Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Induksjon av et isoelektrisk Brain State å undersøke effekten av endogent Synaptic aktivitet på neuronal Excitability Published: March 31, 2016 doi: 10.3791/53576
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

Summary

Denne prosedyren utfører langvarig in vivo intracellulære opptak fra enkeltnerveceller under fysiologisk relevante hjernetilstander og etter fullstendig avskaffelse av pågående elektriske aktivitet, noe som resulterer i en isoelektrisk hjernen tilstand. De fysiologiske konstanter av dyret er nøye overvåket under overgangen til kunstig koma tilstand.

Abstract

Måten neuroner behandle informasjon avhenger både av deres iboende membranens egenskaper og på dynamikken i den synaptiske afferent nettverket. Spesielt endogent generert nettverk aktivitet, som sterkt varierer som en funksjon av tilstanden av årvåkenhet, modulerer neuronal beregning betydelig. For å undersøke hvordan forskjellige spontane cerebrale dynamikk påvirke enkelt neuroner 'integrerende egenskaper, har vi utviklet en ny eksperimentell strategi i rotte som består i å undertrykke in vivo alle cerebral aktivitet ved hjelp av en systemisk injeksjon av en høy dose av natriumpentobarbital. Kortikale aktiviteter, kontinuerlig overvåket av kombinert electrocorticogram (ECOG) og intracellulære opptakene blir gradvis bremset ned, noe som fører til en jevn isoelektrisk profil. Denne ekstreme hjernen staten, sette rotte inn i en dyp koma, ble nøye overvåket ved å måle de fysiologiske konstanter av dyret gjennom eksperimenter. intracellulær recordings tillatt oss å karakterisere og sammenligne integrerende egenskaper av samme nervecellen innebygd i fysiologisk relevante cortical dynamikk, slik som de møtte i sove-våkne syklus, og når hjernen var fullt stille.

Introduction

I fravær av eventuelle miljømessige stimuli eller atferds oppgaver, genererer den "hvile" brain en kontinuerlig strøm av elektrisk aktivitet som kan tas opp fra hodebunnen, som (EEG) bølger. Den intracellulære korrelat av dette endogene cerebrale aktivitet er kjennetegnet ved bakgrunn membranspenningsvariasjoner (også kjent som "synaptisk noise"), som er sammensatt av en kombinasjon av eksitatoriske og hemmende synaptiske potensialer som reflekterer den pågående aktivitet av afferent nettverk 1,2. Dette spontan aktivitet varierer i frekvens og amplitude med de forskjellige tilstander av årvåkenhet. Belyse effekten av nettverksaktivitet på oppstemthet og responsen til enkeltnerveceller er en av de store utfordringene i nevrovitenskap 3,4.

Mange eksperimentelle og beregnings studier har utforsket den funksjonelle effekten av pågående synaptisk aktivitet på integrerende properties av nerveceller. Men rollen til de ulike nevrale parametere påvirket av bakgrunns synaptiske støy fortsatt ukjent. For eksempel har det midlere nivå av membran depolarisering blitt funnet positivt eller negativt 5,6 7-9 korrelert med evnen til sanseinntrykk for å utløse aksjonspotensialer. Videre, mens noen undersøkelser tyder på at svingninger i membranpotensialet, som følge av en kontinuerlig varierende strøm av afferent synaptiske innganger, sterkt påvirker respons fra enkeltnerveceller ved å modulere gevinsten av deres input-output forhold 3,10-13, andre viser at endringer i membraninngangs konduktans mediert av shunting inhibering er tilstrekkelig til å modulere den neuronale forsterkningen uavhengig av størrelsen av membransvingninger 14,15. Til slutt, nyere studier utført på våken dyr streket hvordan behandlingen av sensorisk informasjon i enkelt nevron kritisk avhengig av tilstand av årvåkenhet ennd gjeldende atferds etterspørselen 16,17.

En enkel strategi for å klargjøre den funksjonelle rollen til en gitt prosess i et sterkt sammenhengende system, er å bestemme hvor dens fravær spesifikt endrer funksjon av systemet. Denne metoden har vært mye brukt i nevrovitenskap forskning, for eksempel ved hjelp av eksperimentelle lesjoner eller inaktivering av ulike hjerneområder 18-21, eller farmakologisk blokkering av spesifikke ionekanaler 22,23. Spesielt, har det vært anvendt in vivo for å avsløre hvor funksjonelle tilkobling og nettverksdynamikk påvirke enkelt celle beregning 24-27. Men til dags dato lokale manipulasjoner ment å blokkere avfyring av nevroner og / eller forstyrre deres grunnleggende biofysiske egenskaper kan være delvis effektive og er begrenset til relativt små hjernevolum 28.

