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Neuroscience

एक समविद्युतविभव मस्तिष्क राज्य की प्रेरण neuronal excitability पर अंतर्जात synaptic गतिविधि के प्रभाव की जांच करने के लिए Published: March 31, 2016 doi: 10.3791/53576
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

Summary

यह प्रक्रिया एक समविद्युतविभव मस्तिष्क राज्य में जिसके परिणामस्वरूप, physiologically प्रासंगिक मस्तिष्क राज्यों के दौरान चल रही है और बिजली की गतिविधियों के पूर्ण उन्मूलन के बाद एकल न्यूरॉन्स से लंबे समय से स्थायी विवो intracellular रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करती है। पशु की शारीरिक स्थिरांक ध्यान से कृत्रिम कोमा की हालत के लिए संक्रमण के दौरान निगरानी कर रहे हैं।

Abstract

जिस तरह से न्यूरॉन्स प्रक्रिया की जानकारी अपने आंतरिक झिल्ली संपत्तियों पर और अभिवाही synaptic नेटवर्क की गतिशीलता पर दोनों निर्भर करता है। विशेष रूप से, endogenously जनित नेटवर्क गतिविधि है, जो दृढ़ता से सतर्कता के राज्य के एक समारोह के रूप में बदलता है, काफी न्यूरोनल गणना modulates। जांच करने के लिए कैसे अलग सहज मस्तिष्क की गतिशीलता एकल न्यूरॉन्स 'एकीकृत गुण को प्रभावित है, हम सोडियम pentobarbital के एक उच्च खुराक की एक प्रणालीगत इंजेक्शन के माध्यम से सभी मस्तिष्क गतिविधि विवो में दबाने में मिलकर चूहे में एक नया प्रयोगात्मक रणनीति विकसित की है। Cortical गतिविधियों, लगातार संयुक्त electrocorticogram (ECoG) और intracellular रिकॉर्डिंग द्वारा निगरानी की उत्तरोत्तर धीमा कर रहे हैं, एक स्थिर समविद्युतविभव प्रोफ़ाइल के लिए अग्रणी। यह चरम मस्तिष्क राज्य, एक गहरी कोमा में चूहे डाल, ध्यान प्रयोगों के दौरान पशु की शारीरिक स्थिरांक को मापने के द्वारा नजर रखी थी। intracellular recordings हमें विशेषताएँ और एक ही न्यूरॉन ऐसी नींद जगा चक्र में आई उन लोगों के रूप में physiologically प्रासंगिक cortical गतिशीलता, में एम्बेडेड के एकीकृत गुणों की तुलना करने की अनुमति दी है, और जब मस्तिष्क पूरी तरह से चुप था।

Introduction

किसी भी पर्यावरण उत्तेजनाओं या व्यवहार कार्यों के अभाव में, "आराम" मस्तिष्क बिजली की गतिविधि खोपड़ी से दर्ज किया जा सकता है की एक सतत स्ट्रीम, electroencephalographic (ईईजी) तरंगों के रूप में उत्पन्न करता है। इस अंतर्जात मस्तिष्क गतिविधि के intracellular सहसंबंधी पृष्ठभूमि झिल्ली वोल्टेज के उतार चढ़ाव (भी "synaptic शोर" के रूप में जाना जाता है), जो उत्तेजक और निरोधात्मक synaptic क्षमता है कि अभिवाही नेटवर्क 1,2 की चल रही गतिविधि प्रतिबिंबित का एक संयोजन से बना रहे हैं की विशेषता है। यह सहज गतिविधि आवृत्ति और सतर्कता के विभिन्न राज्यों के साथ आयाम में बदलता है। Excitability और एकल न्यूरॉन्स की जवाबदेही पर नेटवर्क गतिविधि के प्रभाव elucidating न्यूरो 3,4 की प्रमुख चुनौतियों में से एक है।

कई प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल अध्ययनों एकीकृत प्रॉपर्टीज पर चल रहे synaptic गतिविधि के कार्यात्मक प्रभाव का पता लगाया हैन्यूरॉन्स के एस। हालांकि, पृष्ठभूमि synaptic शोर से प्रभावित विभिन्न न्यूरोनल मापदंडों की भूमिका मायावी बनी हुई है। उदाहरण के लिए, झिल्ली विध्रुवण का मतलब स्तर पर सकारात्मक या नकारात्मक 5,6 7-9 संवेदी आदानों की क्षमता कार्रवाई क्षमता को गति प्रदान करने के साथ सहसंबद्ध पाया गया है। इसके अलावा, जबकि कुछ की जांच का सुझाव है कि झिल्ली क्षमता के उतार चढ़ाव, अभिवाही अन्तर्ग्रथनी आदानों की एक लगातार बदलती धारा से उत्पन्न, दृढ़ता से अपने इनपुट-आउटपुट संबंध 3,10-13 का लाभ नियमन द्वारा एकल न्यूरॉन्स की जवाबदेही को प्रभावित, दूसरों से संकेत मिलता है कि झिल्ली इनपुट चालकता में परिवर्तन निषेध shunting द्वारा मध्यस्थता झिल्ली में उतार-चढ़ाव 14,15 की भयावहता की परवाह किए बिना न्यूरोनल लाभ मिलाना के लिए पर्याप्त हैं। अंत में, हाल ही में जाग जानवरों पर प्रदर्शन अध्ययन पर जोर दिया है कि कैसे एक न्यूरॉन में संवेदी जानकारी के प्रसंस्करण के गंभीर रूप से सतर्कता एक के राज्य पर निर्भर करता हैएन डी वर्तमान व्यवहार मांग 16,17।

