교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

이 라벨링 방법론의 전반적인 목표는 시냅스 소포 세포내이입(synaptic vesicle endocytosis)을 측정하는 것입니다. 이 방법은 형성된 내포성 소포체의 분산과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이미징 중 해상도와 세포의 전체 구조를 검사하여 변화를 시각화할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 에폭시를 준비하는 동안 작은 기포를 제거하지 못하거나 에탄올 세척 중에 샘플을 건조시키지 못하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 0.01% 멸균 여과된 폴리-디-라이신 용액 1.5ml를 각 웰에 실온에서 1시간 동안 도포한 다음 멸균수로 3회 세척하여 폴리-디-라이신 코팅된 6웰 플레이트를 준비합니다. 다음으로, 무 과산화효소로 고칼륨 자극 용액을 준비하고 5몰 수산화나트륨으로 용액을 pH 7.4로 조정합니다.

그 후, 1.5ml의 고칼륨 자극 용액을 실온에서 각 웰에 90초 동안 첨가하여 해마 뉴런 배양을 자극합니다. 이 단계에서는 pH 7.4에서 0.1몰 나트륨 카코딜레이트 완충액을 준비합니다. 0.1몰 카코딜산나트륨 완충액에 4%글루타르알데히드로 세포를 실온에서 최소 1시간 동안 고정한 다음 0.1몰 카코딜산나트륨 완충액으로 7분 동안 매번 세포를 3회 세척합니다.

그런 다음 DAB 용액을 준비하고 0.22마이크로미터 필터로 여과합니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 30분 동안 1.5ml의 DAB 용액을 세포에 바르고 7분 동안 매번 0.1몰 카코딜레이트 나트륨 완충액으로 세포를 세 번 세척합니다. 고정 후로, 0.1몰 카코딜레이트 나트륨 완충액에 1.5ml의 1% 오스뮴 테트록사이드를 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.

그 후, 1.5ml의 0.1몰 카코딜레이트 나트륨 완충액으로 7분 동안 뉴런을 세 번 씻습니다. 그 후, 아세트산 나트륨과 빙산이 함유된 0.1몰 아세트산 나트륨 완충액을 준비합니다. 1.5ml의 0.1몰 아세테이트 완충액으로 세포를 3회 세척할 때마다 7분 동안 세척합니다.

그 후, 0.1 몰 아세테이트 완충액에 1.5 밀리리터의 1 % 우라닐 아세테이트로 세포를 섭씨 4 도에서 1 시간 동안 배양 한 다음 1.5 밀리리터의 0.1 몰 아세테이트 완충액으로 매번 7 분 동안 세포를 3 회 세척합니다. 흄 후드에서 50%70%와 90%에탄올로 1.5ml를 한 번 세척하여 7분 동안 신경세포 배양을 탈수한 다음 1.5ml의 100% 에탄올로 매번 7분 동안 3회 세척합니다. 다음으로 에폭시 수지를 만들고 충분히 혼합하여 진공 상태에서 보관하여 기포를 제거합니다.

셰이커에서 에탄올에 에탄올을 50% 에폭시 수지로 교체하여 실온에서 30분 동안 사용한 다음 셰이커에서 실온에서 30분 동안 에탄올에 70% 에폭시 수지를 교체하여 샘플을 침투시킵니다. 에폭시 수지 용액을 100% 에폭시 수지로 전환하고 섭씨 50도에서 10분 동안 배양합니다. 새로운 100% 에폭시 수지를 두 번 교환하고 각 교환을 섭씨 50도에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 새로운 100% 에폭시 수지를 넣고 하룻밤 동안 섭씨 50도에서 굳힌 다음 섭씨 60도에서 36시간 이상 굳히십시오. 그런 다음 드릴러의 톱으로 멀티 웰 플레이트에서 각 샘플을 제거합니다. 도립 광 현미경을 사용하여 세포가 밀집되어 있는 관심 영역을 선택한 다음 절단을 위해 4 x 5 x 8mm 입방체 블록을 자릅니다.

그 후, 1% 수성 우라닐 아세테이트를 15분 동안 침수한 다음 3% 수성 납 시트레이트를 5분 동안 침수하여 단면을 대조하여 샘플의 대비를 개선합니다. 본 연구에서는 배양된 뉴런에서 전자현미경을 실시하고 클라트린으로 코팅된 소포를 자극이 없는 상태에서 90초 동안 HRP 1밀리리터당 5밀리그램으로 배양한 대조군 샘플과 비교하여 검사했습니다. 클라트린으로 코팅된 구덩이는 자극이 없을 때 부톤당 0.05의 확률로 관찰되었습니다.

이 이미지에서, 높은 칼륨 유도 벌크 엔도솜 및 시냅스 소포 흡수를 동반한 자극은 HRP 라벨링에 의해 확인되었습니다. 시냅스 소포는 직경이 50나노미터 미만인 소포로 정의되었고, 벌크 엔도솜은 직경이 80나노미터 이상이거나 단면적이 80나노미터 이상인 것으로 정의되었습니다. 유도된 벌크 엔도솜 흡수는 생리식염수로 회복함으로써 감소하였다.

일단 마스터하면 이 기술을 8-1/2시간 안에 완료할 수 있으며 적절하게 수행하면 에폭시를 경화시키기 위해 3일이 더 걸립니다. 이 절차에 따라 자극 회복의 다양한 지점에서 표적 단백질의 분포와 같은 추가 질문에 답하기 위해 면역금 표지와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 전자 현미경에 의한 이미징을 준비하기 위해 샘플을 안정화하고 염색하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.