For å overvinne disse begrensningene, har vi utviklet en ny in vivo eksperimentell tilnærming irotte å sammenligne elektrofysiologiske egenskapene til enkelt nevroner registrert i en gitt hjerne tilstand, dvs. innebygd i en bestemt nettverk dynamisk, til de som ble oppnådd etter fullstendig undertrykkelse av hele hjernen synaptisk aktivitet 29. I kontrollbetingelsene, ble to adskilte kortikale dynamikk bli generert. Søvn-lignende electrocorticographic (ECOG) mønstre ble indusert ved injeksjon av moderate doser av natrium pentobarbital. Alternativt kan fast ECOG bølger med liten amplitude sammenlignes med det kortikale aktivitet som ligger under våken tilstand (våken-lignende mønster) fremstilles ved injeksjon av fentanyl. Deretter, og samtidig opprettholde den samme ECOG og intracellulære opptaket, ble en fullstendig stanse av endogen hjernens elektriske aktivitet som oppnås ved systemisk injeksjon av en høy dose av natriumpentobarbital, karakterisert ved isoelektrisk ECOG og intracellulære aktivitet. På grunn av at induksjon av en slik ekstrem koma kan potensielt ha dødelig derav følgendeces på biologiske funksjoner, en forsiktig og kontinuerlig overvåking av de fysiologiske variablene var avgjørende. Derfor har vi omhyggelig fulgt hjerteslagfrekvens, slutttidevanns CO 2 konsentrasjon (EtCO 2), O 2 metning (SpO2) og kjernetemperaturen av rotter gjennom forsøkene.

Vi evaluerer enkelt nevroner eiendommer i løpet av disse forskjellige stater bruker skarpe mikroelektroder, som er spesielt egnet for lange og stabile opptak i vivo. Den fremgangsmåte som er beskrevet her, kan kombineres med andre elektrofysiologiske og bildedannende fremgangsmåter og kan bli utvidet til andre dyremodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene i EU (direktiv 2010/63 / EU) og godkjent av Charles Darwin Etisk komité for forsøk med dyr. Vi beskriver her prosedyren vi rutinemessig bruk i vårt laboratorium, men de fleste fremgangsmåten kan tilpasses for å passe alles spesifikke behov.

1. Kirurgisk Forberedelse

Merk: Alle snitt og trykkpunkter skal gjentatte ganger infiltrert med lokalbedøvelse (lidokain eller bupivacaine). Den foreliggende fremgangsmåte er terminal, hvis en aseptisk fremstilling kreves flere modifikasjoner bør iverksettes.

