α-테스트 : 전체 타액을 사용하여 빠른 셀 프리 CD4의 열거

자원이 제한된 지역에서 HIV 질병을 모니터링하기 위해 저렴한 CD 4 집계가 시급히 필요합니다. 이 비디오는 타액 내 단백질분해효소 억제제 Alpha one PI의 존재 여부에 따라 CD 4 카운트를 결정하는 저비용 현장 검사 스크리닝 테스트를 보여줍니다. 이를 위해 피험자 또는 환자에게 먼저 레몬 방울을 투여하여 장액이 타액으로 분출되도록 자극합니다.

타액은 표본 컵에 수집되어 96 웰 분석 플레이트로 옮겨집니다. 그런 다음 proteinase porcine pancreatic elastase의 포화량을 타액에 첨가하여 alpha one pi와 결합하고 억제합니다. 다음으로 발색계 엘라스타아제 기질이 추가됩니다.

결합되지 않은 엘라스타제에 남아 있으면 기질이 절단되어 색상이 투명에서 노란색으로 변합니다. 총 단백질을 염색하기 위해 웰에 쿠마시 블루를 첨가하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 색상 미터법을 측정합니다. 궁극적으로 총 단백질에 대한 알파 1 PI의 비율이 결정되고 인덱스 값을 기반으로 CD 4 카운트를 정확하게 평가하는 데 사용됩니다.

이 기법은 유세포 분석이라는 기존 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 분석은 혈액을 채취하지 않고 현장에서 수행할 수 있으며, 이는 기술 교육 없이 비용이 많이 들고 냉장 또는 샘플 운송이 필요하지 않은 단클론 항체를 사용하지 않고는 충격적이고 비용이 많이 듭니다. 이 방법은 AIDS 개입에 대한 중요한 장벽을 극복하고 세계 경제에 큰 영향을 미치는 환자의 비용 및 건강 결과와 HIV 전염 빈도에 큰 영향을 미칠 것입니다.

이 방법은 알파 및 PI가 부착 및 이동을 통해 CD 4 T 세포 수를 조절하는 방법에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 다른 단백질 억제제가 다른 세포 유형의 부착 및 세포 이동을 조절하는 방법과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 우리는 HIV 감염 환자에서 알파 1 PI가 너무 낮아서 실제로 얼마나 많은 CD 4 T 세포가 혈액으로 들어가는지를 제한한다는 것을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 사용할 각 마이크로플레이트에 필요한 작업 솔루션을 준비하여 이 프로토콜을 시작합니다.

pH 7.8에서 60ml의 0.05몰, 완충 식염수 또는 TBS를 준비합니다. 또한 각 마이크로플레이트에 대해 6ml의 돼지 췌장 엘라스타아제 1형 또는 PPE를 준비합니다. PPE 현탁액을 잘 흔든 다음 TBS에서 밀리리터당 약 0.01단위의 농도로 희석합니다.

다음으로, DMSO의 3 NA.In 색 메트릭 기판 SA의 0.1 몰 스톡 용액을 준비하고,이 스톡 용액은 즉시 사용되거나 스톡을 즉시 사용할 경우 섭씨 영하 20도에서 보관해야합니다. TBS에서 100분의 1을 희석하여 각 마이크로플레이트에 대해 6ml의 작업 용액을 준비합니다. 마지막으로 TBS에 10% kumasi brilliant blue R two 50의 원액을 준비하고 즉시 사용하거나 즉시 사용할 경우 영하 20도에서 보관하십시오.

TBS에서 1000분의 1을 희석하여 각 마이크로플레이트에 대해 6밀리리터를 준비합니다. 타액을 다룰 때는 연구 대상자 또는 환자가 서 있는 자세로 장갑과 실험복을 착용하는 등의 적절한 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다. SGO를 입에 넣어 혈청 삼출물을 자극합니다.

이 시연에서 HIV 환자의 역할은 연구 보조원이 수행하고 있습니다. 무설탕 레몬 드롭은 자주 무치악이 되어 처음 3분 동안은 껌을 씹을 수 없고 필요에 따라 삼키고 다음 3분 동안 입 전체의 타액을 표본 컵에 모을 수 없는 HIV ONE 환자에게 편리합니다. 이렇게 하면 약 2ml의 타액이 나옵니다.

타액을 즉시 수생으로 사용하지 않을 경우 처리 당일 섭씨 영하 80도에서 검체를 섭씨 37도에서 보관하십시오. 일단 해동되면 침은 섭씨 2도에서 4도에서 최대 3일 동안 보관할 수 있습니다. 각 샘플과 대조군은 96웰 플랫 바닥 플레이트에 삼중으로 도금되어 각 샘플 웰 및 컨트롤 웰에 대해 130마이크로리터의 TBS에서 분석을 설정합니다.

그런 다음 점성이 있고 혈청 삼출물을 포함하지 않는 점액을 피하십시오. 20마이크로리터의 타액을 3개의 테스트 웰과 3개의 음성 대조군 웰 각각으로 옮깁니다. 그런 다음 20마이크로리터의 TBS를 피펫팅으로 혼합된 양성 대조군 웰에 첨가합니다.

