Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

אינדוקציה של מדינת איזואלקטרית מוח כדי לחקור את ההשפעה של פעילות סינפטית אנדוגני על העצבית רגישה Published: March 31, 2016 doi: 10.3791/53576
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

Summary

הליך זה מבצע ארוך שנמשכות in vivo הקלטות תאיות מתא עצב אחד במצבי מוח רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ואחרי ביטול מוחלט של פעילות חשמלית מתמשכת, וכתוצאה מכך במצב מוח איזואלקטרית. הקבועים הפיסיולוגיים של החיה מנוטרות בקפידה במהלך המעבר למצב בתרדמת המלאכותי.

Abstract

מידע תהליך נוירונים דרך תלוי הוא תכונות הממברנה הפנימיות שלהם ועל הדינמיקה של רשת הסינפטי מביא. בפרט, פעילות רשת שנוצרה באופן אנדוגני, אשר משתנית מאוד כפונקציה של מדינת ערנות, מודולציה חישוב עצבי משמעותי. כדי לחקור כיצד דינמיקת מוחות ספונטנית להשפיע נכסים אינטגרטיבית 'יחיד נוירונים, פתחנו אסטרטגיה ניסיונית חדשה בחולדה המורכבת בדיכוי in vivo כל הפעילות המוחית באמצעות הזרקה מערכתית של מינון גבוה של נתרן pentobarbital. פעילויות קורטיקלי, פיקוח רציף על ידי electrocorticogram המשולב (ECOG) והקלטות תאיות הם האטו בהדרגה, שמובילים פרופיל איזואלקטרית יציב. במצב המוח הקיצוני הזה, לשים את החולדה לתוך בתרדמת עמוקה, היה במעקב צמוד על ידי מדידה הקבועה הפיזיולוגית של החיה לאורך הניסויים. r התאיecordings אפשרה לנו לאפיין ולהשוות את המאפיינים אינטגרטיבי של אותו נוירון מוטבע לתוך הדינמיקה קליפת המוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, כמו לאלה נתקל מחזור השינה והערות, וכאשר המוח שתק לגמרי.

Introduction

בהעדר כל גירויים סביבתיים או משימות התנהגותיות, המוח "נח" מייצר זרם רציף של הפעילות החשמלית כי ניתן להקליט מהקרקפת, כמו electroencephalographic גלים (EEG). שהמקבילה התאית של פעילות מוחית אנדוגני זה מאופיין בתנודות מתח הממברנה רקע (הידוע גם בשם "רעש סינפטית"), אשר מורכבות משילוב של פוטנציאלים סינפטיים מעוררים ו מעכבות המשקפים את הפעילות השוטפת של רשתות מביאות 1,2. פעילות ספונטנית זה משתנה תדירות אמפליטודה עם מצבים שונים של ערנות. הבהרת את ההשפעה של פעילות הרשת על רגישות והיענות של יחיד נוירונים הוא אחד האתגרים הגדולים של מדעי המוח 3,4.

מחקרים ניסיוניים חישובית רבים בחנו את ההשפעה הפונקציונלית של פעילות סינפטית מתמשכת על propertie אינטגרטיביים של נוירונים. עם זאת, תפקידה של הפרמטרים העצביים השונים מושפעים רעשי הרקע הסינפטי נותר חמקמק. לדוגמה, הרמה הממוצעת של שלילת קוטביות הממברנה נמצאה חיובית 5,6 או לשלילה 7-9 בקורלציה עם היכולת של מסרים חושיים כדי לעורר פוטנציאל פעולה. יתר על כן, בעוד כמה חקירות מראות כי תנודות של פוטנציאל הממברנה, נובעות זרם משתנה ללא הרף של תשומות הסינפטי מביאות, מאוד משפיעות על התגובה של נוירונים בודדים על ידי ויסות הרווח של יחסי תשומה-התפוקה שלהם 3,10-13, אחרים מצביעים על כך שינויים במוליכות קלט קרום בתיווך מתגלגל על העיכוב מספיקים כדי לווסת את הרווח העצבי ללא קשר לעוצמת תנודות קרום 14,15. לבסוף, מחקרים שנעשו לאחרונה מתבצעות בעודם ערים הדגיש כיצד עיבוד המידע החושי ב נוירון בודד אנושות תלוי במצב של ערנותnd 16,17 הביקוש התנהגותיות הנוכחי.

אסטרטגיה פשוטה כדי להבהיר את התפקיד הפונקציונלי של תהליך נתון במערכת זו בזו קשר הדוק היא לקבוע כיצד העדרו במיוחד משנה את תפקוד המערכת. שיטה זו נעשה שימוש נרחב במחקר מדעי המוח, למשל באמצעות נגעים ניסיוני או איון של אזורי מוח שונים 18-21, או מצור תרופתי של תעלות יונים ספציפיים 22,23. יש לציין, זה יושם vivo לחשוף כיצד דינמיקת קישוריות רשת פונקציונלית להשפיע חישוב תא בודד 24-27. עם זאת, עד כה מניפולציות מקומיות נועדו לחסום הירי של נוירונים ו / או להפריע מאפייני biophysical הבסיסיים שלהם יכולות להיות יעיל באופן חלקי מוגבלים נפחי מוח קטן יחסית 28.

כדי להתגבר על המגבלות האלה, פיתחנו חדש גישה ניסויית vivo בהחולדה להשוות את התכונות אלקטרו של נוירונים בודדים רשמו במצב מוח נתון, כלומר, מוטבע ברשת מסוימת דינמית, לאלו שהושגו לאחר דיכוי מוחלט של פעילות סינפטית המוח כולו 29. בתנאים השליטים, שתי דינמיקת קליפת מוח מובהקת יכולה להיות שנוצרה. דפוסי שינה דמוי electrocorticographic (ECOG) היו המושרה על ידי הזרקה של מינון מתון של נתרן pentobarbital. לחלופין, גלי ECOG מהירים של משרעת קטנה השוואתיים לנעשה קליפת המוח הבסיסי המדינה הערה (דפוס ערות דמוית) יכולים להיות מיוצרים על ידי הזרקה של פנטניל. בהמשך לכך, תוך שמירה על אותה ECOG הקלטה תאית, השתקה מוחלטת של פעילות חשמלית במוח אנדוגני הושגה על ידי הזרקה מערכתית של מינון גבוה של נתרן pentobarbital, מאופיינת ECOG איזואלקטרית ופעילויות תאיות. מכיוון האינדוקציה של כזה בתרדמת קיצונית יכולה באופן פוטנציאלי consequen הקטלניתCES על תפקודים ביולוגיים, ניטור זהיר ומתמשך של משתנים פיזיולוגיים היה חיוני. לכן, אנו בקפדנות אחרת תדירויות פעימות לב, ריכוז הקצה גא CO 2 (Etco 2), רווית O 2 (SpO 2) חום ליבה של העכברוש ברחבי הניסויים.

אנו מעריכים תכונות נוירונים בודדות במהלך מצבים שונים אלה באמצעות microelectrodes חדה, אשר מתאימות במיוחד להקלטות ארוכות ויציבות in vivo. ההליך המתואר כאן, ניתן לשלב עם גישות הדמיה אלקטרו ואחרים עם אפשרות להארכה עד במודלים של בעלי חיים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים בוצעו בהתאם להנחיות של האיחוד האירופי (הנחיה 2010/63 / EU) ואושרה על ידי הוועדה האתית צ'רלס דרווין על ניסויים בבעלי חיים. אנו מתארים כאן הליך אנו משתמשים באופן שגרתי במעבדה שלנו, אולם רוב הפעולות ניתן להתאים כדי להתאים לצרכים הספציפיים של כל אחד.

1. הכנת כירורגים

הערה: כל נקודות החתך ולחץ צריכות להיות שחדר שוב ושוב עם הרדמה מקומית (לידוקאין או bupivacaine). ההליך הנוכחי חולה במחלה ממארת, אם הכנה ספטית נדרש מספר שינויים צריך להיות מיושם.

  1. להרדים חולדה עם pentobarbital נתרן (40 מ"ג / ק"ג) ו קטמין (50 מ"ג / ק"ג) בשני מקומית מופרדים intraperitoneal זריקות (IP).
  2. בואו חיה ללכת בהרדמה כללית שוב ושוב לוודא מטוס כירורגית של הרדמה מושגת (אין תגובת בוהן הצובטת). מניחים את החולדה על Feedback שמיכת חימום וכנס בדיקה רקטלית כדי לשמור על טמפרטורת ליבה סביב 37 מעלות צלזיוס.
  3. מניח קטטר בתוך חלל הבטן כדי להקל ההזרקה הבאה של סוכני הרדמה כדי למנוע ניקוב ובאיברי דקירות מחט חוזרת 30.
    1. קליפ השיער על גבר קטן (~ 2 - 3 מ"מ) אזור מעל אזור הממוקם בתוך ברבע ימינה או שמאלה התחתונים של הבטן.
      הערה: קרם מקריח יכול לשמש גם.
    2. הפוך 2 - חתך מ"מ 3 על העור במספריים חדים או אזמל. באמצעות דיסקציה בוטה, להסיר שכבות שומן ושריר עד חלל הצפק הוא ציין.
    3. הכנס על 1 - 2 ס"מ של קטטר קטן בחלל ולסגור את הפצע עם דבק כירורגי.
      (. למשל, 2 צרפתית - מתאימה 0.043 מ"מ קוטר פנימיים): הערת הקוטר ואת האורך הכולל של קטטר צריך להיות מינימאליים כדי להפחית כרכים מתים. פוליאוריתן צינורות המתאימים ביותר.
    4. בצע t לולאת התפרהוא קטטר על העור כדי לאבטח אותו במקומו.
  4. התקן צינורית לקנה הנשימה לשלוט אוורור במהלך להנשמה מלאכותית.
    1. באשר לשלב הקודם, להכין את האזור של עניין (1 - 2 סנטימטרים מעל קנה הנשימה ממש מעל manubrium), להסיר את השיער לחתוך את העור.
    2. בלאנט לנתח את שכבות שומן והשרירים הראשונות, ולאחר מכן להעביר את בלוטת הרוק הצידה ולחשוף את קנה הנשימה על ידי לנתח את השכבה האחרונה של שרירים בעדינות.
    3. מוציא בזהירות את הרקמות מעל קנה הנשימה וחלק חוט מתחתיה באמצעות מלקחיים קטנים. הפוך קשר של מנתח עם ההברגה אבל לא חזק זה עדיין.
    4. לחתוך את transversally קנה הנשימה בין שתי טבעות סחוסים. דם ספוגי בתוך קנה הנשימה אם בכלל.
    5. מחדיר צינורית לקנה נשימה עם הקוטר המתאים להדק את הקשר של החוט כדי לאבטח את הצינור יציב. לקבלת יציבות נוספת החוט יכול להיות מחובר נוסף בנקודה גבוהה יותר של הצינור לקנה הנשימה.
    6. Suturדואר הפצע קרוב או להשתמש סיכות כירורגיות. הימנע דבק כירורגים כאן אם הצינור לקנה הנשימה נועד לעשות בה שימוש חוזר.
  5. התקן את החיה בתוך מסגרת stereotaxic ובזהירות לפקח על משתנים פיזיולוגים הבאים: ECOG, 2 SpO, 2 Etco, קצב הלב (דרך רל, ECG) ולאחר הטמפרטורה הפנימית. צג ולהתאים משתנה אלה כדי לשמור על עומק נאות של הרדמת מצב פיסיולוגי. באופן ספציפי, להשלים הרדמה עם מנה קטנה (10 מ"ג / ק"ג) של נתרן pentobarbital במידת הצורך.
  6. החל משחה על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות. קליפ השיער על הקרקפת, לעשות חתך אורכי (~ 2 ס"מ) לכרות את רקמות החיבור המכסה את הגולגולת באמצעות אזמל או המגרדת.
  7. בצע (קוטר ~ 1.5 מ"מ) קטן craniotomy מעל האזור של עניין עם מקדח שיניים.
    הערה: כאן, בשדה החבית של הקליפה החושית העיקרית הוא ממוקד (7 - 8 מ"מ קדמי אל קו interaural, 4.5- 5.5 מ"מ לרוחב קו האמצע 31). יש לשטוף מספר פעמים כדי לפזר חום.
  8. שימוש במלקחיים קנס נוסף לעשות חור קטן בעדינות הדורה. שמור לאזור ~ 0.5 מ"מ בתוך הניקור גולגולתי למקם את האלקטרודה ECOG (ראה השלב הבא). לצמיתות לשמור על קליפת לחה עם פתרון 0.9% NaCl (או נוזל Cerebro-השדרה מלאכותית).
  9. מניחים עכבה נמוכה (~ 60 קילו-אוהם) אלקטרודה כסף (האלקטרודה ECOG) על הדורה, הימנעות באזור קליפת המוח מכוסה ולא על ידי קרומי המוח, ומקום אלקטרודה השוואתית על שריר הקרקפת בצד השני של הראש.
  10. בשלב זה (30 דקות לאחר ההזרקה pentobarbital נתרן האחרון), לשמור על ההרדמה על ידי זריקות חוזרות ונשנות של pentobarbital נתרן (10-15 מ"ג / ק"ג / שעה) או פנטניל (3-6 מיקרוגרם / ק"ג / שעה) באמצעות קטטר IP. לשעבר יגרמו תנודתית איטי, שינה דמוית, דפוס ECOG ואילו האחרונים יגרמו פרופיל desynchronized, להעיר דמוי, קליפת המוח.
  11. התאם נ המלאכותימערכת entilation כך תדיר ונפח הנשימה דומים לאלו של הנשימה הספונטנית של העכברוש (טווח רגיל 70 - 115 נשימה / min 32). לאחר מכן, לחבר את הנשמה המלאכותית אל הצינור לקנה הנשימה ולאמת את אינפלצית כלוב בית החזה התקינה (משני הצדדים). אם לא, להתאים את המיקום של צינורות אוורור בציר קנה הנשימה. במידת הצורך, להתחנף הפרשת נוכח קנה הנשימה עם קטטר מחובר מזרק או משאבת ואקום.
  12. אם כל המשתנים הפיזיולוגיים 32-35 ו ECOG 29,36 דפוסי לשקף מטוס כירורגית יציבה של הרדמה, לעשות זריקה תוך שרירית של triethiodide gallamine בכל רגל לשתק את החולדה, 40 מ"ג / ק"ג עבור הזריקה הראשונה ולאחר מכן 20 מ"ג / ק"ג , כל 19,29,36,50 2hr.

2. הקלטות תאיות

  1. משוך micropipette כוס (microelectrode חדה) עם ~ 0.2 מיקרומטר קצה כגון עמידותו נע between 50 ו -80 MΩ פעם מלאים 2 אצטט M אשלגן (KAC).
  2. מניח את פיפטה בבעל ספציפי עם חוט כסף / כסף-כלורי (Ag / AgCl) להתחבר הפתרון פיפטה למגבר תאי (דרך שלב ראש). הבעל יצורף micromanipulator. מניחים אלקטרודה התייחסות Ag / AgCl על שרירי הצוואר של החולדה.
  3. לאט להכניס את פיפטה במוח עד אזור של אינטרס ולאמת עמידותו ידי ניטור המתח יורד בתגובה השלבים הנוכחיים. השתמש באז (או zap) כפתור של המגבר כדי לנקות את פיפטה במידת הצורך.
  4. השתמש צמר גפן או משולשי קליטה סינטטיים לייבש את craniotomy (היזהר שלא לגעת ECOG או אלקטרודות תאיים) לפני כיסויה עם אלסטומר סיליקון או 4% agarose להפחית תנועות המוח.
  5. מנמיכים את פיפטה ב 1 - 2 מיקרומטר צעדים עד מגדילה את ההתנגדות שלה כאשר מתקרבים תא. ואז להשתמש בפונקציה באז של המגבר כדי penetraטה לתוך הנוירון.