  1. Bedøve en rotte med natriumpentobarbital (40 mg / kg) og ketamin (50 mg / kg) i to lokalt separert intraperitoneale (IP) injeksjoner.
  2. La dyret går under narkose og gjentatte ganger bekrefte at en kirurgisk plan av anestesi oppnås (ingen reaksjon til tå knipe). Plasser rotte på en feedback varmeteppet og setter inn en rektal probe for å opprettholde kjernetemperatur rundt 37 ° C.
  3. Plasser et kateter i bukhulen for å lette påfølgende injeksjon av anestesimidler og for å unngå perforering organer ved gjentatte nål punkteringer 30.
    1. Klem håret over en liten (~ 2-3 mm) området over en region som ligger innenfor magens nedre høyre eller venstre kvadrant.
      Merk: Hårfjernings krem ​​kan også brukes.
    2. Lag en 2-3 mm snitt på huden med skarp saks eller en skalpell. Ved hjelp av stump disseksjon, fjerne fett og muskellagene til bukhulen er observert.
    3. Sett omtrent 1 - 2 cm av et lite kateter i hulrommet og lukke såret med kirurgisk lim.
      (. Eksempel 2 fransk - svarende til 0,043 mm innvendig diameter): Merk diameter og den totale lengde av kateteret bør være minimal for å redusere dødvolumer. Polyuretan rør er mest egnet.
    4. Lag en løkke og sutur than kateter til huden for å feste den på plass.
  4. Installer en trakealtuben å styre ventilasjon under kunstig åndedrett.
    1. Som for forrige trinn, forberede området av interesse (1 - 2 cm over luftrøret rett over manubrium), fjerne hår og langsgående snitt i huden.
    2. Blunt dissekere de første lag av fett og muskler, og deretter flytte spyttkjertelen til side og avsløre luftrøret ved å forsiktig dissekere det siste laget av muskler.
    3. Fjern forsiktig vev over luftrøret og skyver en tråd under den ved hjelp av små tang. Lag en kirurg knute med tråden, men ikke stram det ennå.
    4. Incise luftrøret tvers mellom to bruskringer. Vattpinne blod i luftrøret hvis noen.
    5. Sett inn en trakealtuben med riktig diameter og stram tråden er knute for å feste røret stødig. For ytterligere stabilitet tråden kan videre være knyttet til et høyere punkt av luftrøret røret.
    6. Suture såret nær eller bruke Agraff. Unngå kirurgisk lim her hvis det trakeale røret er beregnet på å brukes om igjen.
  5. Installer dyret i en stereotaxic ramme og nøye overvåke følgende fysiologiske variabler: ECOG, SPO 2, EtCO 2, puls (via et elektro, EKG) og innvendig temperatur. Overvåke og justere disse variablene for å holde en skikkelig anestesidybden og fysiologisk tilstand. Nærmere bestemt supplere anestesi med en liten dose (10 mg / kg) av natriumpentobarbital om nødvendig.
  6. Påfør øye salve på begge øynene for å unngå uttørking. Klem håret over hodebunnen, lag et langsgående snitt (~ 2 cm) og resect bindevev liggende skallen ved hjelp av en skalpell eller en kyrette.
  7. Lag en liten (~ 1,5 mm diameter) craniotomy over regionen av interesse med en tannlege drill.
    Merk: Her er sylinderen feltet av den primære somatosensory cortex målrettet (7 - 8 mm anterior til interaural linje, 4.5- 5,5 mm lateralt i forhold til midtlinjen 31). Skyll flere ganger for å spre varme.
  8. Bruk ekstra fin pinsett for å forsiktig lage et lite hull i dura. Reservere en ~ 0,5 mm region i den kraniale trepanasjon å plassere ECOG elektrode (se neste trinn). Permanent holde cortex fuktig med 0,9% NaCl-løsning (eller kunstig cerebrospinalvæske).
  9. Plasser en lav impedans (~ 60 kohm) sølv elektrode (den ECOG elektrode) på dura, unngå kortikale regionen som ikke dekkes av hjernehinnene, og plasser referanseelektrode på en skalp muskel på den andre siden av hodet.
  10. På dette stadiet (30 min etter den siste injeksjon av natriumpentobarbital), opprettholde anestesi ved gjentatte injeksjoner av natriumpentobarbital (10-15 mg / kg / t) eller fentanyl (3-6 ug / kg / t) via IP-kateteret. Førstnevnte vil resultere i en langsom oscillerende, søvn-lignende, ECOG mønster mens den sistnevnte vil resultere i en desynkronisert, våkner aktig, kortikale profil.
  11. Juster kunstig ventilasjon systemet slik at det respiratoriske frekvens og volum er lik de av rotte spontan pusting (normalt område 70-115 åndedrag / min 32). Deretter kobler du mekanisk ventilasjon til trakealtuben og å sjekke at brystkassen inflasjon (på begge sider). Hvis ikke, justere plasseringen av ventilasjonsrøret i tracheal akse. Om nødvendig kan suge opp den sekresjon som er tilstede i luftrøret med et kateter som er koblet til en sprøyte eller en vakuumpumpe.
  12. Dersom alle fysiologiske variable 32-35 og ECOG 29,36 mønstre reflekterer en stabil kirurgisk plan av anestesi, gjør en intramuskulær injeksjon av gallamin trietiodid i hvert ben for å lamme rotte, 40 mg / kg for den første injeksjon, og deretter 20 mg / kg hver 2t 19,29,36,50.

2. Intracellulær Recordings

  1. Trekk et glass mikropipette (skarp microelectrode) med en ~ 0,2 mikrometer tips som sin motstand varierer between 50 og 80 Megohm gang fylt med 2 M kaliumacetat (KAc).
  2. Sett pipetten i en bestemt holder med en sølv / sølv-klorid (Ag / AgCl) ledning til å koble pipetten løsningen til en intracellulær forsterker (via et hode scenen). Holderen skal være knyttet til en micromanipulator. Plasser en Ag / AgCl referanseelektrode på rotte nakkemusklene.
  3. Sakte setter pipetten i hjernen ned til regionen av interesse og bekrefte sin motstand ved å overvåke spenningsfall i respons til dagens trinn. Bruk buzz (eller zappe) knapp på forsterkeren for å tømme pipetten hvis nødvendig.
  4. Bruk bomullspinner eller syntetiske absorpsjon trekanter å tørke kraniotomi (vær forsiktig så du ikke berører ECOG eller intracellulære elektroder) før du dekker den med silikon eller 4% agarose å redusere hjerne bevegelser.
  5. Senk pipette i 1 - 2 mikrometer trinnene til motstanden øker når det nærmer seg en celle. Deretter bruker buzz funksjon av forsterkeren til inntregningte inn i nervecellen.

