에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 이 분석법은 혈액 채취라는 외상성 및 고비용 과정 없이 현장에서 수행할 수 있으며, 고가의 단클론 항체를 사용할 필요가 없고, 전문적인 기술 교육이나 냉장 보관 및 검체 운송이 필요하지 않습니다. 이 방법은 AIDS 중재의 결정적인 장벽을 극복하며, 환자의 비용 및 건강 결과, 그리고 HIV 전염 빈도에 큰 영향을 미칠 것이며, 이 모든 요소는 세계 경제에 중대한 영향을 줍니다.이 방법은 Alpha와 PI가 부착 및 이동을 통해 CD4 T 세포 수를 어떻게 조절하는지에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 다른 단백질 억제제가 다른 세포 유형의 부착 및 세포 이동을 어떻게 조절하는지 등 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 저희는 HIV 감염 환자에게서 Alpha 1 PI 수치가 매우 낮아 실제 혈액으로 유입되는 CD4 T 세포 수가 제한된다는 점을 발견했을 때 처음으로 이 방법 아이디어를 얻었습니다. 사용할 각 마이크로플레이트에 필요한 작업 용액을 준비하여 프로토콜을 시작하십시오.pH 7.8의 0.05 M tris buffered saline(TBS) 60 mL를 준비합니다. 또한, 각 마이크로플레이트당 porcine pancreatic elastase type one(PPE) 6 mL를 준비합니다. PPE 현탁액을 잘 흔든 다음, TBS로 희석하여 농도가 약 0.01 units/mL가 되도록 합니다.다음으로, DMSO에서 0.1 M 농도의 발색 기질 SA 3NA 스톡 용액을 준비합니다. 이 스톡 용액은 즉시 사용하거나, 즉시 사용하지 않을 경우 -20 °C에서 보관해야 합니다. TBS로 100배 희석하여 각 마이크로플레이트당 6 mL의 작동 용액을 준비합니다. 마지막으로, TBS로 10% Coomassie Brilliant Blue R-250 스톡 용액을 준비하여 즉시 사용하거나, 즉시 사용하지 않을 경우 -20 °C에서 보관합니다.스톡 용액을 TBS로 1,000배 희석하여 각 마이크로플레이트당 6 mL씩 준비합니다. 타액을 취급할 때는 피험자 또는 환자가 선 자세에서 장갑과 실험복을 착용하는 등 적절한 주의 사항을 준수하는 것이 중요합니다. 혈청 삼출을 자극하기 위해 입안에 SGO를 배치합니다.본 시연에서 HIV 환자의 역할은 연구 보조원이 수행하고 있습니다. 무설탕 레몬 드롭 캔디는 치아가 없거나 껌을 씹을 수 없는 HIV 환자에게 유용합니다. 처음 3분 동안은 필요에 따라 삼키며 입안에 머금고, 이후 3분 동안은 구강 전체의 타액을 검체 컵에 수집하십시오. 이렇게 하면 약 2 mL의 타액을 얻을 수 있습니다.타액을 즉시 사용하지 않을 경우, 처리 당일에 분주하여 -80 °C에서 보관하십시오. 검체는 37 °C에서 해동합니다. 해동된 타액은 2~4 °C에서 최대 3일 동안 보관할 수 있습니다. 분석 설정을 위해 각 시료와 대조군을 96-well 평저 플레이트에 3회 반복 분주하며, 각 시료 well과 대조군 well에 130 µL의 TBS를 넣습니다.그 후, 점성이 있고 혈청 삼출물이 포함되지 않은 뮤신을 피하여, 각 3개의 테스트 웰과 3개의 음성 대조군 웰에 타액 20 µL씩을 옮깁니다. 그런 다음 양성 대조군 웰에 TBS 20 µL를 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다.이 단계에서는 타액을 피펫팅할 때 기포가 생기도록 볼텍싱하는 것을 피하고, 고체 입자와 점액질이 피펫팅되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 다음으로, 양성 대조군 췌장 엘라스타제(pancreatic elastase) 또는 PPE 작업 용액을 잘 흔들어 섞은 후, 샘플 및 양성 대조군 웰과 음성 대조군 웰에 50 µL씩 첨가합니다.TBS 50 µL를 첨가합니다. 첨가된 부피가 충분하여 타액 혼합물에 고르게 분포되므로 별도로 섞을 필요는 없습니다. 플레이트를 상온에서 10분 동안 배양합니다.배양 후, 각 웰에 50 µL의 elastase substrate SA three NA 작동 용액을 첨가합니다. 