Name: 에 의한 이전 치킨 태아에 유전자 이체 전 비켜 Electroporation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 배우세요 노후 닭 배아에서 유전자 이전을 위한 X ovo 전기영동법. 이 기술은 발달 생물학에서 유전자 기능과 조절을 연구하는 데 활용됩니다. 면역조직화학을 통해 유전자 발현을 검출할 수 있습니다.

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이 작품은 독일 학술 진흥 재단 (; LU1455/1-1 DFG)에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 예 비켜 문화 <ol><li> 신선한 수정된 달걀이 부화 60 %의 습도와 37.5에서 강제 통풍 인큐베이터 (BSS160, Ehret, 독일) ° C에서 그들의 긴 측면에 놓여있다. 이상 1 주일 동안 12 ° C에서 저장된 계란을 사용하지 않아야합니다. </li><li> 2.5 일 (무대 HH17에 대한)에 대한 인큐베이션 후, 계란을 제거하고 해독을위한 방향을 나타내는 연필로 상단에 라벨을 달고. </li><li> 크래킹하기 전에 깨끗한 대형 배양 접시 (; Greiner 생물 하나 게엠베하, 독일 145mm의 직경)로 약 20 ML 멸균 증류수를 부어. </li><li> 대형 배양 접시에, 또 다른 작은 멸균 페트리 접시를 (Greiner 바이오 - 하나 게엠베하 94mm의 직경) 놓습니다. </li><li> 날카로운 금속 모서리에 대한 바닥에 알을 약쟁이, 조심스럽게 달걀을 열고 작은 배양 접시에 각 계란의 전체 내용을 전송합니다. </li><li> 뚜껑과 함께 큰 페트리 접시를 커버하여 다른 인큐베이터 (바인더 게엠베하, Tuttlinge, 독일)에 넣어추가로 문화의 37.5에서 ° C에서 약 60 %의 습도. 일 원하는 번호 부화 후 배아가 electroporation을 위해 사용될 수 있습니다. </li></ol> 2. 전 비켜 Electroporation을위한 준비 <ol><li> 1.0 밀리미터 직경 (TW100F-4, 세계 정밀 계측기)의 유리 튜브를 사용하는 microelectrode의 풀러 (세계 정밀 계측기, 베를린, 독일 PUL-100 Micropipette 풀러)와 유리 모세관을 당겨와 적절한로 유리 모세관의 끝부분을하다 지름. </li><li> electroporation에 대한 적절한 매개 변수 (즉, 배아의 독특한 조직 및 크기에 대해 다른 전압) 설정 및 electroporator (CUY21 - 편집, Nepa 진, 치바, 일본)에 전극을 연결 배아의 대상 조직 및 크기에 따라. </li><li> 그리고 마커 유전자; 대상 유전자를 인코딩 pCAGGS 벡터의 plasmids, 예를 들어, cadherin7 (2.0 μg / μl의 농도로 pCAGGS-Cad7 Cad7)를 포함하는 플라스미드 솔루션을 준비예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP, 0.25 μg / μl의 농도로 pCAGGS-GFP). 그렇다면 녹색 색상 플라스미드 솔루션을 라벨에 0.1 %의 최종 농도 (시그마)와 빠른 그린을 추가합니다. </li><li> 입 피펫을 사용하여 플라스미드 솔루션 모세관 유리를로드합니다. </li></ol> 3. 전 비켜 Electroporation에 의한 치킨 광학 Tectum로 진 전송 <ol><li> 전 비켜 문화 후 예는 인큐베이션 일 (E) 6으로, 닭 배아는 전 비켜 electroporation을 위해 사용됩니다. </li><li> 조심스럽게 미세 집게로 광학 tectum 위에 vitelline 및 양막 세포막을 찢어하고 tectum의 표면에 멸균 0.9 %의 나트륨 염화물 용액 3 방울을 추가합니다. </li><li> 입 피펫을 사용하여 모세관 유리하여 tectum의 캐비티에 플라스미드 솔루션을 주사. </li><li> tectum 옆에 텅스텐 바늘 음극과 직사각형 플레이트 양극 (CUY 661-3X7, Nepa 유전자)와 전극을 배치하고,즉시 tectum에 electroporator에 의해 생산된 전기 펄스를 (6 펄스, 25 V, 60 MS 펄스 길이, 각각의 경우 100 MS 간격)이 적용됩니다. </li><li> 뚜껑이있는 큰 페트리 접시를 덮어 인큐베이터로 반환합니다. 적절한 일 (예, 2 또는 삼일 electroporation 이후)을위한 인큐베이션 후, tectum는 immunostaining (그림 1)과 생물 학적 검출을 위해 수집하고 해결됩니다. </li></ol> 4. 대표 결과 전 비켜 electroporation에 의해 Cad7와 GFP의 외인성 단백질의 성공 overexpression은 예를 들어 그림 1에 표시됩니다. 플라스미드 GFP와 Cad7 플라스미드 함께이 E6에서 tectum에 electroporated되었을 때, 2-3 일 electroporation 후 배아를 모으고 수정되었습니다. E8에서 GFP 단백질은 강력 전체 마운트 이미지 (그림 1A-C)에 tectum에 표시됩니다. 또한, E9의 tectum의 섹션에서GFP 단백질 (그림 1D 녹색) 및 Cad7 단백질 (그림 1E에서 빨간색) 전 비켜 electroporation은 생체내에 오래된 닭 배아에 유전자 전달을위한 성공적인 방법이라고 제안하고, (그림 1 층에서 노란색) coexpressed 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/4078/4078fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. plasmids 인코딩 GFP와 Cad7은 E6에서 치킨 tectum로 cotransfected되면 2-3 일 전 비켜 electroporation 후, GFP 단백질은 (녹색) 강하게 같은 E8에 wholemount 이미지 (AC)과 같이 표시됩니다. E9의 tectum의 섹션에서 GFP 단백질 (D 녹색) 및 Cad7 단백질 (E에서 적색) (F에서 노란색) coexpressed 있습니다. BF, 명시야 이미지입니다. 스케일 바 : AC 용 200 μm의, DF위한 D 100 μm의.

<ol><li>Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li>
<li>Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-20+expression+by+motor+neurons+is+regulated+by+Sonic+hedgehog+during+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development.</a> NeuroReport. 20, 365-370 (2009).</li>
<li>Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionalized+cadherin-7+expression+by+radial+glia+is+regulated+by+Shh+and+Pax7+during+chicken+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development.</a> Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).</li>
<li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li>
<li>Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-induced+targeted+silencing+of+developmental+control+genes+during+chicken+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis.</a> Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).</li>
<li>Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+comparative+study+of+RNAi+methodologies+by+in+ovo+electroporation+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).</li>
<li>Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+introducing+morpholinos+into+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo.</a> Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).</li>
<li>Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherins+guide+migrating+Purkinje+cells+to+specific+parasagittal+domains+during+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development.</a> Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).</li>
<li>Luo, J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+for+gene+transfer+into+older+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).</li>
<li>Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+axons+to+specific+fiber+tracts+in+vivo+by+altering+cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression.</a> J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 프로토콜은 전 비켜 electroporation에 의해 기존의 닭 배아 (예 : E6의 광학 tectum로)로 유전자 전달을위한 가이드를 제공합니다. 이 방법은 기존의 닭 배아에 electroporation의 사용을 확장하고 쉽게 나중 단계에서 생체내의 유전자 기능을 연구를 위해 많은 실험실에 적용할 수 있습니다. E4에서 최소한 E7에 태아도 성공적으로이 방법에 의해 electroporated 수 있으며 electroporated 배아는 E15 11까지 생존이 될 수 있습니다. 뇌 이외에도이 방법은 또한 닭 사지 시스템을 11로 유전자 전달에 사용될 수 있습니다. 특별한주의는 전 비켜 electroporation에 의해 지불되어야합니다. 작은 배양 접시가 E2.5 주위에서 연주 균열 살균 계란 있어야;. 예를 들어, 전직 비켜 문화 배아 높은 생존을 얻기 위해 사용되는...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> Nepa 진, 일본 </td><td> CUY21 - 편집 </td></tr><tr><td> 전극 </td><td> Nepa 진, 일본 </td><td> CUY661-3X7 </td></tr><tr><td> 계란 인큐베이터 </td><td> Ehret, 독일 </td><td> BSS160 </td></tr><tr><td> 배아 인큐베이터 </td><td> 바인더 게엠베하, 독일 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> Keyence, 독일 게엠베하 </td><td> BZ-8000 </td></tr><tr><td> 페트리 접시 </td><td> Greiner 바이오 하나 게엠베하, 독일 </td><td></td></tr><tr><td> Microelectrode의 풀러 </td><td> 세계 정밀 계측기, 독일 </td><td> PUL-100 </td></tr></tbody></table>

에 의한 이전 치킨 태아에 유전자 이체<em&gt; 전 비켜</em&gt; electroporation

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

닭 배아가 배아 발달 동안 유전자 기능과 규제를 공부를위한 훌륭한 모델 시스템을 제공합니다. 비켜 electroporation에는 강력한 오버 특급 외인성 유전자에 대한 방법이나 닭 배아 1 생체내의 내생 유전자를 다운 조절입니다. 이러한 유전자 plasmids 인코딩 유전자 2-4, 작은 간섭 RNA (siRNA) plasmids 5, 작은 합성 RNA oligos 6 및 morpholino 안티 센스 oligonucleotides 7 등 다양한 건축물에 쉽게 electroporation에 의해 닭 배아로 transfected 수 있습니다. 그러나 비켜 electroporation에의 응용은 초기 배양 단계 (단계 HH20 미만 - 함부르크와 해밀턴에 따라)에 배아로 제한됩니다 8, 나중 단계에서 배아에서의 응용을위한 몇 가지 단점은 (무대 HH22보다 오래된 없습니다 - 약 3.5 개발 일). 예를 들어, 나중 단계에 vitelline 막이 우스입니다조 막에 붙어 있으며 껍질에 창을 열지 앨리 배아의 죽음에 그 결과 혈관의 파열을 초래, 이전 배아는 그것이 배아를 액세스하고 조작하기가 어렵습니다 vitelline 및 allantoic 혈관에 의해 적용되며, 이전 배아 움직이지 셸의 상대적으로 작은 창을 통해 방향을 제어하기 어려운 강력하고 있습니다. 이 프로토콜에서는 늦은 단계 (단계 HH22보다 오래된)에서 닭 배아에 유전자 전달을위한 전직 비켜 electroporation 방법을 보여줍니다. 전 비켜 electroporation의 경우 배아가 페트리 접시 9 배양해하고 vitelline 및 allantoic 혈관이 널리 퍼져있다. 이러한 조건에서 기존의 닭 배아 쉽게 액세스하고 조작합니다. 따라서이 방법은 기존의 닭 배아에 적용 비켜 electroporation에의 단점을 극복. 이 방법을 사용 plasmids 쉽게 여러 부분으로 transfected 수오래된 닭 배아 10-12니다.

나중에 인큐베이션 단계 (햄버거와 해밀턴 무대 (HH) 22 세 이상)에서 닭 배아에 유전자 전달의 방법을 설명합니다. 이 방법은 단점을 극복<em&gt; 비켜에서</em&gt; electroporation은 나이 닭 배아에 적용하여 유전자 기능과 기존의 개발 단계에서의 규제를 공부하는 유용한 기술입니다.

에 의한 이전 치킨 태아에 유전자 이체<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation

닭 배아는 배아 발달 과정 중의 유전자 기능과 조절을 연구하기 위한 매우 뛰어난 모델 시스템을 제공합니다. 난내 전기천공법(In ovo electroporation)은...

본 절차의 전반적인 목표는 성장 단계가 더 진행된 닭 배아에 생체 내(in vivo) 유전자 전달을 수행하여, 후기 발달 단계에서의 유전자 기능과 조절을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 부화 약 2.5일 차에 달걀 껍질을 깨고 배아 전체를 페트리 접시 시스템으로 옮깁니다. 다음 단계로, 관심 유전자를 인코딩하는 플라스미드를 배아의 적절한 부위에 주입합니다.플라스미드를 주입한 후 배아 옆에 전극을 배치하고 X ovo 전기천공법을 수행한 다음, 마지막 단계로 전기천공된 배아를 수집하여 분석합니다. 최종적으로 면역조직화학염색을 통해 배아 내에서 전달된 유전자의 발현을 검출합니다. 오늘 우리는 닭 BUL을 이용한 X oval 전기천공법 수행 방법을 보여드리겠습니다.이 기술의 주요 장점은 X가 전기천공법과 달리 기존의 닭 배아 유전자 전달에 사용된 전기천공법의 문제점을 극복할 수 있다는 점입니다. 성공적인 닭 배아의 X ovo 배양을 위해서는 신선한 수정란을 사용해야 합니다. 12 °C에서 일주일 이상 보관된 알은 사용하지 마십시오.2.5일간의 배양 후, 알을 37.5 °C, 습도 60%의 강제 대류식 배양기에 옆으로 눕혀 놓습니다. 배아가 Hamburger 및 Hamilton 단계 17에 도달하면 배양기에서 알을 꺼냅니다.각 달걀의 윗부분에 연필로 표시하여 달걀을 깰 방향을 나타냅니다. 지름 145 mm의 깨끗하고 큰 멸균 페트리 접시에 멸균 증류수 약 20 milliliters를 붓습니다. 지름 94 mm의 작은 멸균 페트리 접시를 큰 페트리 접시 안에 넣습니다.다음으로, 각 달걀의 아랫부분을 날카로운 금속 모서리에 부딪혀 깨뜨립니다. 달걀을 조심스럽게 열어 내부의 모든 내용물을 작은 페트리 접시에 옮깁니다. 배아의 양호한 품질을 보장하기 위해, 난막(vitelline membrane)에 손상이 없도록 달걀의 전체 내용물이 페트리 접시 내에서 정상적인 원형 형태를 유지해야 합니다.각 알의 내용물을 작은 접시에 옮긴 후, 큰 접시에 뚜껑을 덮습니다. X ovo 전기천공법을 수행하기 전, 페트리 접시 시스템을 다른 배양기에 넣고 37.5 °C, 습도 약 60% 조건에서 추가 배양합니다. 마이크로 전극 추출기를 사용하여 1.0 mm 직경의 유리 튜브에서 유리 모세관을 뽑아냅니다.유리 모세관의 끝을 적절한 직경이 되도록 부러뜨립니다. 다음으로, 조직의 종류와 배아의 크기에 따라 서로 다른 전압을 설정하는 등 전기천공법(

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생물학

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