3. indusere Isoelektrisk State

  1. Utfør den aktuelle forsøksprotokoll (for eksempel skyting svar på intracellulært injisert strøm, strøm-spenning relasjoner, sensoriske stimuli svar) på dette stadiet mens overvåking samtidig nevronets membranpotensialet, den ECOG og de ​​fysiologiske variabler.
  2. Sørge for at den intracellulære elektrode er stabilt i cellen ved å analysere stødigheten både membranen og potensielle virkningspotensialet egenskaper gjennom hele opptak. Hvis ikke, må du ikke gå til neste trinn og vente til opptaket blir stabil igjen, eller søk etter en annen nervecelle.
  3. Injisere en høy men infra-dødelig dose av natriumpentobarbital (~ 90 mg / kg, kan være så lav som 35 mg / kg fra den pentobarbital opprinnelige tilstand og opp til 155 mg / kg fra den fentanyl innledende tilstand) via IP linje.
    Merk: Innen 15-20 min den intracellulære og ECOG waveforms bør avta med intermitterende elektriske stillhet til forbigående nå den såkalte "burst-undertrykkelse" profil 37,38, som gradvis kollapser til en komplett isoelektrisk tilstand. Det er forventet at pulsen betydelig bremser ned (ved ~ 10 - 20%), men den SpO 2 og EtCO 2 bør være forholdsvis stabil.
  4. Dersom det isoelektriske tilstand ikke oppnås, injisere en liten mengde natrium-pentobarbital (~ 10% av det trinn 3.1 dose). Vent 15 minutter før du legger mer bedøvelse dersom isoelektrisk tilstand er fortsatt ikke nådd.
  5. Gjenta forsøksprotokoll for å sammenligne effekten av nettverksdynamikk på den innspilte nevronets integrerende egenskaper.
    Merk: Etter opphør av anestesi injeksjoner, bør den elektriske hjerneaktiviteten fullt igjen i løpet av 3-4 timer.
  6. Ved slutten av eksperimentet, injiserer en dødelig dose av natriumpentobarbital (200 mg / kg, IP) for å avlive rotte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Indusere og opprettholde en isoelektrisk hjernen staten er en delikat in vivo eksperimentell prosedyre. Det har vist seg å være et kraftig verktøy for å direkte studere virkningen av kortikale nettverk aktivitet på nevronale eksitabilitet og overføring funksjon 29. Figur 1 viser multi-parameter overvåking, inkludert ECOG og viktige konstanter, av dyrets fysiologiske tilstand før (figur 1A ) og etter (figur 1B) frembringelse av det isoelektriske tilstand.

Figur 1
Figur 1. Overvåking av fysiologiske parametere i Kontroll og isoelektrisk betingelser.
A og B, samtidige opptak av ECOG (øverste spor) og fysiologiske parametre under aktiv kortikal tilstand (A) og ubåterequent isoelektrisk periode (B). Kjernetemperatur (Temp.), EtCO 2 og SpO 2 er i hovedsak stabil gjennom hele forsøket. Hjerteslag rate, i motsetning, gradvis reduseres etter induksjon av isoelektrisk tilstand (fra 382 til 349 slag / min), sett på EKG. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Under kontroll sesjoner, de fysiologiske parametre var lik de som ble målt hos friske og våken dyr 32-35 og forble upåvirket etter induksjon av det isoelektriske tilstand, med unntak av hjertefrekvensen som ble svakt bremset ned (figur 1). Denne er et viktig punkt siden hypoksi 39 eller hyperkapni 40 kan markant endre nevronale eksitabilitet og dermed kan innføre en alvorlig skjevhet i en stud y utforske en hjerne tilstandsavhengig modulering av nerve integrerende egenskaper.

Vi fikk isoelektrisk status fra to forskjellige startbetingelser ligne kortikale dynamikk endogent-generert i løpet av de tidlige stadier av søvn (figur 2AA, venstre panel) eller under våkne (figur 2AB, venstre panel). Disse aktive statene ble enten indusert ved injeksjon av natrium pentobarbital (søvnlignende) eller fentanyl (våkne-lignende). I begge tilfeller vil den etterfølgende injeksjon av en høy dose av natriumpentobarbital resulterte i en fullstendig opphevelse av spontan aktivitet i ECOG og samtidig registrerte neuronene (fig 2AA og b, høyre panel), derav uttrykket isoelektriske. Undertrykke den pågående synaptisk aktivitet resulterte i en betydelig jevn hyperpolarisering av nevronale membranpotensialet (figur 2B).

