Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Induktion af en Isoelectric Brain State til at undersøge betydningen af ​​endogene Synaptic aktivitet på neuronexcitabilitet Published: March 31, 2016 doi: 10.3791/53576
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

Summary

Denne procedure udfører langvarige in vivo intracellulære optagelser fra enkelte neuroner under fysiologisk relevante cerebrale tilstande og efter fuldstændig afskaffelse af igangværende elektriske aktiviteter, hvilket resulterer i en isoelektriske hjerne tilstand. De fysiologiske konstanter af dyret er nøje overvåges under overgangen til den kunstige koma tilstand.

Abstract

vejs neuroner proces information afhænger både af deres iboende membran egenskaber, og på dynamikken i afferente synaptiske netværk. Især endogent-genereret netværksaktivitet, som i høj grad varierer som en funktion af den tilstand af årvågenhed, modulerer neuronal beregning betydeligt. For at undersøge, hvordan forskellige spontane cerebrale dynamik påvirke enlige neuroner 'integrative egenskaber, vi udviklet en ny eksperimentel strategi i rotten består i at undertrykke in vivo alle cerebral aktivitet ved hjælp af en systemisk injektion af en høj dosis af natriumpentobarbital. Kortikale aktiviteter, løbende overvåges af kombineret electrocorticogram (ECoG) og intracellulære optagelser gradvis bremset, hvilket fører til en stabil isoelektriske profil. Denne ekstreme hjerne tilstand, at sætte rotten i en dyb koma, blev omhyggeligt overvåget ved at måle de fysiologiske konstanter af dyret gennem eksperimenterne. intracellulær recordings tilladt os at karakterisere og sammenligne de integrative egenskaber af den samme neuron indlejret i fysiologisk relevante kortikale dynamik, såsom dem, der optræder i søvn-vågne cyklus, og når hjernen var helt tavs.

Introduction

I mangel af miljømæssige stimuli eller adfærdsmæssige opgaver, de "hvilende" hjerne genererer en kontinuerlig strøm af elektrisk aktivitet, der kan optages fra hovedbunden, som elektroencephalografiske (EEG) bølger. Den intracellulære korrelat af denne endogene cerebral aktivitet er karakteriseret ved baggrund membran spændingsudsving (også kendt som "synaptisk støj"), som er sammensat af en kombination af excitatoriske og hæmmende synaptiske potentialer, der afspejler den igangværende aktivitet af afferente netværk 1,2. Denne spontane aktivitet varierer i frekvens og amplitude med de forskellige tilstande af årvågenhed. Belyse effekten af netværksaktivitet på ophidselse og lydhørhed af enkelte neuroner er en af de store udfordringer i neurovidenskab 3,4.

Mange eksperimentelle og beregningsmæssige undersøgelser har udforsket den funktionelle konsekvenser af igangværende synaptisk aktivitet på integrativ properties af neuroner. Men hvilken rolle de forskellige neuronale parametre påvirket af baggrunden synaptiske støj stadig undvigende. For eksempel, har vist sig gennemsnitshøjden af membrandepolarisering positivt 5,6 eller negativt 7-9 korreleret med evnen hos sensoriske inputs at udløse aktionspotentialer. Desuden mens nogle undersøgelser tyder på, at udsving i membranpotentialet, som følge af en kontinuerligt varierende strøm af afferente synaptiske input, stærkt påvirke lydhørhed af enkelte neuroner ved at modulere gevinst på deres input-output forhold 3,10-13, andre viser, at ændringer i membran input konduktans medieret af rangering inhibering er tilstrækkelige til at modulere neuronal gevinst uanset størrelsen af membran udsving 14,15. Endelig seneste undersøgelser udført på vågne dyr understregede, hvordan behandlingen af ​​sensorisk information i enkelt neuron kritisk afhænger af tilstanden af ​​årvågenhed ennd den nuværende adfærdsmæssige efterspørgsel 16,17.

En ligetil strategi for at belyse den funktionelle rolle af en given proces i et stærkt sammenkoblede system er at afgøre, hvordan dens fravær specifikt ændrer systemets funktion. Denne metode har været udbredt hos neuroscience forskning, for eksempel ved anvendelse eksperimentelle læsioner eller inaktivering af forskellige hjerneområder 18-21 eller farmakologisk blokade af specifikke ionkanaler 22,23. Især er det blevet anvendt in vivo til at afsløre, hvordan funktionelle tilslutningsmuligheder og netværk dynamik påvirker enkelt celle beregning 24-27. , Til dato lokale manipulationer beregnet Men at blokere affyring af neuroner og / eller forstyrre deres grundlæggende biofysiske egenskaber kan være delvist effektive og er begrænset til relativt små hjerne bind 28.

For at overvinde disse begrænsninger, vi udviklet en ny in vivo eksperimenterende tilgang irotte til at sammenligne de elektrofysiologiske egenskaber af enkelte neuroner er registreret i en given hjerne tilstand, dvs., indlejret i et bestemt netværk dynamisk, til dem, der opnås efter komplet undertrykkelse af hele hjernen synaptisk aktivitet 29. I kontrol- betingelser, kunne to forskellige kortikale dynamik genereres. Sleep-lignende electrocorticographic (ECoG) mønstre blev induceret ved injektion af moderate doser af natriumpentobarbital. Alternativt kunne hurtige ECoG bølger af lille amplitude sammenlignes med den kortikale aktivitet ligger til grund for vågen tilstand (vågen-lignende mønster) fremstilles ved indsprøjtning af fentanyl. Efterfølgende, og samtidig opretholde den samme ECoG og intracellulær optagelse, blev et komplet silencing af endogen hjerne elektrisk aktivitet opnået ved systemisk injektion af en høj dosis af natriumpentobarbital, kendetegnet ved isoelektrisk ECoG og intracellulære aktiviteter. Fordi induktionen af ​​en sådan ekstrem bevidstløs potentielt kan have dødelig consequences på biologiske funktioner, en omhyggelig og kontinuerlig overvågning af de fysiologiske variable var afgørende. Vi derfor omhyggeligt fulgt hjerteslag frekvens, end-tidal CO2-koncentration (EtCO 2), O 2 mætning (SpO 2) og kernetemperatur rotten hele eksperimenterne.

Vi evaluerer enkelt neuroner egenskaber i disse forskellige tilstande ved hjælp af skarpe mikroelektroder, som er særligt velegnet til lange og stabile optagelser in vivo. Den her beskrevne fremgangsmåde, kan kombineres med andre elektrofysiologiske og billedteknik, og kan udvides til andre dyremodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Den Europæiske Union (direktiv 2010/63 / EU) og godkendt af Charles Darwin Etisk Udvalg om dyreforsøg. Vi beskriver her den procedure, vi rutinemæssigt bruger i vores laboratorium, men de fleste trin kan tilpasses til at matche alles behov.

1. Kirurgisk Forberedelse

Bemærk: Alle punkter indsnit og tryk skal gentagne gange infiltreret med lokalbedøvelse (lidokain eller bupivacain). Den nuværende procedure er terminal, hvis en aseptisk forberedelse er nødvendig flere ændringer bør gennemføres.

  1. Bedøver en rotte med natriumpentobarbital (40 mg / kg) og ketamin (50 mg / kg) i to lokalt adskilt intraperitoneale (IP) injektioner.
  2. Lad dyret gå under generel anæstesi og gentagne gange bekræfte, at en kirurgisk plan anæstesi er opnået (ingen reaktion til tå klemme). Placer rotte på en feedback varmetæppe og indsætte en rektal sonde til at opretholde kernetemperatur omkring 37 ° C.
  3. Placer et kateter i bughulen for at lette efterfølgende injektion af anæstesimidler og undgå perforering organer ved gentagne nål punkterer 30.
    1. Clip håret over en lille (~ 2 - 3 i mm) område over en region beliggende i maven nedre højre eller venstre kvadrant.
      Bemærk: Hårfjerningscreme kan også anvendes.
    2. Foretag en 2 - 3 mm incision på huden med en skarp saks eller en skalpel. Ved stump dissektion, fjerne fedt og muskellag, indtil der observeres bughulen.
    3. Indsæt omkring 1 - 2 cm af en lille kateter i hulrummet og lukke såret med kirurgisk lim.
      (. Fx to Fransk - svarende til 0,043 mm indvendig diameter): Bemærk Diameteren og den samlede længde af kateteret bør være minimal for at reducere døde volumener. Polyurethan rør er mest velegnede.
    4. Lav en løkke og sutur than kateteret til huden for at sikre det på plads.
  4. Installer en trakealrør at styre ventilation under kunstigt åndedræt.
    1. Ligesom i det foregående trin, forberede interesseområdet (1 - 2 cm over luftrøret lige over manubrium), fjerne hår og incise huden.
    2. Blunt dissekere de første lag af fedt og muskler, og flyt derefter spytkirtel til side og eksponere luftrøret ved forsigtigt at dissekere det sidste lag af muskler.
    3. Fjern forsigtigt væv over luftrøret og skub en tråd under den ved hjælp af små pincet. Lav en kirurg knude med tråden, men ikke stramt det endnu.
    4. Incise luftrøret tværs mellem to bruskagtige ringe. Vatpind blod i luftrøret hvis nogen.
    5. Indsæt en trachealtube med passende diameter og stram tråden knude for at fastgøre røret stabil. For yderligere stabilitet tråden kan yderligere være fastgjort til et højere punkt af luftrøret rør.
    6. Suture såret lukker eller bruge kirurgiske hæfteklammer. Undgå kirurgisk lim her hvis luftrørsslangen er beregnet til at blive genanvendt.
  5. Installere dyret i en stereotaktisk ramme, og omhyggeligt overvåge følgende fysiologiske variable: ECoG SPO 2, EtCO 2, hjertefrekvens (via en elektrokardiogram, EKG) og indre temperatur. Overvåge og justere disse variabler for at holde en passende dybde af anæstesi og fysiologiske tilstand. Specifikt supplere anæstesi med en lille dosis (10 mg / kg) af natriumpentobarbital om nødvendigt.
  6. Påfør øjensalve på begge øjne for at undgå udtørring. Clip hår over hovedbunden, gør et langsgående snit (~ 2 cm) og resektion bindevævet ligger over kraniet ved en skalpel eller en curette.
  7. Lav en lille (~ 1,5 mm i diameter) kraniotomi over regionen af ​​interesse med et tandlægebor.
    Bemærk: Her er cylinderen inden for den primære somatosensoriske cortex målrettet (7 - 8 mm anterior til den interaurale linje, 4,5- 5,5 mm lateralt for midterlinien 31). Skyl flere gange for at sprede varmen.
  8. Brug ekstra fine pincet til forsigtigt at gøre et lille hul i dura. Reserve en ~ 0,5 mm region i kranie trepanation at placere ECoG elektroden (se næste trin). Permanent holde cortex fugtig med 0,9% NaCl-opløsning (eller kunstig cerebrospinalvæske).
  9. Placer en lav impedans (~ 60 kQ) sølvelektrode (den ECoG elektrode) på dura, undgå kortikale region ikke er omfattet af meninges, og placere referenceelektroden på en hovedbund muskel på den anden side af hovedet.
  10. På dette stadium (30 min efter den sidste natriumpentobarbital injektion), opretholde anæstesi ved gentagne injektioner af natriumpentobarbital (10-15 mg / kg / h) eller fentanyl (3-6 ug / kg / h) via IP kateteret. Førstnævnte vil resultere i en langsom oscillerende, søvn-lignende, ECoG mønster mens sidstnævnte vil resultere i en desynkroniseret, vågne-lignende, cortical profil.
  11. Juster kunstige ventilation system, så det respiratoriske frekvens og volumen svarer til dem af rottens spontane respiration (normal fra 70 - 115 åndedrag / min 32). Slut derefter den mekaniske ventilation til trachealtube og kontrollere den rette thorax bur inflation (på begge sider). Hvis ikke, justere placeringen af ​​ventilationen slangen i tracheale akse. Om nødvendigt opsuge sekretionen stede i luftrøret med et kateter forbundet til en sprøjte eller en vakuumpumpe.
  12. Hvis alle fysiologiske variable 32-35 og ECoG 29,36 mønstre afspejler en stabil kirurgisk plan anæstesi, gøre en intramuskulær injektion af gallamin triethiodid i hvert ben at lamme rotte, 40 mg / kg for den første injektion og derefter 20 mg / kg hver 2 timer 19,29,36,50.

2. Intracellulære Optagelser

  1. Træk et glas mikropipette (skarp mikroelektrode) med en ~ 0,2 um tip såsom dens modstand spænder between 50 og 80 MOhm gang fyldt med 2 M kaliumacetat (KAc).
  2. Anbring pipetten i en bestemt indehaver med en sølv /-chlorid (Ag / AgCl) ledning til at forbinde pipetten løsning på et intracellulært forstærker (via et hoved fase). Holderen skal være knyttet til en mikromanipulator. Placer en Ag / AgCl referenceelektrode på rottens nakkemuskler.
  3. Sæt langsomt pipetten i hjernen ned til området af interesse og kontrollere dets modstand ved at overvåge spændingen falder som reaktion på nuværende trin. Brug den brummer (eller zappe) knappen på forstærkeren for at rydde pipette, hvis nødvendigt.
  4. Brug vatpinde eller syntetiske absorption trekanter at tørre kraniotomi (pas på ikke at røre ved ECoG eller intracellulære elektroder), før dække den med silicone elastomer eller 4% agarose at reducere hjernen bevægelser.
  5. Sænk pipette i 1 - 2 um trin, indtil dens modstand stiger, når du nærmer en celle. Brug derefter den brummer funktion forstærkeren til penetrate ind i neuronen.

3. inducere Isoelektrisk stat

  1. Udfør det relevante eksperimentelle protokol (f.eks fyring svar til intracellulært injicerede strøm, strøm spænding relationer, sensoriske stimuli respons) på dette tidspunkt under overvågning samtidig neuron membran potentiale, den ECoG og fysiologiske variable.
  2. Sørg for, at den intracellulære elektrode er stabil i cellen ved at analysere stabilitet af både potentielle membran og aktionspotentialet egenskaber gennem hele indspilningen. Hvis ikke, skal du ikke gå videre til næste trin og vente, indtil optagelsen bliver stabil igen, eller søge efter en anden neuron.
  3. Injicere en høj, men infra-dødelig dosis af natriumpentobarbital (~ 90 mg / kg, kan være så lav som 35 mg / kg fra den pentobarbital oprindelige tilstand og op til 155 mg / kg fra fentanyl oprindelige tilstand) via IP linje.
    Bemærk: Inden 15 - 20 min den intracellulære og ECoG waveforms bør bremse med intermitterende elektriske tavshed til forbigående nå den såkaldte "burst-suppression" profil 37,38, som gradvis kollapser til en fuldstændig isoelektriske tilstand. Det forventes, at hjertefrekvensen signifikant langsommere (med ~ 10 - 20%), men SpO 2 og EtCO 2 bør forblive relativt stabil.
  4. Hvis det isoelektriske tilstand ikke er nået, injiceres en lille mængde af natriumpentobarbital (~ 10% af dosen trin 3.1). Vent 15 minutter, før du tilføjer mere bedøvelse, hvis det isoelektriske tilstand er stadig ikke nået.
  5. Gentag forsøgsprotokollen at sammenligne virkningen af ​​netværket dynamik på det optagne neuron er integrative egenskaber.
    Bemærk: Efter ophør af bedøvende indsprøjtninger, skal den elektriske hjerneaktivitet fuldstændig genoprettet inden for 3 til 4 timer.
  6. Ved afslutningen af ​​forsøget, indsprøjte en dødelig dosis af natriumpentobarbital (200 mg / kg, IP) for at aflive rotten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Induktion og vedligeholdelse af en isoelektrisk hjerne tilstand er en delikat in vivo eksperimentelle procedure. Det har vist sig at være et effektivt redskab til direkte undersøge virkningen af kortikale netværk aktivitet på neuronexcitabilitet og overføringsfunktion 29. Figur 1 viser multi-parameter overvågning, herunder ECoG og vitale konstanter, af dyrets fysiologiske tilstand før (figur 1A ) og efter (figur 1B) induktion af det isoelektriske tilstand.

figur 1
Figur 1. Overvågning af de fysiologiske parametre i kontrol og Isoelectric Betingelser.
A og B, samtidige optagelser af ECoG (top spor) og fysiologiske parametre under aktiv kortikal tilstand (A) og subsequent isoelektrisk periode (B). Core temperatur (Temp.), EtCO 2 og SpO 2 er i det væsentlige stabile under hele forsøget. Hjerterytme sats derimod gradvist aftager efter induktion af det isoelektriske tilstand (fra 382 til 349 slag / min), som det ses på EKG. Klik her for at se en større version af dette tal.

Under kontrol- sessioner, de fysiologiske parametre lignede dem målt hos raske og vågne dyr 32-35 og forblev upåvirket efter induktion af den isoelektriske tilstand, bortset fra den puls, der var lidt langsommere (figur 1). Denne er et vigtigt punkt, da hypoxi 39 eller hyperkapni 40 markant kan ændre neuronal uro og dermed kan introducere en alvorlig skævhed i en stud y udforske en hjerne state-afhængig modulation af neuronale integrative egenskaber.

Vi opnåede det isoelektriske status fra to forskellige startbetingelser efterligner de kortikale dynamik endogent genererede i de tidlige stadier af søvn (Figur 2AA, venstre panel) eller under vågne (figur 2AB, venstre panel). Disse aktive stater blev enten induceret ved injektion af natriumpentobarbital (sleep-lignende) eller fentanyl (vågne-lignende). I begge tilfælde er den efterfølgende injektion af en høj dosis af natriumpentobarbital i en fuldstændig afskaffelse af spontan aktivitet i ECoG og samtidigt optagne neuroner (Figur 2AA og B, højre paneler), deraf udtrykket isoelektriske. Undertrykke igangværende synaptisk aktivitet resulterede i en signifikant stabil hyperpolarisering af den neuronale membran potentiale (figur 2B).

t "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 2
Figur 2. Konsekvenser af Synaptic Aktivitet Suppression på Spontane Dynamics of Membrane Potential.
(A) Samtidige repræsentative optagelser af ECoG (top spor) og intracellulære aktiviteter (Intra, nederste spor) under søvn-lignende (A a) og vågne-lignende (A b) mønstre (venstre paneler), og i de tilsvarende efterfølgende isoelektriske epoker (ved de angivne efter den undertrykkende injektion tider; Isoelectric, højre paneler). Tiden frekvens analyse af ECoG signaler (energitæthed for 0 - 50 Hz frekvensområdet) er vist ved farveskalaer. (B) Sandsynlighed tætheder (P) af membranpotentialet værdier (Vm, bin størrelse 0,5 mV, 10 sek af optagelse) fra neuronerne illustreret i panel A. Dette tal er modificeret, med tilladelse fra ref 29./ftp_upload/53576/53576fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

For at illustrere den funktionelle virkning af denne ekstreme hjerne tilstand, vi ekstraheret de passive og aktive iboende egenskaber isoelektriske neuroner og sammenlignede dem med dem, der måles i den tilsvarende indledende tilstand. Under anvendelse af denne strategi har vi vist, at neuroner kunne affyre aktionspotentialer i afhængighed intracellulær injektion af depolariserende strøm under det isoelektriske tilstand, hvilket viser, at de forblev fuldt overgearet selv efter fuldstændig undertrykkelse af baggrunden synaptisk aktivitet (figur 3AA og B, Isoelektrisk). Endvidere fandt vi, at overføringsfunktionen af ​​neuroner, bedømt ved måling af affyringsfrekvens induceret af trinnene depolariserende strøm af stigende intensitet (FI forholdet), var ret-forskudt i forhold til de oprindelige aktive betingelser, hvilket indikereret fald i følsomheden af neuroner til svage excitatoriske inputs (figur 3B). Den tilsvarende neuronal gevinst, dvs. hældningen af FI-kurven, forblev uændret eller reduceret, da kontrollen tilstand var søvn-eller vågner-type, (figur 3B). Overraskende blev den tilsyneladende input modstand af neuroner ikke ændret sig væsentligt i fravær af synaptisk drev sammenlignet med kontrol aktive betingelser (figur 3aa, b). Flere resultater, herunder befolkning analyse og kvantificering af de tidsmæssige fyring mønstre af neuroner i de aktive og isoelektriske betingelser, er tilgængelige i vores indledende papir 29.

Figur 3
Figur 3. Sammenlignende Virkningen af de tre Kortikal Aktivitet mønstre på Membrane Properties og input-output Relations.
(A) voltag e responser (midterste spor) af somatosensoriske kortikale neuroner til depolariserende og hyperpolarisering strømpulser (nederst spor) under søvn-lignende (A a) og vågne-lignende (A b) ECoG mønstre (øverst records) og efter fratagelse af synaptisk aktivitet (Isoelektrisk ). Membran input modstand (R m, værdier er angivet) blev målt fra spændingsfald (grå spor, gennemsnit af 20 forsøg) fremkaldt af hyperpolarisering aktuelle puls injektioner (-0,4 na). (B) Tilsvarende FI kurver, der giver overføringsfunktionen for neuronerne illustreret i panel (A). Den fyring sats blev målt som reaktion på depolariserende strømimpulser (200 ms varighed) med stigende intensitet. Hver strømstyrke blev påført 20 gange og de tilsvarende fyring satser blev midlet. De stiplede linjer angiver cellereaktioner vist i (A). Dette tal er blevet ændret, med tilladelse fra ref 29.upload / 53576 / 53576fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver her en ny metode til at undertrykke in vivo spontan cerebral elektrisk aktivitet på både netværk og cellulære niveauer. Denne procedure fører til en ekstrem hjerne tilstand, kendt som isoelektrisk bevidstløs 41. Fra et klinisk synspunkt, sådan electrocerebral inaktivitet er den mest alvorlige abnormitet, der kan ses på EEG. Det er for det meste forbundet med en irreversibel koma, med alle patienter enten døende eller fortsatte i en vedvarende vegetativ tilstand 42, men kan i det mindste delvist vendt når forårsaget af en forgiftning med centralnervesystemet depressivt medicin (såsom thiopental), en utilsigtet hypotermi 42 eller en asphyxial hjertestop 43. I vores eksperimentelle paradigme, er isoelektriske tilstand gradvis opnås ved en systemisk injektion af natriumpentobarbital ved høje doser, som først hurtigt inducerer en reduktion i hyppighed indhold ECoG, så en "burst-suppression" -tilstand41,42, hvilket fører endelig til en helt flad ECoG. På det intracellulære niveau, forsvinden af ​​spontan aktivitet følger en lignende tidsforløb med ledsagende reduktion af depolariserende og hyperpolariserende membranpotentialet udsving. Således kan det være en hypotese, at injektion af natrium pentobarbital først øger synaptiske hæmmende transmission fører til en reduktion af kortikale neuroner fyring aktivitet, en gradvis afskaffelse af excitatorisk og inhibitorisk synaptisk transmission, der endelig resulterer i isoelektriske ECoG og intracellulære aktiviteter 29,44. Kan fås Lignende overgange fra aktiv til isoelektriske ECoG mønstre efter administration af andre bedøvelsesmidler såsom ketamin (personlig observation) eller isofluran 45,46.

Proceduren kan forekomme relativt ligetil. Men på grund af den ekstremt dybe koma induceret, opretholdelse af de basale fysiologiske variable indennormalområdet er af afgørende betydning for en vellykket gennemførelse af forsøget. Ændringer i EtCO 2 udsving kan være resultatet af en mucus plug formning i luftrøret. I en sådan situation bør ventilatoren afbrydes og slim hurtigt opsuget eller udslettet gennem luftrørsslangen. Endvidere er den mekaniske stabilitet af præparatet er afgørende for intracellulære optagelser. Således bør der gøres en særlig indsats for at reducere vaskulære og respiratoriske pulseringer, ved forsigtigt at justere dyrets krop i forhold til hovedet og samtidig opretholde en ordentlig trakeal slange tilpasning, og ved at anvende agarose eller silikone elastomer på kraniotomi. Det er også nødvendigt at undgå spontane muskelkontraktioner ved injektion af en lammende middel. Endelig bør miljømæssige vibrationer og elektrisk støj reduceres så meget som muligt. Andre publikationer detaljeret redegørelse for de væsentlige skridt for en optimal in vivo forberedelse tillader stabil intracellulær eller patch-clamp derle-celle optagelser 29,47-50.

Evnen til at afkoble neuronale iboende membran egenskaber og netværk dynamik er afgørende for at dissekere de mekanismer, som de enkelte neuroner bearbejder information i deres stærkt forbundet miljø. Som anført i indledningen, tidligere undersøgelser, der afsættes til dette centrale spørgsmål om grundlæggende neurovidenskab ført til modstridende resultater, dels på grund af de særlige forhold i neuroner og netværk undersøgte og de ​​forskellige eksperimentelle betingelser, herunder in vitro vs in vivo præparater og i sidste ende den forskellige bedøvelsesmiddel procedurer, der anvendes (se for eksempel 29,36,51). Vi foreslår, at den nuværende fremgangsmåde kunne bruges til at validere, og muligvis forene, resultater opnået fra den reducerede in vitro forberedelse og fra in vivo forsøg. Faktisk er det muligt at direkte undersøge og sammenligne i samme neuron og i løbet af den samme eksperimentelle fremgangsmådevirkningen af ​​forskellige mønstre af afferente synaptiske input, fra vågne-lignende dynamik til at fuldføre inaktivitet, om de neuronale integrative egenskaber i et levende dyr.

Et karakteristisk træk ved denne protokol er, at når mestrer, det kunne kombineres med andre eksperimentelle teknikker, såsom multisite overflade og dybde EEG optagelser, genetisk kodet fluorescerende indikatorer baseret undersøgelser og endda hæmodynamisk og metabolisk billeddannelse af hjernen, at undersøge multidimensionelle egenskaber af det isoelektriske hjernen. Som kliniske og diagnostiske perspektiver, da vi påvist, at neuroner stadig samledes under vedvarende isoelektrisk bevidstløs, ville det være relevant at teste de kortikale funktioner, f.eks behandling af sensorisk information, for patienter og dyremodeller nedsænket i en sådan patologisk tilstand af hjernen inaktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Fondation de France, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Pierre & Marie Curie Universitet og programmet »Investissements d'Avenir" ANR-10-IAIHU-06.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital Centravet Pentobarbital
Ketamine 500 Merial Imalgène 500
Fentanyl  Janssen-Cilag Fentanyl
Xylocaine Centravet Xylovet
Gallamine triethiodide Sigma G8134
ECoG amplifier A-M Systems AC amplifier, Model 1700
Intracellular amplifier Molecular Devices Axoclamp 900A
Data acquisition interface Cambridge Electronic Design CED power 1401-3 
Data analysis software Cambridge Electronic Design Spike2 version 7
micromanipulator Scientifica IVM-3000
Capillary Puller Narishige PE-2
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-10
Silver wire 0.125 mm (intracellular recording) WPI AGT0525
Ag-AgCl reference Phymep E242
Silver wire 0.25 mm (ECoG recording) WPI AGT1025
Artificial respiration system Minerve Alpha Lab
Physiological parameters monitoring Digicare LifeWindow Lite
Heating Blanket Harvard Apparatus 507215
Stereomicroscope Leica M80
Scissors FST 15005-08
Forceps Dumont #5 FST 11295-10
Forceps Dumont #5SF FST 11252-00
IP Polyurethane catheter - 0.43x0.69 mm   Instech BTPU-027
Silicon elastomere WPI KWIK-CAST
Dental drill NSK Y1001151 and P496
Surgical glue 3M vetbond

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fatt, P., Katz, B. Some observations on biological noise. Nature. 166 (4223), 597-598 (1950).
  2. Brock, L. G., Coombs, J. S., Eccles, J. C. The recording of potentials from motoneurones with an intracellular electrode. J. Physiol. 117 (4), 431-460 (1952).
  3. Destexhe, A., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
  4. Silver, R. A. Neuronal arithmetic. Nat. Rev. Neurosci. 11 (7), 474-489 (2010).
  5. Azouz, R., Gray, C. M. Cellular mechanisms contributing to response variability of cortical neurons in vivo. J. Neurosci. 19 (6), 2209-2223 (1999).
  6. Sanchez-Vives, M. V., Nowak, L. G., McCormick, D. A. Membrane Mechanisms Underlying Contrast Adaptation in Cat Area 17 In Vivo. J. Neurosci. 222 (11), 4267-4285 (2000).
  7. Petersen, C. C. H., Hahn, T. T. G., Mehta, M., Grinvald, A., Sakmann, B. Interaction of sensory responses with spontaneous depolarization in layer 2/3 barrel cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (23), 13638-13643 (2003).
  8. Sachdev, R. N. S., Ebner, F. F., Wilson, C. J. Effect of Subthreshold Up and Down States on the Whisker-Evoked Response in Somatosensory Cortex. J. Neurophysiol. 92 (6), 3511-3521 (2004).
  9. Hasenstaub, A., Sachdev, R. N. S., McCormick, D. A. State Changes Rapidly Modulate Cortical Neuronal Responsiveness. J. Neurosci. 27 (36), 9607-9622 (2007).
  10. Chance, F. S., Abbott, L. F., Reyes, A. D. Gain modulation from background synaptic input. Neuron. 35 (4), 773-782 (2002).
  11. Shu, Y., Hasenstaub, A., Badoual, M., Bal, T., McCormick, D. A. Barrages of synaptic activity control the gain and sensitivity of cortical neurons. J. Neurosci. 23 (32), 10388-10401 (2003).
  12. Mitchell, S. J., Silver, R. A. Shunting inhibition modulates neuronal gain during synaptic excitation. Neuron. 38 (3), 433-445 (2003).
  13. Prescott, S. A., De Koninck, Y. Gain control of firing rate by shunting inhibition: roles of synaptic noise and dendritic saturation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 2076-2081 (2003).
  14. Graham, L. J., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and IBK in Rat and Cat Cortex. Dynamic-clamp: From principles to applications. , (2009).
  15. Fernandez, F. R., White, J. A. Gain control in CA1 pyramidal cells using changes in somatic conductance. J. Neurosci. 30 (1), 230-241 (2010).
  16. Polack, P. O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat. Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
  17. Zhou, M., Liang, F., et al. Scaling down of balanced excitation and inhibition by active behavioral states in auditory cortex. Nat. Neurosci. 17 (6), 841-850 (2014).
  18. Contreras, D., Destexhe, A., Sejnowski, T. J., Steriade, M. Spatiotemporal Patterns of Spindle Oscillations in Cortex and Thalamus. J. Neurosci. 17 (3), 1179-1196 (1997).
  19. Charpier, S., Mahon, S., Deniau, J. M. In vivo induction of striatal long-term potentiation by low-frequency stimulation of the cerebral cortex. Neuroscience. 91 (4), 1209-1222 (1999).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and Mechanisms of Wakefulness on Local Cortical Networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  21. Poulet, J. F. A., Fernandez, L. M. J., Crochet, S., Petersen, C. C. H. Thalamic control of cortical states. Nat. Neurosci. 15 (3), 370-372 (2012).
  22. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes, Third Edition. , Sinauer Associates. Sunderland, Mass. (2001).
  23. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
  24. Ferster, D., Chung, S., Wheat, H. Orientation selectivity of thalamic input to simple cells of cat visual cortex. Nature. 380 (6571), 249-252 (1996).
  25. Paré, D., Shink, E., Gaudreau, H., Destexhe, A., Lang, E. J. Impact of spontaneous synaptic activity on the resting properties of cat neocortical pyramidal neurons In vivo. J. Neurophysiol. 79 (3), 1450-1460 (1998).
  26. Destexhe, A., Paré, D. Impact of network activity on the integrative properties of neocortical pyramidal neurons in vivo. J. Neurophysiol. 81 (4), 1531-1547 (1999).
  27. Kara, P., Pezaris, J. S., Yurgenson, S., Reid, R. C. The spatial receptive field of thalamic inputs to single cortical simple cells revealed by the interaction of visual and electrical stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (25), 16261-16266 (2002).
  28. Lomber, S. G. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. J. Neurosci. Meth. 86 (2), 109-117 (1999).
  29. Altwegg-Boussac, T., Chavez, M., Mahon, S., Charpier, S. Excitability and responsiveness of rat barrel cortex neurons in the presence and absence of spontaneous synaptic activity in vivo. J. Physiol. 592 (16), 3577-3595 (2014).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl. Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates (2nd edn). , Academic Press. (1986).
  32. Wolfensohn, S. Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare. , Wiley-Blackwell. (2013).
  33. Bester, H., Chapman, V., Besson, J. M., Bernard, J. F. Physiological Properties of the Lamina I Spinoparabrachial Neurons in the Rat. J. Neurophysiol. 83 (4), 2239-2259 (2000).
  34. Greene, S. A. Veterinary Anesthesia and Pain Management Secrets. , Elsevier Health Sciences. (2002).
  35. Morgan, B. J., Adrian, R., Bates, M. L., Dopp, J. M., Dempsey, J. A. Quantifying hypoxia-induced chemoreceptor sensitivity in the awake rodent. J. Appl. Physiol. 117 (7), 816-824 (2014).
  36. Mahon, S., Deniau, J. M., Charpier, S. Relationship between EEG potentials and intracellular activity of striatal and cortico-striatal neurons: an in vivo study under different anesthetics. Cereb. Cortex. 11 (4), 360-373 (2001).
  37. Ganes, T., Lundar, T. The effect of thiopentone on somatosensory evoked responses and EEGs in comatose patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 46 (6), 509-514 (1983).
  38. Schmid-Elsaesser, R., Schröder, M., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. EEG burst suppression is not necessary for maximum barbiturate protection in transient focal cerebral ischemia in the rat. J. Neurol. Sci. 162 (1), 14-19 (1999).
  39. Cummins, T. R., Jiang, C., Haddad, G. G. Human neocortical excitability is decreased during anoxia via sodium channel modulation. J Clin Invest. 91 (2), 608-615 (1993).
  40. Gu, X. Q., Kanaan, A., Yao, H., Haddad, G. G. Chronic High-Inspired CO2 Decreases Excitability of Mouse Hippocampal Neurons. J. Neurophysiol. 97 (2), 1833-1838 (2007).
  41. Lehembre, R., Gosseries, O., et al. Electrophysiological investigations of brain function in coma, vegetative and minimally conscious patients. Arch Ital Biol. 150 (2/3), 122-139 (2012).
  42. Husain, A. M. Electroencephalographic assessment of coma. J Clin Neurophysiol. 23 (3), 208-220 (2006).
  43. Fink, E. L., Alexander, H., et al. An Experimental Model of Pediatric Asphyxial Cardiopulmonary Arrest in Rats. Pediatr Crit Care Med. 5 (2), 139-144 (2004).
  44. Lukatch, H. S., McIver, M. B. Synaptic mechanisms of thiopental-induced alterations insynchronized cortical activity. Anesthesiology. 84, 1425-1434 (1996).
  45. Kroeger, D., Amzica, F. Hypersensitivity of the anesthesia-induced comatose brain. J Neurosci. 27, 10597-10607 (2007).
  46. Kroeger, D., Florea, B., Amzica, F. Human brain activity patterns beyond the isoelectric line of extreme deep coma. PLoS ONE. 8 (9), e75257 (2013).
  47. Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Arch. 444 (4), 491-498 (2002).
  48. DeWeese, M. Whole-Cell Recording In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. , (2007).
  49. Schramm, A. E., Marinazzo, D., Gener, T., Graham, L. J. The Touch and Zap Method for In Vivo Whole-Cell Patch Recording of Intrinsic and Visual Responses of Cortical Neurons and Glial Cells. PLoS ONE. 9 (5), e97310 (2014).
  50. Mahon, S., Charpier, S. Bidirectional Plasticity of Intrinsic Excitability Controls Sensory Inputs Efficiency in Layer 5 Barrel Cortex Neurons in Vivo. J. Neurosci. 32 (33), 11377-11389 (2012).
  51. Destexhe, A., Rudolph, M., Paré, D. The high-conductance state of neocortical neurons in vivo. Nat. Rev. Neurosci. 4 (9), 739-751 (2003).

Tags

Neuroscience intracellulære optagelser, ophidselse synaptisk aktivitet ECoG isoelektrisk cerebrale cortex koma fysiologiske konstanter
Induktion af en Isoelectric Brain State til at undersøge betydningen af ​​endogene Synaptic aktivitet på neuronexcitabilitet<em&gt; In vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Altwegg-Boussac, T., Mahon, S.,… More

Altwegg-Boussac, T., Mahon, S., Chavez, M., Charpier, S., Schramm, A. E. Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo. J. Vis. Exp. (109), e53576, doi:10.3791/53576 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter