Wizualizacja naprawy błony komórkowej za pośrednictwem MG53 przy użyciu systemów in vivo i in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest ocena zdolności naprawczej błony zarówno w komórkach zwierzęcych, jak i izolowanych. Izolowane włókna mięśni szkieletowych są zbierane i otaczane pożywką zawierającą barwnik FM 1 43. Laser UV jest następnie używany do naświetlania i uszkadzania części błony komórkowej, aby umożliwić wejście barwnika do komórki.

Izolowane komórki są transfekowane plazmotycznym DNA eksprymującym GFP MG 53, który lokalizuje się w błonie plazmatycznej i cytozolu komórki. Końcówka mikroelektrody jest następnie wkładana do membrany C two C 12 w celu wywołania uszkodzenia. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na translokację GFP MG 53 do miejsca urazu.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ praktyki wymagane są do opanowania technik penetracji mikroelektrod i izolacji włókien mięśniowych. Procedurę zademonstrują dr Lin, kierownik naszego laboratorium, dr Wazu, doktorant Matt Orange, doktorant i dr Shaza, adiunkt naukowy na naszym wydziale. Na początek umieść tacę lub niebieską podkładkę laboratoryjną pod bieżnią, aby zbierać odpady od zwierząt podczas eksperymentu.

Następnie ustaw kąt nachylenia powierzchni bieżni. Niektóre bieżnie mają zintegrowane urządzenie do regulacji nachylenia, podczas gdy inne wymagają podniesienia bieżni w inny sposób. Zwykle stosuje się płaską powierzchnię lub kąt od siedmiu do 15 stopni w dół lub pod górę.

Zaaklimatyzuj myszy, umieszczając je na bieżni przy wyłączonej sieci elektrycznej i włączonym silniku napędu pasowego, ale nie poruszając się przez 15 minut po okresie aklimatyzacji, włącz motywacyjną sieć elektryczną. Uruchom bieżnię z początkową prędkością około pięciu metrów na minutę. Przy prędkości wzrastającej co minutę o jeden do dwóch metrów na minutę, zwierzę może się rozgrzać pięciominutowym okresem.

Powtarzaj ten okres rozgrzewki codziennie przez trzy do 10 dni, aby zwiększyć zgodność podczas testowania. Aby przeprowadzić ćwiczenie na ostre wyczerpanie. Z czasem zwiększaj prędkość bieżni, aż do osiągnięcia maksymalnej prędkości i monitoruj oznaki wyczerpania.

Zwierzę uważa się za wyczerpane, gdy spędza więcej niż połowę czasu poza bieżnią lub pięć kolejnych sekund na siatce. Wyjmij wyczerpaną mysz i zapisz całkowity czas działania. Trening wytrzymałościowy.

Uruchomione protokoły rozpoczynają się od tej samej procedury rozgrzewki. Jednak maksymalna prędkość jest na ogół niższa, a czas pracy może być dość długi. Po przetestowaniu zwróć myszy do ich domowej klatki i wyczyść bieżnię 70% etanolem.

Odizoluj powierzchowną warstwę mięśnia zginacza palca krótkiego od stopy w celu dalszej analizy. Najpierw przetnij skórę podeszwy na linii środkowej, uważając, aby nie uszkodzić mięśnia pod spodem. Następnie wykonaj poziome nacięcia i usuń skórę.

Zidentyfikuj płaskie białe ścięgno mięśnia FDB przyczepionego do kości piętowej. Użyj kleszczy, aby oddzielić, a następnie odciąć ścięgno w pobliżu miejsca przyczepu. Delikatnie pociągnij ścięgno do góry, jednocześnie odcinając tkankę łączną.

Zlokalizuj miejsce, w którym dystalne ścięgna rozgałęziają się na poszczególne palce. Przetnij ścięgna w miejscu, w którym łączą się z głębszą warstwą mięśni i usuń FDB. Umieść pęczek mięśni FDB w jednym mililitrze roztworu kolagenazy Rozgrzej się do 37 stopni Celsjusza.

Przyklej rurkę poziomo do wytrząsarki orbitalnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i potrząsaj z prędkością 200 obr./min przez 65 minut. Wystarczające trawienie charakteryzuje się lękliwym wyglądem i bladym kolorem. Odetnij koniec jednomililitrowej końcówki pipety, aby umożliwić przejście strawionego pakietu.

Z łatwością przenieś pakiet do probówki wirówkowej zawierającej około 600 mikrolitrów 2,5. Wapń tyro. Delikatnie obróć tubę, aby strząsnąć luźne włókna z wiązki.

Następnie odetnij koniec końcówki pipety o pojemności 30 mikrolitrów, tak aby średnica była tylko nieznacznie mniejsza niż wiązka mięśni. Użyj tej końcówki, aby wciągnąć wiązkę do pipety, a następnie wepchnij ją z powrotem do roztworu. Powtarzaj ten proces, aż większość włókien zostanie oddzielona od wiązki.

Wymieszaj oddzielone włókna, delikatnie obracając rurkę. Usuń żądaną ilość i upuść na szklaną płytkę z dnem delta T. Przechowuj pozostałe włókna w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około sześć godzin do wykorzystania i dodatkowych badań.

Pozostaw danie w spokoju na pięć minut. Dzięki temu włókna przylegają do szklanego dna naczynia. Umieść szklane dno naczynia na mikroskopie konfokalnym wyposażonym w laser UV.

Obserwuj włókna pod mikroskopią fazową przy powiększeniu większym niż 100 razy, aby sprawdzić obecność normalnego wzoru prążkowania i prostego kształtu przypominającego pręt. Dodać matryce do krocza styropianowego FM 1 43 lub FM 4 64 do roztworu do końcowego stężenia 2,5 mikromolowego. Ustaw włókno pod kątem 45 stopni od lewego górnego rogu pola widzenia do prawego dolnego rogu, aby wywołać uszkodzenie.

Naświetlić obszar błony plazmatycznej o wymiarach pięć na pięć. Używając lasera UV ustawionego na maksymalną moc przez pięć sekund, napromieniowany obszar powinien rozciąć błonę plazmatyczną, która jest połową pudełka pięć na pięć, powinna znajdować się wewnątrz włókna, podczas gdy pozostała część powinna znajdować się na zewnątrz włókna, przechwytując obrazy wejścia barwnika do włókna w odstępach pięciu sekund każdy przez maksymalnie pięć minut. Tylko trzy włókna mogą być napromieniane na naczynie, ponieważ barwnik fluorescencyjny ostatecznie zostanie endocytozą do włókna i skomplikuje analizę danych.

Po użyciu trzech włókien należy przygotować nowe danie. Korzystając z oprogramowania analitycznego, oblicz zmianę intensywności fluorescencji na obszarze około 200 mikronów kwadratowych w celu porównania między włóknami. Poniższe obliczenia należy wykonać dla każdej ramki delta F podzielonej przez F zero, gdzie F zero jest średnią fluorescencją obszaru zainteresowania w pierwszej uchwyconej ramce, a delta F jest zmianą fluorescencji w każdej kolejnej ramce.

Stosować standardowe metody transfekcji komórek z plazmidowym DNA eksprymującym GFP MG 53. Następnie przygotuj mikropipety. Umieść kapilę Pyrex na mikropipecie.

Ciągnij i ciągnij według zaprogramowanego programu. Podłącz mikropipetę do trzyosiowej kultury mikromanipulatora. Pożywka jest usuwana z szalki delta T i zastępowana 2,5-milimolowym buforem wapniowo-tyro

Umieść naczynie zawierające transfekowane komórki na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym z obiektywem zanurzeniowym w oleju 40 x 1,3 NA. Wywołaj ostre uszkodzenie żywych komórek, wkładając mikropipetę do błony komórkowej, a następnie szybko wycofując mikropipetę z komórki. Zbieraj kolejne obrazy żywych komórek w odstępach 1,54 sekundy na klatkę w celu przerwania błony wywołanej troponiną.

PERFU 0,005% troponiny w tempie około jednego mililitra na minutę bezpośrednio nad obrazowaną komórką. Bieżnia może być używana do pomiaru zmniejszenia zdolności biegowej. Widziane tutaj myszy z nokautem MG 53 mają zmniejszoną zdolność do biegania z powodu uszkodzenia mięśni szkieletowych.

Zakres uszkodzeń spowodowanych przez laser UV zależy od zdolności naprawczej błony widzianego włókna. Oto włókno przed kontuzją u normalnej myszy. To zdjęcie zostało zrobione 200 sekund później i pokazuje lekkie obrażenia.

Włókno mięśniowe pochodzące od myszy z nokautem MG 53 z upośledzoną zdolnością naprawy błony będzie wykazywać bardziej znaczące wejście barwnika po zaobserwowanym urazie. Oto przykład nieuszkodzonej rurki myo G MG 53 transfekowanej C two C 12. Strzałka na tym zdjęciu wskazuje na GFP MG 53 zawierającą pęcherzyki, które poruszają się w kierunku miejsc uszkodzenia.

W tym przykładzie saponina została użyta do uszkodzenia błony plazmatycznej. Zwróć uwagę na translokację GFP MG 53 z cytozolu do błony komórkowej po urazie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o odizolowaniu dobrych włókien mięśniowych z gładkimi błonami mięśniowymi i wyraźnymi wzorami prążków.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić zdolność naprawczą błony mięśniowej i kultury, komórek.