t "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Figur 2. Konsekvenser av Synaptic aktivitet Suppression på den spontane Dynamics of membranpotensialet.
(A) Samtidige representative opptak av ECOG (øverste spor) og intracellulære aktiviteter (Intra, bunn spor) under søvn-lignende (A a) og våkner-lignende (A b) mønstre (venstre panel), og i løpet av de tilsvarende påfølgende isoelektriske epoker (ved tidspunktene angitt etter undertrykkende injeksjon, isoelektrisk, høyre panel). Tidsfrekvensanalyse av ECOG signaler (energitetthet for 0-50 Hz frekvensområde) er avbildet i fargeskalaer. (B) sannsynlighetstettheter (P) av membran mulige verdiene (Vm, bin størrelse 0,5 mV, 10 sek av opptak) fra neuronene illustrert i panel A. Dette tallet har blitt modifisert, med tillatelse, fra ref 29./ftp_upload/53576/53576fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å illustrere den funksjonelle effekten av denne ekstreme hjernen staten, hentet vi passive og aktive iboende egenskaper isoelektriske nevroner og sammenlignet dem med de som er målt under den tilsvarende initial tilstand. Ved hjelp av denne strategien, har vi vist at neuroner kunne skyte aksjonspotensial som reaksjon på intracellulær injeksjon av depolariserende strøm under det isoelektriske tilstand, noe som viser at de forble fullstendig nervøs selv etter fullstendig undertrykkelse av bakgrunns synaptisk aktivitet (figur 3AA og b, Isoelektrisk). Videre har vi funnet at overføringsfunksjonen av neuroner, vurdert ved å måle avfyringsfrekvens indusert ved trinnene med depolariserende strøm av økende intensitet (FI-forhold), ble høyreforskjøvet i forhold til de opprinnelige aktive forholdene, indikereren reduksjon i følsomheten av neuroner overfor svake eksitatoriske innganger (figur 3B). Den tilsvarende neuronal forsterkning, dvs. helningen av den kurve FI, forble uforandret eller redusert når kontrolltilstanden var av søvn-eller våkne-type, henholdsvis (figur 3B). Overraskende er den tilsynelatende inngangsmotstanden av neuroner ble ikke signifikant endret i fravær av synaptiske drivsammenlignet med kontroll aktive betingelser (figur 3AA, b). Flere resultater, inkludert befolkningen analyse og kvantifisering av de time avfyring mønstre av nerveceller i de aktive og isoelektriske forhold, er tilgjengelig i vår opprinnelige papir 29.

Figur 3
Figur 3. Sammen betydningen av alle tre kortikal aktivitet mønstre på membranens egenskaper og kryssløps Relations.
(A) Voltag e svar (midterste spor) av somatosensoriske kortikale nevroner å depolariserende og hyperpolariserer strømpulser (nederst spor) under søvn-lignende (A a) og våkner-lignende (A b) ECOG mønstre (øverst records) og etter berøvelse av synaptisk aktivitet Isoelectric ( ). Membran inngangsmotstand (R m, verdiene er angitt) ble målt fra spenningsfall (grå spor, gjennomsnitt på 20 forsøk) indusert av hyperpolariserer nåværende puls injeksjoner (-0,4 NA). (B) Tilsvarende FI kurver, noe som gir overføringsfunksjonen av neuronene som er illustrert i panel (A). Forbrenningsintensiteten ble målt som respons på depolariserende strømpulser (200 msek varighet) med økende intensitet. Hvert strømstyrker ble brukt 20 ganger og de tilsvarende skuddhastigheter ble i gjennomsnitt. De stiplede linjer indikerer celleresponser som er vist i (A). Dette tallet har blitt endret, med tillatelse, fra ref 29.laste opp / 53576 / 53576fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver her en ny metode for å undertrykke in vivo spontan cerebral elektrisk aktivitet ved både nettverk og cellulære nivåer. Denne fremgangsmåten fører til ekstrem hjernen tilstand, kjent som isoelektrisk komatøs 41. Fra et klinisk synspunkt, er en slik electrocerebral inaktivitet den mest alvorlige avvik som kan ses på EEG. Den er for det meste forbundet med en irreversibel koma, med alle pasienter enten dør eller fortsetter i en vegetativ tilstand 42, men kan i det minste delvis reversert når forårsaket av en forgiftning med sentralnervesystemet medisiner (for eksempel tiopental), et utilsiktet hypotermi 42 eller en asphyxial hjertestans 43. I vårt eksperimentelle paradigmet blir isoelektriske tilstand progressivt oppnås ved systemisk injeksjon av natriumpentobarbital ved høye doser, som først hurtig induserer en reduksjon i den ECOG frekvensinnhold, da en "burst-undertrykkelse" -modus41,42, som fører til slutt til en fullstendig flat ECOG. På den intracellulære nivå, forsvinningen av spontan aktivitet følger et lignende tidsforløp med samtidig reduksjon av depolariserende og Hyperpolarizing membran potensielle svingninger. Dermed kan det bli antatt at injeksjon av natriumpentobarbital øker først den synaptisk hemmende overføring fører til en reduksjon av kortikale nevroner avfyring aktivitet, den progressive avskaffelse av stimulerende og hemmende synaptisk transmisjon som til slutt resulterer i isoelektriske ECOG og intracellulære aktivitet 29,44. Lignende overganger fra aktiv isoelektrisk ECOG mønstre kan fås etter administrering av andre anestetika som ketamin (personlig observasjon) eller isofluran 45,46.

Fremgangsmåten kan vises relativt enkelt. Men på grunn av den ekstremt dype koma indusert, opprettholder de grunnleggende fysiologiske variabler innenfornormalområdet er av avgjørende betydning for å lykkes med forsøket. Endringer i EtCO 2 svingninger kan være et resultat av en plugg som danner slim i luftrøret. I en slik situasjon bør respiratoren frakoples og slimet raskt suget eller visket ut gjennom tracheal røret. Dessuten er den mekaniske stabilitet av preparatet avgjørende for intracellulære opptak. Derfor bør spesielle tiltak iverksettes for å redusere kar- og luftveispulseringer, etter nøye justering av dyrets kropp i forhold til hodet og samtidig opprettholde en forsvarlig tracheal rør justering, og ved å bruke agarose eller silikon elastomer på kraniotomi. Det er også nødvendig å unngå spontane muskelsammentrekninger ved injeksjon av en paralyserende middel. Til slutt bør miljømessige vibrasjoner og elektrisk støy reduseres så mye som mulig. Andre publikasjoner detalj de viktige skritt for en optimal in vivo forberedelse slik stabil intracellulær eller patch-clamp somle-celle opptak 29,47-50.

Evnen til å kople nevronale indre membranegenskaper og nettverk dynamikk er viktig å dissekere de mekanismer som enkelte nevroner behandler informasjon i sine svært tilkoblet miljø. Som nevnt i innledningen, tidligere studier som omhandler dette sentrale spørsmålet om grunnleggende nevrovitenskap førte til motstridende resultater, delvis på grunn av de spesielle funksjonene i nerveceller og nettverk undersøkte og de ​​ulike eksperimentelle forhold, inkludert in vitro vs in vivo forberedelser og, til slutt, forskjellige anestesi prosedyrer som brukes (se for eksempel 29,36,51). Vi foreslår at den foreliggende metode kan brukes til å validere, og eventuelt forene, resultatene oppnådd fra den reduserte in vitro preparat og fra in vivo-forsøk. Faktisk gjør det mulig å undersøke direkte og sammenlignes i samme neuron, og i løpet av den samme eksperimentelle prosedyrevirkningen av forskjellige mønstre av afferente synaptiske innganger, fra å våkne-lignende dynamikk til full aktivitet, på den neuronale integrerende egenskaper i et levende dyr.

Ett særtrekk ved denne protokollen er at når mestret, det kan kombineres med andre eksperimentelle teknikker, for eksempel flersteds overflate og dybde EEG opptak, genetisk kodet fluorescerende indikatorer basert undersøkelser og selv hemodynamisk og metabolsk avbildning av hjernen, for å undersøke flerdimensjonale egenskapene til det isoelektriske hjernen. Som kliniske og diagnostiske perspektiver, siden vi demonstrert at neuroner fremdeles er eksiterbart under vedvarende isoelektrisk bevisstløs, vil det være aktuelt å teste kortikale funksjoner, for eksempel behandling av sensorisk informasjon, av pasienter og dyremodeller nedsenket i en slik patologisk tilstand av hjerne inaktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Fondation de France, Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE, Pierre & Marie Curie University og programmets Investissements d'avenir 'ANR-10-IAIHU-06.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital Centravet Pentobarbital
Ketamine 500 Merial Imalgène 500
Fentanyl  Janssen-Cilag Fentanyl
Xylocaine Centravet Xylovet
Gallamine triethiodide Sigma G8134
ECoG amplifier A-M Systems AC amplifier, Model 1700
Intracellular amplifier Molecular Devices Axoclamp 900A
Data acquisition interface Cambridge Electronic Design CED power 1401-3 
Data analysis software Cambridge Electronic Design Spike2 version 7
micromanipulator Scientifica IVM-3000
Capillary Puller Narishige PE-2
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-10
Silver wire 0.125 mm (intracellular recording) WPI AGT0525
Ag-AgCl reference Phymep E242
Silver wire 0.25 mm (ECoG recording) WPI AGT1025
Artificial respiration system Minerve Alpha Lab
Physiological parameters monitoring Digicare LifeWindow Lite
Heating Blanket Harvard Apparatus 507215
Stereomicroscope Leica M80
Scissors FST 15005-08
Forceps Dumont #5 FST 11295-10
Forceps Dumont #5SF FST 11252-00
IP Polyurethane catheter - 0.43x0.69 mm   Instech BTPU-027
Silicon elastomere WPI KWIK-CAST
Dental drill NSK Y1001151 and P496
Surgical glue 3M vetbond

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fatt, P., Katz, B. Some observations on biological noise. Nature. 166 (4223), 597-598 (1950).
  2. Brock, L. G., Coombs, J. S., Eccles, J. C. The recording of potentials from motoneurones with an intracellular electrode. J. Physiol. 117 (4), 431-460 (1952).
  3. Destexhe, A., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
  4. Silver, R. A. Neuronal arithmetic. Nat. Rev. Neurosci. 11 (7), 474-489 (2010).
  5. Azouz, R., Gray, C. M. Cellular mechanisms contributing to response variability of cortical neurons in vivo. J. Neurosci. 19 (6), 2209-2223 (1999).
  6. Sanchez-Vives, M. V., Nowak, L. G., McCormick, D. A. Membrane Mechanisms Underlying Contrast Adaptation in Cat Area 17 In Vivo. J. Neurosci. 222 (11), 4267-4285 (2000).
  7. Petersen, C. C. H., Hahn, T. T. G., Mehta, M., Grinvald, A., Sakmann, B. Interaction of sensory responses with spontaneous depolarization in layer 2/3 barrel cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (23), 13638-13643 (2003).
  8. Sachdev, R. N. S., Ebner, F. F., Wilson, C. J. Effect of Subthreshold Up and Down States on the Whisker-Evoked Response in Somatosensory Cortex. J. Neurophysiol. 92 (6), 3511-3521 (2004).
  9. Hasenstaub, A., Sachdev, R. N. S., McCormick, D. A. State Changes Rapidly Modulate Cortical Neuronal Responsiveness. J. Neurosci. 27 (36), 9607-9622 (2007).
  10. Chance, F. S., Abbott, L. F., Reyes, A. D. Gain modulation from background synaptic input. Neuron. 35 (4), 773-782 (2002).
  11. Shu, Y., Hasenstaub, A., Badoual, M., Bal, T., McCormick, D. A. Barrages of synaptic activity control the gain and sensitivity of cortical neurons. J. Neurosci. 23 (32), 10388-10401 (2003).
  12. Mitchell, S. J., Silver, R. A. Shunting inhibition modulates neuronal gain during synaptic excitation. Neuron. 38 (3), 433-445 (2003).
  13. Prescott, S. A., De Koninck, Y. Gain control of firing rate by shunting inhibition: roles of synaptic noise and dendritic saturation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 2076-2081 (2003).
  14. Graham, L. J., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and IBK in Rat and Cat Cortex. Dynamic-clamp: From principles to applications. , (2009).
  15. Fernandez, F. R., White, J. A. Gain control in CA1 pyramidal cells using changes in somatic conductance. J. Neurosci. 30 (1), 230-241 (2010).
  16. Polack, P. O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat. Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
  17. Zhou, M., Liang, F., et al. Scaling down of balanced excitation and inhibition by active behavioral states in auditory cortex. Nat. Neurosci. 17 (6), 841-850 (2014).
  18. Contreras, D., Destexhe, A., Sejnowski, T. J., Steriade, M. Spatiotemporal Patterns of Spindle Oscillations in Cortex and Thalamus. J. Neurosci. 17 (3), 1179-1196 (1997).
  19. Charpier, S., Mahon, S., Deniau, J. M. In vivo induction of striatal long-term potentiation by low-frequency stimulation of the cerebral cortex. Neuroscience. 91 (4), 1209-1222 (1999).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and Mechanisms of Wakefulness on Local Cortical Networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  21. Poulet, J. F. A., Fernandez, L. M. J., Crochet, S., Petersen, C. C. H. Thalamic control of cortical states. Nat. Neurosci. 15 (3), 370-372 (2012).
  22. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes, Third Edition. , Sinauer Associates. Sunderland, Mass. (2001).
  23. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
  24. Ferster, D., Chung, S., Wheat, H. Orientation selectivity of thalamic input to simple cells of cat visual cortex. Nature. 380 (6571), 249-252 (1996).
  25. Paré, D., Shink, E., Gaudreau, H., Destexhe, A., Lang, E. J. Impact of spontaneous synaptic activity on the resting properties of cat neocortical pyramidal neurons In vivo. J. Neurophysiol. 79 (3), 1450-1460 (1998).
  26. Destexhe, A., Paré, D. Impact of network activity on the integrative properties of neocortical pyramidal neurons in vivo. J. Neurophysiol. 81 (4), 1531-1547 (1999).
  27. Kara, P., Pezaris, J. S., Yurgenson, S., Reid, R. C. The spatial receptive field of thalamic inputs to single cortical simple cells revealed by the interaction of visual and electrical stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (25), 16261-16266 (2002).
  28. Lomber, S. G. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. J. Neurosci. Meth. 86 (2), 109-117 (1999).
  29. Altwegg-Boussac, T., Chavez, M., Mahon, S., Charpier, S. Excitability and responsiveness of rat barrel cortex neurons in the presence and absence of spontaneous synaptic activity in vivo. J. Physiol. 592 (16), 3577-3595 (2014).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl. Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates (2nd edn). , Academic Press. (1986).
  32. Wolfensohn, S. Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare. , Wiley-Blackwell. (2013).
  33. Bester, H., Chapman, V., Besson, J. M., Bernard, J. F. Physiological Properties of the Lamina I Spinoparabrachial Neurons in the Rat. J. Neurophysiol. 83 (4), 2239-2259 (2000).
  34. Greene, S. A. Veterinary Anesthesia and Pain Management Secrets. , Elsevier Health Sciences. (2002).
  35. Morgan, B. J., Adrian, R., Bates, M. L., Dopp, J. M., Dempsey, J. A. Quantifying hypoxia-induced chemoreceptor sensitivity in the awake rodent. J. Appl. Physiol. 117 (7), 816-824 (2014).
  36. Mahon, S., Deniau, J. M., Charpier, S. Relationship between EEG potentials and intracellular activity of striatal and cortico-striatal neurons: an in vivo study under different anesthetics. Cereb. Cortex. 11 (4), 360-373 (2001).
  37. Ganes, T., Lundar, T. The effect of thiopentone on somatosensory evoked responses and EEGs in comatose patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 46 (6), 509-514 (1983).
  38. Schmid-Elsaesser, R., Schröder, M., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. EEG burst suppression is not necessary for maximum barbiturate protection in transient focal cerebral ischemia in the rat. J. Neurol. Sci. 162 (1), 14-19 (1999).
  39. Cummins, T. R., Jiang, C., Haddad, G. G. Human neocortical excitability is decreased during anoxia via sodium channel modulation. J Clin Invest. 91 (2), 608-615 (1993).
  40. Gu, X. Q., Kanaan, A., Yao, H., Haddad, G. G. Chronic High-Inspired CO2 Decreases Excitability of Mouse Hippocampal Neurons. J. Neurophysiol. 97 (2), 1833-1838 (2007).
  41. Lehembre, R., Gosseries, O., et al. Electrophysiological investigations of brain function in coma, vegetative and minimally conscious patients. Arch Ital Biol. 150 (2/3), 122-139 (2012).
  42. Husain, A. M. Electroencephalographic assessment of coma. J Clin Neurophysiol. 23 (3), 208-220 (2006).
  43. Fink, E. L., Alexander, H., et al. An Experimental Model of Pediatric Asphyxial Cardiopulmonary Arrest in Rats. Pediatr Crit Care Med. 5 (2), 139-144 (2004).
  44. Lukatch, H. S., McIver, M. B. Synaptic mechanisms of thiopental-induced alterations insynchronized cortical activity. Anesthesiology. 84, 1425-1434 (1996).
  45. Kroeger, D., Amzica, F. Hypersensitivity of the anesthesia-induced comatose brain. J Neurosci. 27, 10597-10607 (2007).
  46. Kroeger, D., Florea, B., Amzica, F. Human brain activity patterns beyond the isoelectric line of extreme deep coma. PLoS ONE. 8 (9), e75257 (2013).
  47. Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Arch. 444 (4), 491-498 (2002).
  48. DeWeese, M. Whole-Cell Recording In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. , (2007).
  49. Schramm, A. E., Marinazzo, D., Gener, T., Graham, L. J. The Touch and Zap Method for In Vivo Whole-Cell Patch Recording of Intrinsic and Visual Responses of Cortical Neurons and Glial Cells. PLoS ONE. 9 (5), e97310 (2014).
  50. Mahon, S., Charpier, S. Bidirectional Plasticity of Intrinsic Excitability Controls Sensory Inputs Efficiency in Layer 5 Barrel Cortex Neurons in Vivo. J. Neurosci. 32 (33), 11377-11389 (2012).
  51. Destexhe, A., Rudolph, M., Paré, D. The high-conductance state of neocortical neurons in vivo. Nat. Rev. Neurosci. 4 (9), 739-751 (2003).

Tags

Neuroscience intracellulære opptak, oppstemthet synaptisk aktivitet ECOG isoelektrisk hjernebarken koma fysiologiske konstanter
Induksjon av et isoelektrisk Brain State å undersøke effekten av endogent Synaptic aktivitet på neuronal Excitability<em&gt; I Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Altwegg-Boussac, T., Mahon, S.,… More

Altwegg-Boussac, T., Mahon, S., Chavez, M., Charpier, S., Schramm, A. E. Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo. J. Vis. Exp. (109), e53576, doi:10.3791/53576 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter