Métodos Básicos em Biologia Celular e Molecular

Muitos experimentos biomédicos requerem manipulação de uma quantidade conhecida de células, a fim de alcançar dados precisos, reprodutíveis e estatisticamente relevantes. Portanto, aprender a contar células é uma técnica particularmente essencial para qualquer cientista biomédico bem sucedido. A maneira mais comum de contar células é usando um hemacítmetro - um instrumento que carrega duas grades gravadas a laser, que ajudam na enumeração de uma célula aliquot sob um microscópio de luz simples.

As linhas celulares são frequentemente utilizadas em experimentos biomédicos, pois permitem a rápida cultura e expansão de tipos celulares para análise experimental. As linhas celulares são cultivadas em condições semelhantes quando comparadas a células recém-isoladas, ou primárias, mas com algumas diferenças importantes básicas: (i) as linhas celulares requerem seus próprios coquetéis específicos de fator de crescimento e (ii) seu crescimento deve ser mais monitorado do que as células...

A reação em cadeia de polimerase, ou PCR, é uma técnica usada para amplificar o DNA através do termociclismo – ciles de temperatura mudam em intervalos de tempo fixos. Usando uma polimerase de DNA termoestável, o PCR pode criar numerosas cópias de DNA a partir de blocos de construção de DNA chamados dNTPs. Há três etapas no PCR: desnaturação, ressarcialização e alongamento. A desnaturação é o primeiro passo do ciclo e faz com que o DNA derreta, interrompendo as ligações de hidrogênio entre as...

Eletroforese de gel de DNA é uma técnica usada para detecção e separação de moléculas de DNA. Um campo elétrico é aplicado a uma matriz de gel composta por agarose, e dentro do gel, partículas de carga migrarão e se separarão com base no tamanho. Os fosfatos carregados negativamente da espinha dorsal do DNA fazem com que fragmentos de DNA se movam em direção ao ânodo - um eletrodo carregado positivamente. O vídeo explica o mecanismo pelo qual fragmentos de DNA são resolvidos em um gel de...

Sulfato de sulfato de sódio Poli-Acrilamida Gel Electrophoresis, ou SDS-PAGE, é uma técnica amplamente utilizada para separar misturas de proteínas com base em seu tamanho e nada mais. SDS, um detergente aniônico, é usado para produzir uma carga uniforme em todo o comprimento das proteínas que foram linearizadas. Primeiro carregando-os em um gel feito de poliacrilamida e, em seguida, aplicando um campo elétrico ao gel, as proteínas revestidas de SDS são então separadas. O campo elétrico atua...

Transformação é o processo que ocorre quando uma célula ingere DNA estranho de seu entorno. A transformação pode ocorrer na natureza em certos tipos de bactérias. Na biologia molecular, a transformação é artificialmente reproduzida em laboratório através da criação de poros em membranas celulares bacterianas. Células bacterianas capazes de tirar DNA do ambiente são chamadas de células competentes. Em laboratório, as células bacterianas podem ser competentes e o DNA posteriormente introduzido...

O termo "transformação" refere-se à ingestão celular de DNA estranho. Na natureza, a transformação pode ocorrer em certos tipos de bactérias. Na biologia molecular, no entanto, a transformação é artificialmente induzida através da criação de poros nas paredes celulares bacterianas. Células bacterianas capazes de tirar DNA do ambiente são chamadas de células competentes. Células eletrocompetntes podem ser produzidas em laboratório e a transformação dessas células pode ser alcançada através...

Um ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) é normalmente realizado para detectar a presença e/ou quantidade de uma proteína alvo de interesse dentro de uma amostra experimental. A detecção da proteína alvo é possível por anticorpos, que fazem do ELISA um imunoensaio. Através de uma série de etapas de incubação e lavagem, esses anticorpos, que são frequentemente ligados, ou conjugados, a uma enzima, detectarão o revestimento de proteínas na parte inferior de um poço em uma placa de...

Purificação plasmida é uma técnica usada para isolar e purificar DNA plasmídeo do DNA genômico, proteínas, ribossomos e a parede celular bacteriana. Um plasmídeo é um DNA pequeno, circular e de dois fios que é usado como portador de moléculas específicas de DNA. Quando introduzido em um organismo hospedeiro via transformação, um plasmídeo será replicado, criando numerosas cópias do fragmento de DNA em estudo. Neste vídeo, um procedimento generalizado passo a passo é descrito como realizar a...

A purificação de gel é usada para recuperar fragmentos de DNA após a separação eletroforética. A recuperação de DNA de um gel de agarose inclui três passos básicos: ligação, lavagem e eluição de uma coluna de sílica. Acredita-se que o DNA se liga à sílica na presença de sal alto através de uma ponte de sal. Após a ligação, o DNA é lavado de impurezas e elucido sob condições de baixo sal interrompendo essa interação. Este vídeo passa por um procedimento passo-a-passo generalizado para cortar...

Western Blotting é usado para identificar a presença de proteínas específicas em amostras eletroforeticamente separadas. Após a separação por uma técnica conhecida como sulfato de sódio de poliacrilamida de gel de gel eletroforese, ou SDS-PAGE, a transferência ocidental é usada para mover proteínas de um gel de poliacrilamida para um pedaço de membrana que prende as proteínas em suas respectivas localizações. Em seguida, as membranas são sondadas com anticorpos em um processo chamado...

Transfecção é o processo de inserção de material genético, como DNA e RNA duplo encalhado, em células de mamíferos. A inserção do DNA em uma célula permite a expressão, ou produção, de proteínas usando as próprias máquinas das células, enquanto a inserção do RNA em uma célula é usada para reduzir a produção de uma proteína específica, parando a tradução. Enquanto o local de ação para o RNA transfeinado é o citoplasma, o DNA deve ser transportado para o núcleo para transfecção eficaz. Lá, o...

Na biologia molecular, a ligadura refere-se à junção de dois fragmentos de DNA através da formação de uma ligação fosfodiester. Uma enzima conhecida como ligase catalisa a reação de ligadura. Na célula, as ligass reparam quebras de fios simples e duplos que ocorrem durante a replicação do DNA. Em laboratório, a liga ligase de DNA é usada durante a clonagem molecular para unir fragmentos de DNA de inserções com vetores – moléculas de DNA portadoras que replicarão fragmentos-alvo em organismos...

Enzimas de restrição ou endonucleases reconhecem e cortam DNA em uma sequência específica. Essas enzimas ocorrem naturalmente em bactérias como uma defesa contra bacteriófagos - vírus que infectam bactérias. Enzimas de restrição bacteriana cortam o DNA de bacteriófago invasor, deixando o DNA genômico bacteriano ileso devido à adição de grupos de metila. Este vídeo explica os princípios básicos das enzimas de restrição, incluindo: como as enzimas de restrição são nomeadas e os tipos de sites...

Clonagem molecular é um conjunto de métodos, que são usados para inserir DNA recombinante em um vetor - um portador de moléculas de DNA que replicará fragmentos de DNA recombinantes em organismos hospedeiros. O fragmento de DNA, que pode ser um gene, pode ser isolado de um espécime procariótico ou eucariótico. Após o isolamento do fragmento de interesse, ou inserir, tanto o vetor quanto a inserção devem ser cortados com enzimas de restrição e purificados. As peças purificadas são unidas...