에 의한 이전 치킨 태아에 유전자 이체 전 비켜 Electroporation

나중에 인큐베이션 단계 (햄버거와 해밀턴 무대 (HH) 22 세 이상)에서 닭 배아에 유전자 전달의 방법을 설명합니다. 이 방법은 단점을 극복

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내에서 더 오래된 닭 배아로 유전자 전달을 수행하여 더 오래된 발달 단계에서 유전자 기능 및 조절을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 부화일 2.5일에 난자를 깨뜨리고 전체 배아를 페트리 접시 시스템으로 옮겨 놓음으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 관심 유전자를 배아의 적절한 부분에 인코딩하여 플라스미드를 주입하는 것입니다.

플라스미드를 주입하여 배아 옆에 전극을 놓고 X ovo 전기천공을 수행한 후, 마지막 단계는 분석을 위해 전기천공된 배아를 채취하는 것입니다. 궁극적으로, 면역조직화학(immunohistochemistry)은 배아에서 전달된 유전자의 발현을 검출하는 데 사용됩니다. 오늘 우리는 치킨 BUL을 사용하여 X 타원형 전기천공을 수행하는 방법을 보여 드리겠습니다.

이 기술의 주요 장점은 X를 통한 전기천공법이 더 오래된 닭 배아의 유전자 전달에 사용되는 과도한 전기천공법의 문제를 극복할 수 있다는 것입니다. 닭 배아의 성공적인 X ovo 배양을 위해서는 신선한 수정란을 사용해야 합니다. 섭씨 12도에서 일주일 이상 보관된 계란을 사용하지 마십시오.

2.5일 동안 부화한 후 섭씨 37.5도, 습도 60%의 강제 통풍 인큐베이터에 알을 긴 면으로 눕힙니다. 배아가 햄버거와 해밀턴 정도일 때. 17단계, 인큐베이터에서 알을 꺼냅니다.

각 달걀의 갈라지는 방향을 나타내기 위해 연필로 각 달걀의 윗부분을 표시하십시오. 직경 20mm의 깨끗하고 큰 페트리 접시에 약 145ml의 멸균 증류수를 붓습니다. 직경 94mm의 작은 멸균 페트리 접시를 큰 페트리 접시에 넣습니다.

다음으로, 날카로운 금속 모서리에 바닥에 있는 각 계란을 깨뜨립니다. 조심스럽게 달걀을 열고 전체 내용물을 작은 페트리 접시에 옮깁니다. 배아의 좋은 품질을 보장하기 위해, 난자의 전체 내용물은 빌린 멤브레인에 어떠한 손상도 입히지 않고 페트리 접시 시스템에서 정상적으로 둥근 형태로 유지되어야 합니다.

각 계란의 내용물을 작은 접시에 옮긴 후 큰 접시를 뚜껑으로 덮습니다. X ovo electroporation 전에 섭씨 37.5도, 습도 약 60%에서 추가 배양을 위해 Petri 접시 시스템을 다른 인큐베이터에 넣습니다. 마이크로 전극 극성을 사용하여 1.0mm 직경의 유리관에서 유리 모세관을 당겨 빼냅니다.

유리 모세관의 끝을 적절한 직경으로 자릅니다. 다음으로, 배아의 고유한 조직 및 크기에 대한 다양한 전압과 같은 전기천공을 위한 적절한 매개변수를 설정합니다. 배아의 표적 조직과 크기에 따라 적절한 전극을 전기에 연결합니다.

플라스미드를 함유하는 플라스미드 용액을 준비하여 표적 유전자와 마커 유전자를 암호화합니다. 이 논증에서는, cadherin 7 또는 CAD seven는 표적이고 녹색 형광성 단백질 또는 GFP는 마커입니다. 최종 농도 0.1%에 빠른 녹색을 첨가하여 플라스미드 용액을 녹색으로 표시합니다.

마지막으로, 입 피펫을 사용하여 유리 모세관에 플라스미드 용액을 로드합니다. 6일 동안 배양된 X ovo 배양액의 닭 배아를 X ovo electroporation에 사용합니다. 이 절차를 시작하려면 가는 집게를 사용하여 시신경 구조 위의 틸렌 및 양막을 조심스럽게 찢고 멸균 0.9% 염화나트륨 용액을 시신경 표면에 3방울 떨어뜨립니다.

구강 피펫을 사용하여 유리 모세관의 플라스미드 용액을 tectum의 공동으로 주입합니다. 텅스텐 바늘 음극과 직사각형 플레이트 양극이 있는 전극을 tectum 옆에 놓습니다. 즉시 전기를 사용하여 tectum에 전기 펄스를 가하십시오.

큰 페트리 접시를 뚜껑으로 덮고 GFP 및 CAD 7을 E 6의 닭 tectum으로 인코딩하는 플라스미드의 전기 천공법 후 2-3일 후에 인큐베이터로 되돌리고, tectum을 수집하여 면역 염색을 위해 고정합니다. 결과는 E 8에 이 그림에 나와 있습니다. GFP 단백질은 여기에서 이러한 전체 마운트 이미지에 의해 표시된 바와 같이 tum에서 강하게 발현됩니다.

패널 A는 명시야 이미지입니다. 패널 B는 GFP 이미지이고 패널 C가 나타납니다. 또한, E의 tectum 섹션에서 패널 D에서 녹색으로 시각화 된 9 개의 GFP 단백질과 패널 E에서 빨간색으로 시각화 된 CAD 7 개의 단백질이 패널 F의 노란색으로 표시된 것과 같이 공동 발현됩니다. 올바르게 수행되면 X ovo electroporation의 효율은 60 내지 100 %입니다.이 결과는 X ovo electroporation이 생체 내에서 더 오래된 닭 배아로 유전자 전달을 위한 성공적인 방법임을 시사합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 더 오래된 닭 배아로 유전자 전달을 수행하는 방법과 실험의 행운을 잘 이해하게 될 것입니다.