3. להשרות מדינת איזואלקטרית

  1. בצע את פרוטוקול הניסוי המתאים (למשל, ירי תגובות זרמים מוזרקים intracellularly, יחסים נוכחי מתח, תגובות גירויים חושיות) בשלב זה תוך מעקב אחר בו זמנית פוטנציאל הממברנה של נוירון, את ECOG והמשתנים הפיסיולוגיים.
  2. ודא כי האלקטרודה התאי יציב בתא על ידי ניתוח היציבות של שניהם פוטנציאל הממברנה ופעולת נכסים פוטנציאליים לאורך כל פגישת ההקלטה. אם לא, לא לעבור לשלב הבא ומתן עד ההקלטה הופכת יציבה שוב או לחפש נוירון אחר.
  3. להזריק מינון גבוה אך אינפרא קטלני של pentobarbital נתרן (~ 90 מ"ג / ק"ג, יכול להיות נמוך כמו 35 מ"ג / ק"ג מן המצב ההתחלתי פנטוברביטול ועד 155 מ"ג / ק"ג מהמצב פנטניל הראשונית) דרך שורת IP.
    הערה: בתוך 15 - 20 דק 'ווה התאי ECOGveforms צריך להאט עם שתיקות חשמל לסירוגין זמני להגיע שנקרא "פרץ-הדיכוי" פרופיל 37,38, אשר בהדרגה מתמוטט למצב איזואלקטרית מלא. צפוי כי קצב הלב באופן משמעותי מאיטה (על ידי ~ 10 - 20%) אך SpO 2 ו Etco 2 צריך להישאר יציב יחסית.
  4. אם מדינת איזואלקטרית לא הגיעה, להזריק כמות קטנה של נתרן pentobarbital (~ 10% ממינון שלב 3.1). מתן 15 דקות לפני הוספת הרדמה יותר אם מדינת איזואלקטרית עדיין אינה מושגת.
  5. חזור על פרוטוקול הניסוי להשוות את ההשפעה של דינמיקת הרשת על המאפיינים אינטגרטיבי של נוירון נרשם.
    הערה: לאחר הפסקת זריקות הרדמה, הפעילות המוחית החשמל חייבת להתאושש באופן מלא בתוך 3 עד 4 שעות.
  6. בסוף הניסוי, להזריק מנה קטלנית של pentobarbital נתרן (200 מ"ג / ק"ג, IP) כדי להרדים את העכברוש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התרמה ושמירת מדינת מוח איזואלקטרית הוא עדין הליך ניסיוני vivo. זה הוכח להיות כלי רב עצמה ישירות לחקור את ההשפעה של פעילות רשת קליפת מוח על רגישות עצבית והעברת פונקציה 29. איור 1 מציג את הניטור רב פרמטר, כולל ECOG וקבועים חיוניים, של המדינה הפיזיולוגית של בעלי החיים לפני (איור 1A ) ואחרי (אינדוקציה איור 1B) של המדינה איזואלקטרית.

איור 1
איור 1. ניטור של הפרמטרים הפיסיולוגיים בקרה והגבלות איזואלקטרית.
A ו- B, הקלטות סימולטני של ECOG (עקבות למעלה) פרמטרים פיזיולוגיים במהלך המדינה שבקליפת המוח (א) ו צוללותתקופת איזואלקטרית equent (B). טמפרטורת ליבה (טמפ.), Etco 2 ו SpO 2 הם בעצם יציבים לאורך הניסוי. שיעור דופק, לעומת זאת, בהדרגה פוחת בעקבות האינדוקציה של מדינת איזואלקטרית (מ 382 ל 349 פעימות / דקה), כפי שניתן לראות על אק"ג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

במהלך הפגישות השליטות, הפרמטרים הפיסיולוגיים היו דומים לאלה שנמדדו בבעלי חיים בריאים ערים 32-35 ו נותרו בעינה לאחר הגיוס של מדינת איזואלקטרית, למעט את קצב הלב כי הואט מעט (איור 1). זה נקודה חשובה מאז 39 היפוקסיה או hypercapnia 40 יכולים לשנות עצבי רגישות ובכך יכולים להציג הטיה רצינית ניכרות חתיך y לחקור אפנון מדינה תלויה מוח של נכסים אינטגרטיבי עצביים.

השגנו את המצב איזואלקטרית משני תנאים ראשוניים שונים מחקו את דינמיקת קליפת המוח שנוצרה באופן אנדוגני בשלבים הראשונים של שינה (איור 2AA, פנל משמאל) או בזמן ערות (איור 2AB, פנל משמאל). מדינות פעילות אלו היו מושרים בין אם על ידי הזרקה של pentobarbital נתרן (שינה דמוית) או פנטניל (להעיר דמוי). בשני המקרים, את הזריקה הבאה של מינון גבוה של נתרן pentobarbital הביאה ביטול מוחלט של פעילות ספונטנית של ECOG ואת נוירונים רשמו בו זמנית (איור 2AA ו- B, לוחות מימין), ומכאן איזואלקטרית הטווח. הדחיק את הפעילות סינפטית המתמשכת הביא hyperpolarization היציב משמעותי של פוטנציאל הממברנה העצבי (איור 2 ב).

t "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 2
איור 2. השלכות של דיכוי פעילות סינפטית על Dynamics הספונטנית של ממברנה פוטנציאלי.
(א) הקלטות נציג סימולטני של ECOG (עקבות למעלה) ופעילויות תאיות (Intra, עקבות תחתונות) בזמן שינה, כמו (א א) ו- להעיר דמוי (א ב) תבניות (פנלים משמאל), ובמהלך התקופות איזואלקטרית עוקבות המקביל (במועדים המצוינים לאחר ההזרקה המדכאת; איזואלקטרית, לוחות מימין). הניתוח זמן-תדר של אותות ECOG (צפיפות האנרגיה של 0 - טווח תדרים 50 Hz) מתואר על ידי קשקשים צבע. צפיפויות הסתברות (B) (P) של ערכי פוטנציאל הממברנה (VM, סל גודל 0.5 mV, 10 שניות של הקלטה) מן הנוירונים שמודגם א לוח דמות זו שונתה, ברשות, מ נ"צ 29./ftp_upload/53576/53576fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כדי להמחיש את ההשפעה התפקודית של המדינה המוח הקיצונית הזו, שחילצנו את המאפיינים מהותי פסיביים ואקטיביים של נוירונים איזואלקטרית והשוו אותם עם אלה שנמדדו במהלך המצב ההתחלתי המקביל. באמצעות אסטרטגיה זו, הראינו כי נוירונים יכולים לפטר פוטנציאל פעולה בתגובה הזרקת תאיים של depolarizing הנוכחי במהלך מצב איזואלקטרית, הוכחת כי הם נשארו להתרגש במלואה גם לאחר דיכוי מוחלט של פעילות הרקע הסינפטי (איור 3Aa ו- B, איזואלקטרית). יתר על כן, מצאנו כי פונקצית התמסורת של נוירונים, מוערכת על ידי מדידת תדר ירי מושרה על ידי מדרגות depolarizing הנוכחי של הגדלה עוצמת (יחסי FI), צדק העביר לעומת התנאים הפעילים הראשוניים, המצייןירידת הרגישות הנוירונים לתשומות מעוררות חלשות (איור 3 ב). מקביל רווח עצבי, כלומר, השיפוע העקום FI, נותר ללא שינוי או הופחת כשהמדינה הביקורת הייתה של-סוג ערות חסר שינה או, בהתאמה (איור 3). באופן מפתיע, ההתנגדות קלט לכאורה של נוירונים לא שונה באופן משמעותי בהעדר כונן הסינפטי לעומת תנאי השליטה פעיל (איור 3Aa, ב). תוצאות נוספות, כוללים ניתוח אוכלוסייה וכימות של דפוסי ירי הזמניים של נוירונים בתנאי הפעיל איזואלקטרית, זמינות הנייר הראשוני שלנו 29.

איור 3
איור 3. השפעה ההשוואתית של דפוסי פעילות השלוש קורטיקלי על מאפייני ממברנה ויחסי תשומה-תפוקה.
(א) בעל מתח תגובות דואר (עקבות באמצע) של נוירונים בקליפת מוח חושיים כדי depolarizing וקטניות הנוכחיות hyperpolarizing (עקבות תחתונות) בזמן שינה, כמו (א א) ו- להעיר דמוי (א ב) תבניות ECOG (רשומים למעלה) ואחרי שלילת הפעילות סינפטית (איזואלקטרית ). התנגדות קלט ממברנה (R מ ', ערכים מסומנים) נמדדה מפני נפילות מתח (עקבות אפורות, ממוצעים של 20 ניסויים) הנגרמות על ידי זריקות דופק הנוכחיות hyperpolarizing (-0.4 Na). (ב) עקומות FI מקבילות, מתן פונקצית התמסורת של נוירונים שמודגם בלוח (א). שיעור הירי נמדד בתגובת depolarizing פולסים הנוכחי (200 משך msec) של וגובר. עוצמת זרם כל יושמה 20 פעמים ואת שיעורי ירי המקביל היו ממוצעות. הקווים המקווקווים מציינים תגובות התא שמוצגות (א). דמות זו שונתה, ברשות, מ נ"צ 29.להעלות / 53,576 / 53576fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מתארים כאן שיטה חדשה לדכא פעילות חשמלית מוחית ספונטנית vivo בשנייה רשת ורמות הסלולר. הליך זה מוביל למצב מוח קיצוני, המכונה בתרדמת איזואלקטרית 41. מנקודת מבט קליני, כזה חוסר פעילות electrocerebral היא הנורמליות החמורה ביותר, כי ניתן לראות על EEG. הוא בעיקר קשור הכרה בלתי הפיכה, עם כל המטופלים או למות או המתמשכת במצב וגטטיבי מתמשך 42, אבל יכול להיות לפחות הפוך חלקי כאשר נגרמו על ידי רעלת עם תרופות דיכאון מערכת עצבים מרכזיות (כגון thiopental), גידול היפותרמיה בשוגג 42 או 43 מדום לב asphyxial. בפרדיגמה הניסוי שלנו, מדינה איזואלקטרית מושגת בהדרגה על ידי הזרקה מערכתית של נתרן pentobarbital במינונים גבוהים, אשר ראשון במהירות גורם לירידת תוכן תדירות ECOG, אז כמצב "פרץ-דיכוי"41,42, וסופו של דבר אל ECOG שטוח לחלוטין. ברמה התאית, ההיעלמות של פעילות ספונטנית כדלקמן לקורס במשרה דומה עם ירידה מקבילה של depolarizing ותנודות פוטנציאל הממברנה hyperpolarizing. לשם כך היא יכולה להיות שיערו כי הזרקה של נתרן pentobarbital הראשון מגדיל את שידור מעכבות הסינפטי שמוביל לירידה של נוירונים בקליפת המוח ירי פעילות, לבטל בהדרגה שידור סינפטיים מעוררים ו מעכבות שסוף סוף התוצאה ECOG איזואלקטרית ופעילויות תאיים 29,44. מעברים דומים מ- פעיל לדפוסי ECOG איזואלקטרית ניתן להשיג הבאים הממשל של סוכני הרדמה אחרים כגון קטמין (התבוננות אישית) או 45,46 isoflurane.

ההליך עשוי להופיע פשוט יחסית. עם זאת, בשל בתרדמת מאוד עמוקה מושרה, שמירה על המשתנים פיסיולוגיים הבסיסיים בתוךטווח רגיל הוא בעלת חשיבות עליונה להצלחת הניסוי. שינויים בתנודות Etco 2 יכולים להיות התוצאה של פקק רירי להרכיב בתוך קנה הנשימה. במצב כזה, ההנשמה יש להפריד את הריר aspirated במהירות או מחקו דרך הצינור לקנה הנשימה. יתר על כן, היציבות המכאנית של התכשיר היא קריטית עבור הקלטות תאיות. לפיכך, מאמץ מיוחד צריך להיעשות כדי להפחית כלי דם ואת פעימות נשימה, על ידי בקפידה התאמת ביחס הגוף של בעל החיים על הראש תוך שמירה על יישור צינורות לקנה נשימה נכון, ועל ידי יישום agarose או אלסטומר סיליקון על craniotomy. כמו כן יש להימנע התכווצויות שרירים ספונטניות על ידי הזרקה של סוכן משתק. לבסוף, ויברציות סביבתית והפרעות אלקטרוניות צריכות להיות מופחתות ככל האפשר. פרסומים אחרים פרטו את הצעדים החיוניים עבור אופטימלי כהכנת vivo המאפשר תאי או תיקון- clamp יציבים אשרle-תא הקלטות 29,47-50.

היכולת לנתק תכונות הממברנה ודינמיקת רשתות מהותיות עצביות חיונית לנתח את המנגנונים שבאמצעותם נוירונים בודדים לעבד מידע בסביבה המחוברת ביותר שלהם. כאמור במבוא, מחקרים קודמים המוקדשים לנושא מרכזי זה של מדעי המוח הבסיסיים הובילו לתוצאות סותרות, בין היתר בשל תכונות ספציפיות של נוירונים ורשתות חקר תנאי הניסוי השונים, כולל במבחנה vs ההכנות in vivo ו, בסופו של דבר, נהלי הרדמה שונים המשמשים (ראה למשל 29,36,51). אנו מציעים כי הגישה הנוכחית יכול לשמש כדי לאמת, ואולי ליישב, הממצאים המתקבלים מופחת הכנה במבחנה מן בניסויים vivo. ואכן, היא מאפשרת לבחון ישירות ולהשוות באותו נוירון במהלך אותו הליך הניסויההשפעה של דפוס ברור של תשומות הסינפטי מביאות, מן הדינמיקה-כמו להתעורר כדי להשלים חוסר פעילות, על המאפיינים אינטגרטיבי העצביים חי.

מאפיין אחד של פרוטוקול זה הוא, שאחרי משתלט עליו, זה יכול להיות משולב עם ניסיוני בטכניקות אחרות, כגון קלטות שטח ועומק multisite EEG, אינדיקטורים ניאון מקודדים גנטיים מבוססי חקירות ואפילו הדמיה המודינמי מטבולית של המוח, כדי לחקור את הרב-ממדי המאפיינים של המוח איזואלקטרית. כפי פרספקטיבות קליניים אבחון, מאז הראינו כי נוירונים עדיין להתרגש במהלך בתרדמת איזואלקטרית מתמיד, זה היה מידע רלוונטי על מנת לבחון את הפונקציות של קליפת המוח, למשל עיבוד המידע החושי, של חולים ומודלים של בעלי חיים שקוע במצב כזה פתולוגית של המוח חוֹסֶר פְּעִילוּת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של צרפת Fondation de, ומהמכון הלאומי דה לה סנטה et de la משוכלל ונדיר Medicale, פייר & מארי קירי אוניברסיטת והתוכנית 'Investissements d'Avenir' ANR-10-IAIHU-06.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital Centravet Pentobarbital
Ketamine 500 Merial Imalgène 500
Fentanyl  Janssen-Cilag Fentanyl
Xylocaine Centravet Xylovet
Gallamine triethiodide Sigma G8134
ECoG amplifier A-M Systems AC amplifier, Model 1700
Intracellular amplifier Molecular Devices Axoclamp 900A
Data acquisition interface Cambridge Electronic Design CED power 1401-3 
Data analysis software Cambridge Electronic Design Spike2 version 7
micromanipulator Scientifica IVM-3000
Capillary Puller Narishige PE-2
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-10
Silver wire 0.125 mm (intracellular recording) WPI AGT0525
Ag-AgCl reference Phymep E242
Silver wire 0.25 mm (ECoG recording) WPI AGT1025
Artificial respiration system Minerve Alpha Lab
Physiological parameters monitoring Digicare LifeWindow Lite
Heating Blanket Harvard Apparatus 507215
Stereomicroscope Leica M80
Scissors FST 15005-08
Forceps Dumont #5 FST 11295-10
Forceps Dumont #5SF FST 11252-00
IP Polyurethane catheter - 0.43x0.69 mm   Instech BTPU-027
Silicon elastomere WPI KWIK-CAST
Dental drill NSK Y1001151 and P496
Surgical glue 3M vetbond

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fatt, P., Katz, B. Some observations on biological noise. Nature. 166 (4223), 597-598 (1950).
  2. Brock, L. G., Coombs, J. S., Eccles, J. C. The recording of potentials from motoneurones with an intracellular electrode. J. Physiol. 117 (4), 431-460 (1952).
  3. Destexhe, A., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
  4. Silver, R. A. Neuronal arithmetic. Nat. Rev. Neurosci. 11 (7), 474-489 (2010).
  5. Azouz, R., Gray, C. M. Cellular mechanisms contributing to response variability of cortical neurons in vivo. J. Neurosci. 19 (6), 2209-2223 (1999).
  6. Sanchez-Vives, M. V., Nowak, L. G., McCormick, D. A. Membrane Mechanisms Underlying Contrast Adaptation in Cat Area 17 In Vivo. J. Neurosci. 222 (11), 4267-4285 (2000).
  7. Petersen, C. C. H., Hahn, T. T. G., Mehta, M., Grinvald, A., Sakmann, B. Interaction of sensory responses with spontaneous depolarization in layer 2/3 barrel cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (23), 13638-13643 (2003).
  8. Sachdev, R. N. S., Ebner, F. F., Wilson, C. J. Effect of Subthreshold Up and Down States on the Whisker-Evoked Response in Somatosensory Cortex. J. Neurophysiol. 92 (6), 3511-3521 (2004).
  9. Hasenstaub, A., Sachdev, R. N. S., McCormick, D. A. State Changes Rapidly Modulate Cortical Neuronal Responsiveness. J. Neurosci. 27 (36), 9607-9622 (2007).
  10. Chance, F. S., Abbott, L. F., Reyes, A. D. Gain modulation from background synaptic input. Neuron. 35 (4), 773-782 (2002).
  11. Shu, Y., Hasenstaub, A., Badoual, M., Bal, T., McCormick, D. A. Barrages of synaptic activity control the gain and sensitivity of cortical neurons. J. Neurosci. 23 (32), 10388-10401 (2003).
  12. Mitchell, S. J., Silver, R. A. Shunting inhibition modulates neuronal gain during synaptic excitation. Neuron. 38 (3), 433-445 (2003).
  13. Prescott, S. A., De Koninck, Y. Gain control of firing rate by shunting inhibition: roles of synaptic noise and dendritic saturation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 2076-2081 (2003).
  14. Graham, L. J., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and IBK in Rat and Cat Cortex. Dynamic-clamp: From principles to applications. , (2009).
  15. Fernandez, F. R., White, J. A. Gain control in CA1 pyramidal cells using changes in somatic conductance. J. Neurosci. 30 (1), 230-241 (2010).
  16. Polack, P. O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat. Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
  17. Zhou, M., Liang, F., et al. Scaling down of balanced excitation and inhibition by active behavioral states in auditory cortex. Nat. Neurosci. 17 (6), 841-850 (2014).
  18. Contreras, D., Destexhe, A., Sejnowski, T. J., Steriade, M. Spatiotemporal Patterns of Spindle Oscillations in Cortex and Thalamus. J. Neurosci. 17 (3), 1179-1196 (1997).
  19. Charpier, S., Mahon, S., Deniau, J. M. In vivo induction of striatal long-term potentiation by low-frequency stimulation of the cerebral cortex. Neuroscience. 91 (4), 1209-1222 (1999).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and Mechanisms of Wakefulness on Local Cortical Networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  21. Poulet, J. F. A., Fernandez, L. M. J., Crochet, S., Petersen, C. C. H. Thalamic control of cortical states. Nat. Neurosci. 15 (3), 370-372 (2012).
  22. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes, Third Edition. , Sinauer Associates. Sunderland, Mass. (2001).
  23. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
  24. Ferster, D., Chung, S., Wheat, H. Orientation selectivity of thalamic input to simple cells of cat visual cortex. Nature. 380 (6571), 249-252 (1996).
  25. Paré, D., Shink, E., Gaudreau, H., Destexhe, A., Lang, E. J. Impact of spontaneous synaptic activity on the resting properties of cat neocortical pyramidal neurons In vivo. J. Neurophysiol. 79 (3), 1450-1460 (1998).
  26. Destexhe, A., Paré, D. Impact of network activity on the integrative properties of neocortical pyramidal neurons in vivo. J. Neurophysiol. 81 (4), 1531-1547 (1999).
  27. Kara, P., Pezaris, J. S., Yurgenson, S., Reid, R. C. The spatial receptive field of thalamic inputs to single cortical simple cells revealed by the interaction of visual and electrical stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (25), 16261-16266 (2002).