그런 다음 23 °C에서 45분 동안 추가로 배양합니다. 45분이 지나면, 각 웰에 50 µL의 Kumasi blue 작동 용액을 첨가합니다.그 다음, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서 SA-III-NA 절단을 검출하고, 총 단백질 함량을 나타내는 595 nm에서 쿠마시 블루(kumasi blue)의 흡광도를 측정합니다. alpha 1 PI 지수를 계산하려면, 먼저 다음 공식에 따라 각 파장의 정규화된 흡광도를 구합니다. 이는 검체 평균과 음성 대조군 평균의 차이를 양성 대조군 평균과 음성 대조군 평균의 차이로 나누어 계산합니다. 그 후, 여기에 표시된 바와 같이 405 nm에서의 정규화된 흡광도를 595 nm에서의 정규화된 흡광도로 나누어 alpha 1 PI 지수를 산출하며, 이를 통해 alpha 테스트가 자원이 제한된 풍토병 지역에서 CD4 수치를 모니터링하기 위한 현장 진단(point of care) 스크리닝 검사로 사용하기에 적합한지 판단합니다.카메룬의 클리닉에서 정기 진료를 받는 여성 20명과 남성 11명의 HIV 1 감염자로부터 자극 타액을 수집하였습니다. 이는 뉴욕시에서 수집한 타액을 이용한 알파 테스트 개발 당시의 예비 관찰 결과와 일치하며, 카메룬에서 수집한 타액의 alpha one PI 지수는 CD four 수치와 R squared 값 0.91, P 값 0.0001 미만으로 상관관계를 보였습니다. 이 관계는 용량 반응 관계와 일치하는 3매개변수 시그모이드 곡선으로 정의되었습니다. 95% 신뢰 구간과 예측 구간은 각각 파란색과 빨간색 선으로 표시되었습니다.이전 연구에서, 우리는 HIV 1 감염자와 유전성 alpha one PI 결핍증(PIZZ) 환자에게서 CD four 양성 T 세포가 23 ± 3.5일의 주기로 사인파 형태의 순환을 보인다는 것을 확인했습니다. 여기에 제시된 것은 27일 주기를 보이는 비 HIV 건강 대조군에서 CD four 순환의 컴퓨터 생성 사인 곡선 분석의 대표적인 예시입니다. 6명의 피험자를 대상으로 CD four 양성 T 세포의 변화에 대해 컴퓨터 생성 사인 곡선 분석을 수행한 결과, 예상대로 피크 간 진폭(peak-to-peak amplitude)과 진동 축(axis of oscillation) 값이 산출되었습니다. 진동 축은 진폭과 상관관계가 있었으며, R-squared 값은 0.96, p 값은 0.009였습니다.CD4 양성 T-세포 수가 적은 환자의 경우 CD4 T-세포 수의 주기적 변화가 작았으며, CD4 양성 T-세포 수가 많은 환자의 경우 주기적 변화가 컸습니다. 이는 여기에 표시된 회귀선이 진동축을 추정하며, 진동축이 진폭과 상관관계가 있기 때문입니다. 회귀선에 대해 진폭을 계산하여, 주기적 변동으로 인해 CD4 양성 T-세포가 회귀선 상하로 어느 정도 변동할 것으로 예상되는지 추정할 수 있습니다. 계산된 진폭과 신뢰 구간을 겹쳐 보았을 때, 녹색선으로 표시된 진폭이 청색선으로 표시된 95% 신뢰 구간 내에 있음이 확인되었습니다.이 기술에 숙달되면 타액 수집부터 환자에게 CD4 세포 수치를 제공하기까지 90분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 CD4 수치를 모니터링하기 위한 선별 검사로 사용하도록 고안되었습니다. 환자의 CD4 수치에 큰 변화가 나타나는 경우, CD4 수치 측정값이 유효한지 확인하고 치료 결정을 돕기 위해 유세포 분석법(flow cytometry)을 통해 추적 관찰을 실시해야 합니다.다음 개발 단계에서는 마이크로플레이트 분석법을 딥스틱(dipstick) 기술로 발전시켜, 기기나 전력 없이도 검사를 수행할 수 있도록 할 예정입니다. 타액을 통해 HIV가 전염될 가능성은 낮으나, HIV 환자들은 결핵이나 C형 간염과 같은 다른 감염성 질환을 동반하는 경우가 많습니다. 따라서 타액을 다루는 것은 혈액을 다루는 것과 마찬가지로 미지의 감염 입자로 인해 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 본 절차를 수행하는 동안에는 장갑 및 기타 개인 보호 장구를 착용하는 등 항상 주의를 기울여야 합니다.

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