이 단계에서는 타액을 피펫팅할 때 거품을 만드는 와류를 피하고 고체 입자를 피펫팅하고 숙고하는 것을 피피하는 것이 중요합니다. 다음으로, PO 사인 췌장 엘라스타아제 또는 PPE 작업 용액을 흔듭니다. 잘 혼합하려면 샘플에 50 마이크로 리터를 추가하고 음성 대조군 웰에 양성 대조군 웰을 첨가하십시오.

TBS 50마이크로리터를 추가합니다. 첨가된 부피가 타액 혼합물에 균일하게 분포할 수 있을 만큼 충분히 크기 때문에 혼합할 필요가 없습니다. 접시를 실온에서 10분 동안 배양합니다.

배양 후, 50 마이크로 리터의 엘라스타제 기질 SA 3 NA 작업 용액을 각각에 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 23도에서 45분 더 배양합니다. 45분이 지난 후 각각에 50마이크로리터의 쿠마시 블루 작업 용액을 추가합니다.

그런 다음 405나노미터의 마이크로플레이트 리더에서 흡광도를 판독하여 SA 3개의 NA 분열을 감지하고 595나노미터에서 총 단백질 함량을 나타내는 쿠마시 블루를 감지합니다. 알파 1 PI 지수를 계산하려면 먼저 다음 공식을 사용하여 표본 평균과 음의 대조 평균의 차이를 양성 대조 평균과 음의 대조 평균의 차이로 나누어 각 파장에 대한 정규화된 흡수제를 얻습니다. 그런 다음 알파 1 PI 지수를 얻으려면 다음과 같이 405나노미터의 정규화된 흡광도를 595나노미터의 정규화된 흡광도로 나누어 알파 테스트가 풍토병 자원이 제한된 지역에서 CD 4 카운트를 모니터링하기 위한 현장 선별 검사로 사용하기에 적합한지 여부를 결정합니다.

카메룬에서 정기 진료를 위해 클리닉에 다니는 여성 20명과 남성 HIV 1명의 피험자로부터 자극된 타액을 채취하였는데, 이는 뉴욕시에서 채취한 타액, 카메룬에서 채취한 알파 원 PI 지수 및 타액을 이용한 알파 검사 개발 중 예비 관찰 결과와 일치하며, R 제곱 값이 0.91이고 P 값이 0.0001 미만인 CD 4 카운트와 상관관계가 있었다. 관계는 3개의 매개변수 시그모이드 곡선(sigmoidal curve)에 의해 정의되었으며, 이는 용량 반응 관계와 일치합니다. 95% 신뢰 구간과 예측 구간은 각각 파란색 선과 빨간색 선으로 표시됩니다.

이전 연구에서, 우리는 CD 4 양성 T 세포가 HIV 1 피험자와 알파 1 PI 결핍의 유전 버전을 가진 피험자에서 주기성 23 플러스 마이너스 3.5 일의 정현파 순환을 나타낸다는 것을 확인했다. PIZZ 묘사 다음은 27 일 주기성을 나타내는 비 H HIV 건강 대조군에서 CD 4 사이클링의 컴퓨터 생성 부호 곡선 분석의 대표적인 예이다. CD 4의 컴퓨터 생성 부호 곡선 분석 양성 T 세포. 6개의 피험자에서 변화는 예상대로 peak-to-peak 진폭과 진동 축에 대한 값을 산출했습니다. 진동축은 진폭과 상관관계가 있었으며 R-제곱 값은 0.96, p 값은 0.009였습니다.

CD 4 양성 T 세포 수가 낮은 환자에서는 CD 4 T 세포 수의 주기적 변화가 작았고 CD 4 양성 T 세포 수가 높은 환자에서는 4 개의 양성 T 세포 수가 많았다. 주기적 변화가 큰 이유는 여기에 표시된 회귀선이 진동축과 진동축이 진폭과 상관관계가 있다는 것을 추정하기 때문입니다. 회귀선에 대한 진폭을 계산하여 회귀선 CD 4개의 양의 T 셀이 계산된 진폭과 신뢰 구간을 오버레이하는 사이클링으로 인해 얼마나 달라질 것으로 예상되는지 추정할 수 있으며, 녹색 선으로 표시된 진폭이 파란색 선으로 표시된 95% 신뢰 구간 내에 있는 것으로 나타났습니다.

일단 마스터되면 이 기술은 타액 채취 시간부터 환자에게 CD 4개의 세포 수 번호를 얻을 때까지 90분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 CD 4 카운트를 모니터링하기 위한 선별 검사로 사용하기 위한 것입니다. 환자가 CD four count에서 큰 변화를 보이는 경우, CD four count의 측정이 유효한지 확인하고 치료 결정을 돕기 위해 유세포 분석을 사용하여 해당 환자를 추적해야 합니다.

개발의 다음 단계에서 Microplate 분석은 계량봉 기술로 개발되어 기기나 전기 없이 테스트를 수행할 수 있습니다. HIV가 타액에서 감염될 가능성은 낮지만, HIV 환자는 결핵이나 C형 간염 등 다른 감염증을 가지고 있는 경우가 많기 때문에, 혈액을 다루는 것과 같은 타액을 가지고 일하는 것은 알려지지 않은 감염 입자에 의해 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 및 기타 개인 보호 장비를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.