एक सरल रणनीति के लिए एक अत्यधिक परस्पर प्रणाली में एक भी प्रक्रिया के कार्यात्मक भूमिका स्पष्ट करने के लिए निर्धारित करने के लिए कैसे अपनी अनुपस्थिति विशेष प्रणाली के कामकाज बदल रहा है। इस विधि को बड़े पैमाने पर प्रयोगात्मक घावों या अलग मस्तिष्क क्षेत्रों 18-21 की निष्क्रियता, या विशिष्ट आयन चैनल 22,23 के औषधीय नाकाबंदी का उपयोग कर, तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है, उदाहरण के लिए। विशेष रूप से, यह अनावरण करने के लिए कैसे कार्यात्मक कनेक्टिविटी और नेटवर्क गतिशीलता एकल कोशिका गणना 24-27 को प्रभावित विवो में लागू किया गया है। हालांकि, तारीख को स्थानीय जोड़तोड़ न्यूरॉन्स की फायरिंग ब्लॉक और / या उनके बुनियादी biophysical गुणों उपद्रव आंशिक रूप से प्रभावी हो सकता करने का इरादा है और अपेक्षाकृत छोटे मस्तिष्क की मात्रा 28 तक सीमित हैं।

इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम इन विवो प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में एक नई विकसितचूहे दिया मस्तिष्क राज्य में दर्ज की गई एकल न्यूरॉन्स, यानी, पूरे दिमाग synaptic गतिविधि 29 की पूरी दमन के बाद प्राप्त उन लोगों के लिए एक विशेष नेटवर्क गतिशील में एम्बेडेड के electrophysiological गुणों की तुलना करने के लिए। नियंत्रण की स्थिति में, दो अलग cortical गतिशीलता उत्पन्न किया जा सकता है। नींद की तरह electrocorticographic (ECoG) पैटर्न सोडियम pentobarbital की उदार खुराक के इंजेक्शन से प्रेरित थे। वैकल्पिक रूप से, cortical गतिविधि जाग्रत (जागने की तरह पैटर्न) अंतर्निहित करने के लिए तुलनीय छोटे आयाम की तेज लहरों ECoG Fentanyl के इंजेक्शन द्वारा उत्पादित किया जा सकता है। बाद में, जबकि एक ही ECoG और intracellular रिकॉर्डिंग को बनाए रखने, अंतर्जात मस्तिष्क विद्युत गतिविधि का एक पूरा मुंह बंद सोडियम pentobarbital के एक उच्च खुराक, समविद्युतविभव ECoG और intracellular गतिविधियों की विशेषता के प्रणालीगत इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया गया था। क्योंकि इस तरह के एक चरम कोमा की प्रेरण घातक हो सकता था consequenजैविक कार्यों पर सीईएस, शारीरिक चर का एक सावधान और सतत निगरानी जरूरी था। इसलिए, हम सावधानी से दिल की धड़कन आवृत्ति, अंत ज्वार सीओ 2 एकाग्रता (ETCO 2), हे 2 संतृप्ति (एसपीओ 2) और चूहे की कोर तापमान प्रयोगों के दौरान पालन किया।

हम तेज microelectrodes, जो विशेष रूप से विवो में लंबी और स्थिर रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त हैं का उपयोग कर इन अलग-अलग राज्यों के दौरान एकल न्यूरॉन्स गुणों का मूल्यांकन। प्रक्रिया यहाँ वर्णित है, अन्य electrophysiological और इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ जोड़ा जा सकता है और अन्य पशु मॉडल के लिए बढ़ाया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं यूरोपीय संघ के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था (यह निर्देश 2010/63 / ईयू) और पशु प्रयोग पर चार्ल्स डार्विन नैतिक समिति ने मंजूरी दे दी। हम यहाँ प्रक्रिया हम नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में उपयोग का वर्णन है, लेकिन सबसे कदम हर किसी की विशिष्ट आवश्यकताओं मैच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

1. शल्य चिकित्सा की तैयारी

नोट: सभी चीरा और दबाव अंक को बार-बार स्थानीय संवेदनाहारी (lidocaine या Bupivacaine) के साथ घुसपैठ की जानी चाहिए। अगर एक मम्मियाँ तैयारी की आवश्यकता होती है कई संशोधनों को लागू किया जाना चाहिए वर्तमान प्रक्रिया, टर्मिनल है।

  1. दो स्थानीय स्तर पर अलग intraperitoneal (आईपी) इंजेक्शन में सोडियम pentobarbital (40 मिलीग्राम / किग्रा) और ketamine (50 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ एक चूहे anesthetize।
  2. पशु सामान्य संज्ञाहरण के तहत जाना और बार बार सत्यापित करें कि संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान उपलब्ध हो जाता है (बन्द रखो पाँव तक कोई प्रतिक्रिया) करते हैं। एक फ़े पर चूहे की जगहedback हीटिंग कंबल और 37 डिग्री सेल्सियस के आसपास कोर तापमान बनाए रखने के लिए एक गुदा जांच डालें।
  3. संवेदनाहारी एजेंट के बाद इंजेक्शन की सुविधा के लिए और दोहराया सुई punctures 30 से अंगों perforating से बचने के लिए पेरिटोनियल गुहा में एक कैथेटर रखें।
    1. पेट के निचले दाएं या बाएं चतुर्थ भाग के भीतर स्थित एक क्षेत्र के ऊपर का क्षेत्र - एक छोटा सा (3 मिमी ~ 2) के ऊपर हेयर क्लिप।
      नोट: लोमनाशक क्रीम का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. तेज कैंची या एक छुरी के साथ त्वचा पर 3 मिमी चीरा - एक 2 बनाओ। कुंद विच्छेदन का उपयोग करना, वसा और मांसपेशी परतों को हटाने तक पेरिटोनियल गुहा मनाया जाता है।
    3. गुहा में एक छोटे से कैथेटर के 2 सेमी और शल्य चिकित्सा गोंद के साथ घाव बंद - 1 के बारे में डालें।
      (। उदाहरण के लिए, 2 फ्रेंच - व्यास के अंदर 0.043 मिमी के लिए इसी): नोट व्यास और कैथेटर की कुल लंबाई कम से कम होना चाहिए मृत मात्रा को कम करने के लिए। Polyurethane नलियों सबसे उपयुक्त हैं।
    4. एक पाश और सिवनी टी बनाओवह त्वचा के लिए कैथेटर जगह में यह सुरक्षित करने के लिए।
  4. कृत्रिम श्वसन के दौरान वेंटिलेशन नियंत्रित करने के लिए एक सांस की नली ट्यूब को स्थापित करें।
    1. पिछले चरण के रूप में, ब्याज की क्षेत्र तैयार (1 - सही manubrium ऊपर श्वासनली में 2 सेमी), बालों को हटाने और त्वचा काटकर अलग कर देना।
    2. कुंद वसा और मांसपेशियों की पहली परतों काटना, तो एक तरफ लार ग्रंथि को स्थानांतरित और धीरे से मांसपेशियों के अंतिम परत विदारक से श्वासनली बेनकाब।
    3. ध्यान से श्वासनली के ऊपर ऊतकों को हटाने और छोटे संदंश का उपयोग कर इसे नीचे एक धागा स्लाइड। धागे के साथ एक सर्जन की गाँठ बनाओ लेकिन अभी तक यह तंग नहीं करते।
    4. दो उपास्थि के छल्ले के बीच श्वासनली transversally काटकर अलग कर देना। श्वासनली यदि किसी में झाड़ू खून।
    5. उचित व्यास के साथ एक सांस की नली ट्यूब डालें और धागा की गाँठ कस ट्यूब स्थिर सुरक्षित करने के लिए। अतिरिक्त स्थिरता के लिए धागा आगे श्वासनली ट्यूब के एक उच्च बिंदु पर संलग्न किया जा सकता है।
    6. Suturई घाव को बंद या शल्य चिकित्सा स्टेपल का उपयोग करें। यहाँ शल्य गोंद से बचें यदि सांस की नली ट्यूब पुन: उपयोग किया जा करने का इरादा है।
  5. एक stereotaxic फ्रेम में पशु स्थापित करें और ध्यान से निम्नलिखित शारीरिक चर की निगरानी: ECoG, एसपीओ 2, ETCO 2, हृदय गति और आंतरिक तापमान (एक इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम, ईसीजी के माध्यम से)। मॉनिटर और संज्ञाहरण और शारीरिक स्थिति का एक उचित गहराई रखने के लिए इन चर समायोजित करें। विशेष रूप से, सोडियम pentobarbital की एक छोटी खुराक (10 मिलीग्राम / किग्रा) यदि आवश्यक हो तो साथ संज्ञाहरण के पूरक है।
  6. दोनों आंखों पर आंख मरहम लागू सुखाना से बचने के लिए। सिर पर बाल क्लिप, एक अनुदैर्ध्य चीरा (~ 2 सेमी) बनाने के लिए और खोपड़ी एक छुरी या एक curette का उपयोग कर overlying संयोजी ऊतक बांटना।
  7. एक दंत ड्रिल के साथ एक छोटी सी (~ 1.5 मिमी व्यास) हित के क्षेत्र के ऊपर craniotomy बनाओ।
    नोट: यहाँ, प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था की नली क्षेत्र को निशाना बनाया जाता है (7 - 8 मिमी पूर्वकाल interaural लाइन के लिए, 4.5- 5.5 मिमी midline 31 को पार्श्व)। बार बार कुल्ला गर्मी नष्ट करने के लिए।
  8. अतिरिक्त ठीक संदंश का प्रयोग धीरे ड्यूरा में एक छोटा सा छेद बनाने के लिए। ECoG इलेक्ट्रोड जगह के लिए कपाल trepanation के भीतर एक ~ 0.5 मिमी क्षेत्र रिजर्व (अगले कदम देखें)। स्थायी रूप से कोर्टेक्स 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान (या कृत्रिम Cerebro-रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ) के साथ नम रखने के लिए।
  9. एक कम प्रतिबाधा (~ 60 kΩ) चांदी इलेक्ट्रोड (ECoG इलेक्ट्रोड) ड्यूरा पर रखें, नहीं तानिका द्वारा कवर cortical क्षेत्र से परहेज है, और सिर के दूसरे पक्ष पर एक खोपड़ी पेशी पर संदर्भ इलेक्ट्रोड जगह है।
  10. इस चरण में (पिछले सोडियम pentobarbital इंजेक्शन के बाद 30 मिनट) पर, आईपी कैथेटर के माध्यम से सोडियम pentobarbital (10-15 मिलीग्राम / किग्रा / एच) या fentanyl (3-6 माइक्रोग्राम / किग्रा / एच) के बार-बार इंजेक्शन द्वारा संज्ञाहरण बनाए रखें। पूर्व एक धीमी oscillatory, नींद की तरह, ECoG पैटर्न में परिणाम है, जबकि बाद के एक desynchronized, जागने की तरह, cortical प्रोफ़ाइल में परिणाम होगा।
  11. कृत्रिम वी समायोजित करेंentilation प्रणाली इतनी है कि सांस की आवृत्ति और मात्रा चूहे की सहज साँस लेने (सामान्य सीमा 70 - 115 साँस / मिनट 32) के उन लोगों के लिए समान हैं। फिर, सांस की नली ट्यूब के लिए यांत्रिक वेंटीलेशन कनेक्ट और उचित वक्ष पिंजरे मुद्रास्फीति (दोनों पक्षों पर) सत्यापित करें। यदि नहीं, सांस की नली अक्ष में वेंटिलेशन ट्यूबिंग की स्थिति को समायोजित। यदि आवश्यक हो, स्राव एक सिरिंज या एक वैक्यूम पंप से जुड़ा एक कैथेटर के साथ श्वासनली में मौजूद चूसना।
  12. सभी शारीरिक चर 32-35 और ECoG 29,36 पैटर्न को प्रतिबिंबित संज्ञाहरण के एक स्थिर शल्य चिकित्सा विमान, एक पैर में gallamine triethiodide की एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन करते हैं चूहे, 40 मिलीग्राम पंगु बना / पहला इंजेक्शन के लिए किलो और फिर 20 मिलीग्राम / किग्रा हर 2hr 19,29,36,50।

2. intracellular रिकॉर्डिंग

  1. एक ~ 0.2 माइक्रोन टिप के साथ एक गिलास micropipette (तेज microelectrode) खींचो जैसे अपने प्रतिरोध betwee पर्वतमालाn 50 और 80 MΩ एक बार 2 एम पोटेशियम एसीटेट (KAC) के साथ भर दिया।
  2. एक विशिष्ट धारक में पिपेट एक चांदी / चांदी क्लोराइड (एजी / AgCl) तार के साथ जगह (एक सिर चरण के माध्यम से) एक intracellular एम्पलीफायर को पिपेट समाधान कनेक्ट करने के लिए। धारक एक micromanipulator से जुड़ी होनी चाहिए। चूहे की गर्दन की मांसपेशियों पर एक एजी / AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड रखें।
  3. धीरे-धीरे ब्याज के क्षेत्र के लिए नीचे मस्तिष्क में पिपेट डालने और वर्तमान कदम के जवाब में चला जाता है वोल्टेज की निगरानी के द्वारा अपने प्रतिरोध को सत्यापित करें। पिपेट स्पष्ट करने के लिए अगर जरूरत एम्पलीफायर के Buzz का उपयोग (या जैप) बटन।
  4. craniotomy सिलिकॉन elastomer या 4% agarose के साथ इसे कवर मस्तिष्क आंदोलनों को कम करने से पहले (ECoG या intracellular इलेक्ट्रोड को छूने के लिए नहीं सावधान रहना) सुखाने के लिए कपास swabs या सिंथेटिक अवशोषण त्रिकोण का प्रयोग करें।
  5. इसके प्रतिरोध बढ़ जाती है जब तक 2 माइक्रोन कदम जब एक सेल के करीब पहुंच - 1 में पिपेट कम करें। तब penetra एम्पलीफायर की चर्चा समारोह का उपयोगन्यूरॉन में ते।

3. समविद्युतविभव राज्य प्रेरित

  1. जबकि एक साथ न्यूरॉन की झिल्ली क्षमता, ECoG और शारीरिक चर की निगरानी के इस स्तर पर उचित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल (जैसे, प्रतिक्रियाओं फायरिंग intracellularly इंजेक्ट करने धाराओं, वर्तमान वोल्टेज संबंध, संवेदी उत्तेजनाओं प्रतिक्रियाएं) प्रदर्शन करना।
  2. सुनिश्चित करें कि intracellular इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान दोनों झिल्ली क्षमता और संभावित कार्रवाई संपत्तियों की स्थिरता का विश्लेषण करके सेल में स्थिर है। यदि नहीं, तो अगले चरण पर जाएँ और फिर जब तक रिकॉर्डिंग स्थिर हो जाता इंतजार करना या दूसरे न्यूरॉन के लिए खोज नहीं है।
  3. सोडियम pentobarbital के एक उच्च लेकिन बुनियादी घातक खुराक इंजेक्षन आईपी लाइन के माध्यम से (~ 90 मिलीग्राम / किलो, pentobarbital प्रारंभिक हालत से 35 मिलीग्राम / किग्रा के रूप में और Fentanyl प्रारंभिक हालत से 155 मिलीग्राम / किलो तक के रूप में कम हो सकता है)।
    नोट: 15 के भीतर - 20 मिनट intracellular और ECoG वाveforms रुक-रुक कर बिजली चुप्पी के साथ धीमा क्षणिक तथाकथित "फट-दमन" तक पहुँचने के लिए प्रोफ़ाइल 37,38, जो उत्तरोत्तर एक पूरा समविद्युतविभव राज्य में गिर चाहिए। यह उम्मीद है कि दिल की दर काफी नीचे धीमा कर देती है (~ 10 से - 20%), लेकिन एसपीओ 2 और ETCO 2 अपेक्षाकृत स्थिर रहना चाहिए।
  4. समविद्युतविभव राज्य तक पहुँच नहीं है, तो सोडियम pentobarbital की एक छोटी राशि इंजेक्षन (~ 3.1 कदम खुराक का 10%)। अधिक संवेदनाहारी जोड़ने यदि समविद्युतविभव राज्य में अभी भी हासिल नहीं है इससे पहले 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  5. दर्ज न्यूरॉन के एकीकृत संपत्तियों पर नेटवर्क गतिशीलता के प्रभाव की तुलना करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल दोहराएँ।
    नोट: संवेदनाहारी इंजेक्शन की समाप्ति के बाद, बिजली के मस्तिष्क की गतिविधियों को पूरी तरह से 3 से 4 घंटा के भीतर ठीक करना चाहिए।
  6. (200 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) चूहा euthanize करने के लिए प्रयोग के अंत में, सोडियम pentobarbital की एक घातक खुराक इंजेक्षन।

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Representative Results

उत्प्रेरण और एक समविद्युतविभव मस्तिष्क स्थिति बनाए रखने के विवो प्रयोगात्मक प्रक्रिया में एक नाजुक है। यह सीधे न्यूरोनल excitability और हस्तांतरण समारोह 29 पर cortical नेटवर्क गतिविधि के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित हुई किया गया है। चित्रा 1 मल्टी पैरामीटर से पहले (चित्रा 1 ए ECoG और महत्वपूर्ण स्थिरांक सहित निगरानी, ​​पशु की शारीरिक स्थिति का पता चलता है, ) और बाद में (चित्रा 1 बी) समविद्युतविभव राज्य की प्रेरण।

आकृति 1
चित्रा 1. नियंत्रण और समविद्युतविभव शर्तों में शारीरिक मापदंड की निगरानी करना।
ए और बी, सक्रिय cortical राज्य (ए) और बाद के चरणों के दौरान ECoG (ऊपर निशान) और शारीरिक मापदंड के साथ रिकॉर्डिंगequent समविद्युतविभव अवधि (बी)। कोर तापमान (अस्थायी।), ETCO 2 और एसपीओ 2 प्रयोग के दौरान अनिवार्य रूप से स्थिर हैं। दिल की धड़कन की दर, इसके विपरीत, उत्तरोत्तर समविद्युतविभव राज्य की प्रेरण के बाद कम हो जाती है (382 349 के लिए धड़क रहा है / मिनट से), के रूप में ईसीजी पर देखा। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

नियंत्रण सत्र के दौरान, शारीरिक मापदंड स्वस्थ और जाग जानवरों 32-35 में मापा जाता है उन लोगों के लिए इसी तरह के थे और समविद्युतविभव राज्य के शामिल होने के बाद अप्रभावित रहीं, चित्रा (1) दिल की दर था कि थोड़ा धीमा के लिए छोड़कर। यह एक महत्वपूर्ण बिंदु के बाद से हाइपोक्सिया 39 या 40 hypercapnia स्पष्ट रूप से neuronal excitability को बदल सकते हैं और इस तरह एक घुड़साल में एक गंभीर पूर्वाग्रह को पेश कर सकते है Y न्यूरोनल एकीकृत संपत्तियों की एक मस्तिष्क राज्य पर निर्भर मॉडुलन की खोज।

हम cortical गतिशीलता नींद के प्रारंभिक दौर (चित्रा 2AA, बाएं पैनल) के दौरान या जागने (चित्रा 2AB, बाएं पैनल) के दौरान endogenously जनित नकल उतार दो अलग प्रारंभिक स्थितियों से समविद्युतविभव स्थिति प्राप्त की। इन सक्रिय राज्यों या तो सोडियम pentobarbital (नींद की तरह) या Fentanyl के इंजेक्शन से प्रेरित थे (जागने की तरह)। दोनों ही मामलों में, सोडियम pentobarbital के एक उच्च खुराक के बाद इंजेक्शन ECoG में सहज गतिविधि और एक साथ दर्ज न्यूरॉन्स (चित्रा 2AA और बी, सही पैनल), इसलिए शब्द समविद्युतविभव की एक पूर्ण उन्मूलन में हुई। चल रहे synaptic गतिविधि का दमन न्यूरोनल झिल्ली क्षमता (चित्रा 2 बी) की एक महत्वपूर्ण स्थिर hyperpolarization में हुई।

टी "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "> चित्र 2
चित्रा 2 पर झिल्ली क्षमता का सहज गतिशीलता synaptic गतिविधि दमन का नतीजा।
(ए) नींद की तरह (ए क) और जागने की तरह (ए बी) पैटर्न (बाएं पैनल), और इसी के बाद के समविद्युतविभव युगों के दौरान के दौरान ECoG (ऊपर निशान) और intracellular गतिविधियों (इंट्रा, नीचे निशान) का एक साथ प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग (बार दमनकारी इंजेक्शन के बाद संकेत दिया पर; समविद्युतविभव, सही पैनल)। ECoG संकेतों के समय आवृत्ति विश्लेषण (0 के लिए ऊर्जा घनत्व - 50 हर्ट्ज आवृत्ति रेंज) रंग तराजू से दिखाया गया है। (बी) संभावना घनत्व (पी) झिल्ली क्षमता मूल्यों की (वीएम, बिन आकार 0.5 एम वी, रिकॉर्डिंग के 10 सेकंड) न्यूरॉन्स पैनल ए में सचित्र यह आंकड़ा अनुमति के साथ, संशोधित किया गया है, रेफरी 29 से से।/ftp_upload/53576/53576fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस चरम मस्तिष्क राज्य के कार्यात्मक प्रभाव को वर्णन करने के लिए, हम समविद्युतविभव न्यूरॉन्स के निष्क्रिय और सक्रिय आंतरिक गुणों निकाले और उन्हें इसी प्रारंभिक स्थिति के दौरान मापा उन लोगों के साथ तुलना में। इस रणनीति का उपयोग करना, हम पता चला है कि न्यूरॉन्स समविद्युतविभव के दौरान राज्य के वर्तमान depolarizing, प्रदर्शन के intracellular इंजेक्शन के जवाब में कार्रवाई की क्षमता आग सकता है कि वे पूरी तरह से उत्तेजनीय बने पृष्ठभूमि synaptic गतिविधि (चित्रा 3AA और बी, समविद्युतविभव) की पूरी दमन के बाद भी। इसके अलावा, हमने पाया है कि न्यूरॉन्स के हस्तांतरण समारोह, फायरिंग आवृत्ति तीव्रता में वृद्धि (एफआई संबंध) के वर्तमान depolarizing के कदम से प्रेरित मापने के द्वारा मूल्यांकन, प्रारंभिक सक्रिय की स्थिति की तुलना में सही-स्थानांतरित कर दिया गया है, यह दर्शाताकमजोर उत्तेजक आदानों (चित्रा 3 बी) के लिए न्यूरॉन्स की संवेदनशीलता में कमी। इसी न्यूरोनल लाभ, यानी, वित्तीय वक्र के ढलान, अपरिवर्तित रहे या कम हो गया था जब नियंत्रण राज्य sleep- या जागने प्रकार क्रमश: (चित्रा 3 बी) का था। हैरानी की बात है, न्यूरॉन्स के स्पष्ट इनपुट प्रतिरोध काफी नियंत्रण सक्रिय शर्तों (चित्रा 3AA, ख) की तुलना में synaptic ड्राइव के अभाव में संशोधित नहीं किया गया था। जनसंख्या विश्लेषण और सक्रिय और समविद्युतविभव की स्थिति में न्यूरॉन्स के अस्थायी फायरिंग पैटर्न की मात्रा का ठहराव सहित अधिक परिणाम, हमारी प्रारंभिक पेपर 29 में उपलब्ध हैं।

चित्र तीन
चित्रा 3. पर झिल्ली गुण और इनपुट-आउटपुट संबंध तीन चमड़ा गतिविधि पैटर्न का तुलनात्मक प्रभाव।
(ए) voltag ई प्रतिक्रियाएं (मध्य निशान) somatosensory cortical न्यूरॉन्स depolarizing के लिए और hyperpolarizing वर्तमान दालों (नीचे निशान) की नींद-तरह के दौरान (ए क) और जागने की तरह (ए बी) ECoG पैटर्न (शीर्ष रिकॉर्ड) और synaptic गतिविधि के अभाव के बाद (समविद्युतविभव )। झिल्ली इनपुट प्रतिरोध (आर एम, मूल्यों संकेत कर रहे हैं) वोल्टेज बूँदें (ग्रे निशान, 20 परीक्षणों के औसत) hyperpolarizing वर्तमान नाड़ी इंजेक्शन (-0.4 एनए) से प्रेरित से मापा गया था। (बी) इसी FI घटता, न्यूरॉन्स पैनल (ए) में सचित्र के हस्तांतरण समारोह प्रदान करते हैं। फायरिंग की दर बढ़ रही तीव्रता के वर्तमान दालों (200 मिसे अवधि) depolarizing के जवाब में मापा गया था। प्रत्येक वर्तमान तीव्रता 20 बार लागू किया गया था और इसी फायरिंग दरों औसतन थे। धराशायी लाइनों सेल प्रतिक्रिया (ए) में दिखाया गया है संकेत मिलता है। यह आंकड़ा अनुमति के साथ, संशोधित किया गया है, रेफरी 29 से।अपलोड / 53576 / 53576fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम यहाँ दोनों नेटवर्क और सेलुलर स्तर पर विवो सहज मस्तिष्क बिजली की गतिविधि में दबाने के लिए एक नई विधि का वर्णन है। यह प्रक्रिया एक चरम मस्तिष्क राज्य, समविद्युतविभव कोमा 41 के रूप में जाना होता है। देखने के एक नैदानिक ​​बिंदु से, इस तरह के एक electrocerebral निष्क्रियता सबसे गंभीर विषमता है कि ईईजी पर देखा जा सकता है। यह ज्यादातर एक अपरिवर्तनीय कोमा साथ जुड़ा हुआ है, सभी रोगियों को या तो मर रहा है या एक लगातार बेहोशी की हालत 42 में जारी रखने के साथ, लेकिन जब केंद्रीय तंत्रिका तंत्र अवसाद दवाओं (जैसे thiopental के रूप में) के साथ एक नशे की वजह से कम से कम आंशिक रूप से उलट हो सकता है, एक आकस्मिक हाइपोथर्मिया 42 या एक asphyxial हृदय की गिरफ्तारी 43। हमारे प्रयोगात्मक प्रतिमान में, समविद्युतविभव राज्य उत्तरोत्तर अधिक मात्रा में सोडियम pentobarbital की एक प्रणालीगत इंजेक्शन, जो पहले तेजी से ECoG आवृत्ति सामग्री में कमी लाती है, तो एक "फट-दमन" मोड द्वारा हासिल की है41,42, एक पूरी तरह से फ्लैट ECoG करने के लिए अंत में अग्रणी। intracellular स्तर पर, सहज गतिविधि के लापता होने depolarizing के सहवर्ती कमी और hyperpolarizing झिल्ली क्षमता में उतार-चढ़ाव के साथ एक समान समय पाठ्यक्रम निम्नानुसार है। इस प्रकार, यह धारणा जा सकता है कि सोडियम pentobarbital के इंजेक्शन पहली synaptic निरोधात्मक संचरण गतिविधि फायरिंग cortical न्यूरॉन्स की कमी करने के लिए अग्रणी बढ़ जाती है, उत्तेजक और निरोधात्मक synaptic प्रसारण कि आखिर समविद्युतविभव ECoG और intracellular गतिविधियों 29,44 में परिणाम के प्रगतिशील उन्मूलन। समविद्युतविभव ECoG पैटर्न के लिए सक्रिय रूप से इसी तरह के बदलाव के इस तरह के ketamine (व्यक्तिगत अवलोकन) या isoflurane 45,46 के रूप में अन्य संवेदनाहारी एजेंट के प्रशासन के बाद प्राप्त किया जा सकता है।

प्रक्रिया अपेक्षाकृत सरल प्रकट हो सकता है। हालांकि, के लिए बेहद गहरे कोमा प्रेरित, भीतर बुनियादी शारीरिक चर को बनाए रखने के कारणसामान्य सीमाओं प्रयोग की सफलता के लिए सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण है। ETCO 2 के उतार चढ़ाव में परिवर्तन एक बलगम प्लग श्वासनली में बनाने का नतीजा हो सकता है। ऐसी स्थिति में, वेंटीलेटर काट दिया जाना चाहिए और बलगम जल्दी से aspirated या सांस की नली ट्यूब के माध्यम से बाहर मिटा दिया है। इसके अलावा, तैयारी के यांत्रिक स्थिरता intracellular रिकॉर्डिंग के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, विशेष प्रयास, और craniotomy पर agarose लागू करने या सिलिकॉन elastomer द्वारा, नाड़ी और श्वसन स्पंदन को कम करते हुए एक उचित सांस की नली ट्यूबिंग संरेखण को बनाए रखने के ध्यान से सिर को जानवर के शरीर रिश्तेदार का समायोजन करके बनाया जाना चाहिए। यह भी एक लकवाग्रस्त एजेंट के इंजेक्शन से सहज मांसपेशियों में संकुचन से बचने के लिए आवश्यक है। अंत में, पर्यावरण कंपन और बिजली के शोर जितना संभव हो उतना कम किया जाना चाहिए। अन्य प्रकाशनों विस्तार स्थिर intracellular या पैच दबाना इजाजत दी विवो तैयार करने में एक इष्टतम के लिए आवश्यक कदम जोle-सेल रिकॉर्डिंग 29,47-50।

न्यूरोनल आंतरिक झिल्ली गुण और नेटवर्क गतिशीलता दसगुणा करने की क्षमता तंत्र है जिसके द्वारा व्यक्ति न्यूरॉन्स उनके अत्यधिक जुड़ा माहौल में जानकारी प्रक्रिया काटना करने के लिए आवश्यक है। के रूप में परिचय में कहा गया है, मौलिक न्यूरो के इस केंद्रीय मुद्दे को समर्पित पिछले अध्ययनों परस्पर विरोधी परिणाम के लिए नेतृत्व किया, आंशिक रूप से न्यूरॉन्स और जांच नेटवर्क और विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के विशिष्ट विशेषताओं के कारण, बनाम विवो तैयारियों में इन विट्रो सहित और, अंततः, अलग संवेदनाहारी प्रक्रियाओं का इस्तेमाल किया है (उदाहरण के लिए 29,36,51 देखें)। हम प्रस्ताव है कि वर्तमान दृष्टिकोण को मान्य है, और संभवतः सामंजस्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विवो प्रयोगों में इन विट्रो तैयारी में और से घटाकर से प्राप्त निष्कर्षों। वास्तव में, यह सीधे जांच करने और एक ही न्यूरॉन में और एक ही प्रयोगात्मक प्रक्रिया के पाठ्यक्रम में तुलना करने के लिए अनुमति देता हैअभिवाही अन्तर्ग्रथनी आदानों की अलग पैटर्न के प्रभाव, जागने-तरह की गतिशीलता से निष्क्रियता को पूरा करने के लिए, एक जीवित जानवरों में neuronal एकीकृत संपत्तियों पर।

इस प्रोटोकॉल की एक विशिष्ट विशेषता यह है कि, एक बार में महारत हासिल है, यह बहुआयामी जांच करने के लिए, इस तरह के एकाधिक सतह और गहराई ईईजी रिकॉर्डिंग, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट आधारित जांच संकेतकों और मस्तिष्क की भी रक्तसंचारप्रकरण और चयापचय इमेजिंग के रूप में अन्य प्रयोगात्मक तकनीक के साथ जोड़ा जा सकता है समविद्युतविभव मस्तिष्क के गुणों। नैदानिक ​​और नैदानिक ​​दृष्टिकोण के रूप में, जब से हम दिखा दिया है कि न्यूरॉन्स अभी भी लगातार समविद्युतविभव कोमा के दौरान उत्तेजनीय हैं, यह संवेदी जानकारी के प्रसंस्करण, उदाहरण के लिए cortical कार्यों का परीक्षण करने के लिए, रोगियों और पशु मॉडल मस्तिष्क के इस तरह के एक रोग राज्य में डूब का प्रासंगिक होगा निष्क्रियता।

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Acknowledgments

इस काम Fondation डी फ्रांस, संस्थान में राष्ट्रीय डी ला Santé एट डी ला Recherche MEDICALE, पियरे और मैरी क्यूरी विश्वविद्यालय और कार्यक्रम 'डी' INVESTISSEMENTS Avenir 'ANR-10-IAIHU-06 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital Centravet Pentobarbital
Ketamine 500 Merial Imalgène 500
Fentanyl  Janssen-Cilag Fentanyl
Xylocaine Centravet Xylovet
Gallamine triethiodide Sigma G8134
ECoG amplifier A-M Systems AC amplifier, Model 1700
Intracellular amplifier Molecular Devices Axoclamp 900A
Data acquisition interface Cambridge Electronic Design CED power 1401-3 
Data analysis software Cambridge Electronic Design Spike2 version 7
micromanipulator Scientifica IVM-3000
Capillary Puller Narishige PE-2
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-10
Silver wire 0.125 mm (intracellular recording) WPI AGT0525
Ag-AgCl reference Phymep E242
Silver wire 0.25 mm (ECoG recording) WPI AGT1025
Artificial respiration system Minerve Alpha Lab
Physiological parameters monitoring Digicare LifeWindow Lite
Heating Blanket Harvard Apparatus 507215
Stereomicroscope Leica M80
Scissors FST 15005-08
Forceps Dumont #5 FST 11295-10
Forceps Dumont #5SF FST 11252-00
IP Polyurethane catheter - 0.43x0.69 mm   Instech BTPU-027
Silicon elastomere WPI KWIK-CAST
Dental drill NSK Y1001151 and P496
Surgical glue 3M vetbond

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तंत्रिका विज्ञान अंक 109 intracellular रिकॉर्डिंग उत्तेजना synaptic गतिविधि ECoG समविद्युतविभव सेरेब्रल कॉर्टेक्स कोमा शारीरिक स्थिरांक
एक समविद्युतविभव मस्तिष्क राज्य की प्रेरण neuronal excitability पर अंतर्जात synaptic गतिविधि के प्रभाव की जांच करने के लिए<em&gt; Vivo</em
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