  28. Lomber, S. G. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. J. Neurosci. Meth. 86 (2), 109-117 (1999).
  29. Altwegg-Boussac, T., Chavez, M., Mahon, S., Charpier, S. Excitability and responsiveness of rat barrel cortex neurons in the presence and absence of spontaneous synaptic activity in vivo. J. Physiol. 592 (16), 3577-3595 (2014).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl. Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates (2nd edn). , Academic Press. (1986).
  32. Wolfensohn, S. Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare. , Wiley-Blackwell. (2013).
  33. Bester, H., Chapman, V., Besson, J. M., Bernard, J. F. Physiological Properties of the Lamina I Spinoparabrachial Neurons in the Rat. J. Neurophysiol. 83 (4), 2239-2259 (2000).
  34. Greene, S. A. Veterinary Anesthesia and Pain Management Secrets. , Elsevier Health Sciences. (2002).
  35. Morgan, B. J., Adrian, R., Bates, M. L., Dopp, J. M., Dempsey, J. A. Quantifying hypoxia-induced chemoreceptor sensitivity in the awake rodent. J. Appl. Physiol. 117 (7), 816-824 (2014).
  36. Mahon, S., Deniau, J. M., Charpier, S. Relationship between EEG potentials and intracellular activity of striatal and cortico-striatal neurons: an in vivo study under different anesthetics. Cereb. Cortex. 11 (4), 360-373 (2001).
  37. Ganes, T., Lundar, T. The effect of thiopentone on somatosensory evoked responses and EEGs in comatose patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 46 (6), 509-514 (1983).
  38. Schmid-Elsaesser, R., Schröder, M., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. EEG burst suppression is not necessary for maximum barbiturate protection in transient focal cerebral ischemia in the rat. J. Neurol. Sci. 162 (1), 14-19 (1999).
  39. Cummins, T. R., Jiang, C., Haddad, G. G. Human neocortical excitability is decreased during anoxia via sodium channel modulation. J Clin Invest. 91 (2), 608-615 (1993).
  40. Gu, X. Q., Kanaan, A., Yao, H., Haddad, G. G. Chronic High-Inspired CO2 Decreases Excitability of Mouse Hippocampal Neurons. J. Neurophysiol. 97 (2), 1833-1838 (2007).
  41. Lehembre, R., Gosseries, O., et al. Electrophysiological investigations of brain function in coma, vegetative and minimally conscious patients. Arch Ital Biol. 150 (2/3), 122-139 (2012).
  42. Husain, A. M. Electroencephalographic assessment of coma. J Clin Neurophysiol. 23 (3), 208-220 (2006).
  43. Fink, E. L., Alexander, H., et al. An Experimental Model of Pediatric Asphyxial Cardiopulmonary Arrest in Rats. Pediatr Crit Care Med. 5 (2), 139-144 (2004).
  44. Lukatch, H. S., McIver, M. B. Synaptic mechanisms of thiopental-induced alterations insynchronized cortical activity. Anesthesiology. 84, 1425-1434 (1996).
  45. Kroeger, D., Amzica, F. Hypersensitivity of the anesthesia-induced comatose brain. J Neurosci. 27, 10597-10607 (2007).
  46. Kroeger, D., Florea, B., Amzica, F. Human brain activity patterns beyond the isoelectric line of extreme deep coma. PLoS ONE. 8 (9), e75257 (2013).
  47. Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Arch. 444 (4), 491-498 (2002).
  48. DeWeese, M. Whole-Cell Recording In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. , (2007).
  49. Schramm, A. E., Marinazzo, D., Gener, T., Graham, L. J. The Touch and Zap Method for In Vivo Whole-Cell Patch Recording of Intrinsic and Visual Responses of Cortical Neurons and Glial Cells. PLoS ONE. 9 (5), e97310 (2014).
  50. Mahon, S., Charpier, S. Bidirectional Plasticity of Intrinsic Excitability Controls Sensory Inputs Efficiency in Layer 5 Barrel Cortex Neurons in Vivo. J. Neurosci. 32 (33), 11377-11389 (2012).
  51. Destexhe, A., Rudolph, M., Paré, D. The high-conductance state of neocortical neurons in vivo. Nat. Rev. Neurosci. 4 (9), 739-751 (2003).

Tags

Neuroscience גיליון 109 הקלטות תאיות, התרגשות פעילות סינפטית ECOG איזואלקטרית שיתוק הקורטקס תרדמת קבוע פיזיולוגית
אינדוקציה של מדינת איזואלקטרית מוח כדי לחקור את ההשפעה של פעילות סינפטית אנדוגני על העצבית רגישה<em&gt; In vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Altwegg-Boussac, T., Mahon, S.,… More

Altwegg-Boussac, T., Mahon, S., Chavez, M., Charpier, S., Schramm, A. E. Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo. J. Vis. Exp. (109), e53576, doi:10.3791/53576 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter