Summary
עבודה זו מתארת פרוטוקול בידול במבחנה לייצר מלנוציטים פיגמנט, מתאי גזע אנושיים pluripotent באמצעות רכס עצבי ואת melanoblast שלב ביניים באמצעות פרוטוקול מזין ללא, 25 יום.
Introduction
תאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) לספק פלטפורמה לחקות בידול נורמלי להרחבת אופנת דוגמנות מחלה, הקרנת סמים, וטיפולי התחדשות תאי 1-6. מעניין במיוחד, hPSCs לפתוח אפיקים ללימוד קשה לבודד או נדירים / סוגי תאים חולפים שבו דגימות חולות הן נדירות. יתר על כן, תאי גזע מושרים (iPSCs) לאפשר לחוקרים ללמוד פיתוח מודלי מחלה באופן ספציפי לחולה לפענח מנגנונים ייחודיים 1,2,7-11. הפרוטוקול שפורסם בעבר לבידול של מלנוציטים מ hPSCs דורש עד 6 שבועות של בידול כרוך תאים culturing עם בינוני מותנה מתאי L-Wnt3a 12. הפרוטוקול מובא לראשונה על ידי מיכה et al. ותאר כאן מייצר תאי פיגמנט בשלושה שבועות ומסיר את העמימות וחוסר עקביות הקשורים בינוני מותנה.
מלנוציטים arדואר נגזר הרכס העצבי, אוכלוסיית נדידה של תאים ייחודיים בעלי חוליות. הרכס העצבי מוגדר במהלך gastrulation ומייצג אוכלוסייה של תאים בקצה ההצלחה העצבית, גובל בין עצביים האאקטודרם שאינם עצביים. במהלך neurulation, רקמת העצבים מתפתחת מתוך צלחת עצבית כדי ליצור קפלים עצביים, אשר מתכנסים על קו אמצע הגב וכתוצאה מכך 13,14 בצינור העצבי.
התאים הרכס העצבי לצאת מהצלחת הגג של הצינור העצבי, מול notochord, ו לעבור אפיתל המעבר mesenchymal לפני נודדות הרחק להצמיח אוכלוסיה מגוונת של תאים מובחנים. גורלן של תאי הרכס מוגדר בחלקו על ידי המיקום אנטומי של צלחת הגג לאורך ציר הגוף של העובר. נגזר תאי רכס עצבי כולל שושלות אופייניות הוא mesoderm (תאי שריר חלק, osteoblasts, adipocytes, chondrocytes) ותאי האאקטודרם (מלנוציטים, ג שוואןאמות, נוירונים) 14. תאי גזע רכס עצביים upregulate גורם שעתוק SOX10 ויכולים להיות מבודד על ידי תא מופעל קרינת מיון עם נוגדני p75 ו HNK1.
תאי הרכס העצביים נגזרו להיות מלנוציטים לעבור שלב melanoblast ו upregulate KIT ו MITF (גורם שעתוק הקשורים microphthalmia) 6,21 MITF הוא רגולטור של פיתוח מלנוציט ומהווה גורם שעתוק אחראי לשליטה הרבה של פיתוח מלנוציט 22- 24. melanoblasts אדם נודד אל שכבת הבסיס של האפידרמיס שבו הם מתגוררים בין אם בליטת השיער או מוקף קרטינוציטים באפידרמיס (הקמת יחידות פיגמנטציה) לשמש מבשר אל מלנוציטים הבוגר, פיגמנט. הבידול וההתבגרות של melanoblasts לתוך מלנוציטים פיגמנט מתרחשים בד בבד עם קולוניזציה של נורת השיער וביטוי של מסלול ייצור המלנין (TYRP1, TYR, OCA2 וPMEL) 25,26.
בידוד מלנוציטים אדם melanoblasts מחולים הוא יקר, קשה להגביל בכמות. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להבחין hPSCs (induced או עוברי) לתוך מלנוציטים או מבשרי מלנוציט בשיטה מוגדרת היטב, מהירה, לשחזור, מדרגים, וזולה ללא מיון תא. הפרוטוקול שמש בעבר לזהות פגמים ספציפיים למחלה כאשר הבחנת iPSCs מחול עם הפרעות פיגמנטציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול מלנוציט המפורטים כאן הוצגה לראשונה על ידי מיכה et al.
1. הכנת בינוני תרבות, מצופה כלים ותחזוקה של hPSCs
- הכנת בינוני
הערה: יש לאחסן את כל מדיום ב 4 ° C בחושך עד 2 שבועות. לסנן את כל בינוני עבור עיקור.- כן DMEM / 10% FBS. מערבבים 885 מ"ל DMEM, 100 FBS מ"ל, 10 מ"ל פן / סטרפטוקוקוס ו -5 מ"ל L-גלוטמין. מסנן עבור עיקור.
- כן-בינוני hESC. מערבבים 800 מ"ל DMEM / F12, 200 מ"ל KSR, 5 מ"ל L-Glutamine, 10 מ"ל ממ פתרון חומצות אמינו חיוניות מינימום, 1 מ"ל β-mercaptoethanol, ו -5 מ"ל פן / סטרפטוקוקוס. לאחר סינון להוסיף 10 ng / ml FGF-2.
- הכן בינוני KSR-בידול: מערבבים 820 מ"ל נוק DMEM, 150 מ"ל KSR, 10 מ"ל L-Glutamine, 10 מ"ל פן / סטרפטוקוקוס, 10 מ"ל ממ פתרון חומצות אמינו חיוניות מינימום 1 מ"ל β-mercaptoethanol. מסנן עבור עיקור.
- כן בינוני N2 בידול. ממיסים 12 גרם DMEM / F12 אני אבקתn 980 מ"ל DH 2 O. להוסיף גלוקוז 1.55 גר ', 2 גרם סודיום ביקרבונט ו -100 transferrin האדם apo מ"ג. מערבבים 2 מ"ל DH 2 O עם 25 מ"ג אינסולין לאדם 40 μl 1 N NaOH; פעם מומסת, מוסיף את התערובת למדיום. הוספת 100 dihydrochloride פוטרסין μl, 60 סלניט μl, 100 פרוגסטרון μl. תביא את הנפח הסופי 1 ליטר עם DH 2 O לפני הסינון.
- כן בינוני מלנוציט מלא. שלב 50% בינוני Neurobasal, 30% DMEM גלוקוז נמוך, ו -20% MCDB201. להוסיף זה: 0.8% + ITS, 250 ננומטר L- גלוטמין, 100 מיקרומטר חומצה אסקורבית (L-AA), 50 ng / ml רעלן הכולרה, 50 ng / ml SCF, 0.05 מיקרומטר Dexamethasone, 100 ננומטר EDN3, 4 ng / FGF2 מ"ל . סינון סטרילי ואז להוסיף ריאגנטים הנותרים: תוספת B27 2%, 25 ng / ml BMP4, 3 מיקרומטר CHIR99021, cAMP מיקרומטר 500.
- ציפוי של תרבות מנות
- לבצע ציפוי באמצעות חלבון דביק כגון Matrigel. לקראת הפתיחה המחודשת, aliquot ולהקפיא Matrigel לתוך 1 מ"ל חלקים כדי למנוע ג ההפשרה להקפיא חוזרותycles. ההפשרה מחדש להשעות aliquot קפוא 1 מ"ל עם 19 מ"ל DMEM / F12. פלייט 5 מ"ל על צלחת 10 ס"מ. דגירת המנות עבור שעה 1 ב RT. לשאוב החלבון הדביק מייד לפני ציפוי התא ולשטוף עם DMEM / F12.
- לבצע ציפוי באמצעות פולי-L ornithin hydrobromide / עכבר Laminin-I / פיברונקטין (PO / לאם / FN). צלחת מעיל עם PBS המכיל 15 מיקרוגרם / מ"ל Poly-L ornithin hydrobromide. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified. לשאוב את הפתרון לשטוף את הצלחות עם PBS שלוש פעמים לפני ציפוי עם PBS המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל עכבר Laminin-I ו- 2 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין. דגירה מנות O / N ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified.
- לפני תאי ציפוי, לשאוב את הפתרון ולתת הצלחות להתייבש היטב ללא מכסה למכסת המנוע בתרבית הרקמה. אפשר הצלחות להתייבש במשך כ 10-15 דקות.
הערה: המנות יבשות ומוכנות ציפוי תא כאשר מבנים גבישיים להופיע על פני השטח על ידי עין. plates יכולים להישמר עם PBS המכיל LAM / FN בחממה במשך שבועיים, כל עוד הנוזל אינו להתאדות. הלוחות יכולים להישמר יבשים ב RT במשך כמה שעות.
- לפני תאי ציפוי, לשאוב את הפתרון ולתת הצלחות להתייבש היטב ללא מכסה למכסת המנוע בתרבית הרקמה. אפשר הצלחות להתייבש במשך כ 10-15 דקות.
- תחזוקה של hPSCs
הערה: hPSCs נשמרות על ג'לטין 0.1% ו פיברובלסטים עובריים בעכבר מומת mitotically (MEFs) ב-בינוני hESC. התאים יש לפצל כל 6-8 ימים.- מעיל צלחת 10 ס"מ עם ג'לטין 0.1% ב PBS ב RT במשך 5 דקות.
- להפשיר MEFs קפוא במהירות באמבט המים 37 מעלות צלזיוס.
- לשאוב את הג'לטין ואת צלחת התאים. MEFs פלייט בצפיפות של ~ 50,000 תאים / 2 ס"מ ב FBS DMEM / 10%. דגירה MEFs ב 37 ° CO / N לפני הוספת hPSCs.
- לשאוב FBS DMEM / 10% מהצלחת MEF מוכן, לשטוף צלחת עם PBS ולהוסיף 10 מ"ל בינוני hESC עם hPSCs. המסדרון, hPSCs לפי יחס של 1: 5/10 תלוי צפיפות לפני passaging.
הערה: אם hPSCs שמתבצע מופשר או passaged כמו תאים בודדים, supplement עם 10 מיקרומטר Y-27632 dihydrochloride (ROCKi) עד המעבר הראשון. - Feed תאים יומי עם טרי 10 מ"ל בינוני hESC.
- לפני שמתחילים יש ליצור בידול להסיר כל מושבות פלוריפוטנטיים המופיעים להכיל תאים מובחנים, גבולות לא סדירים, או מרכזי שקוף 28. מבחינה מכאנית לסלק לשאוב מושבות הסדירות עם טפטפת מתחת למכסת מנוע זרימה למינרית עם מיקרוסקופ לנתח.
ציפוי 2. של hPSCs לבידול
הערה: תנאי בידול מתוארים עבור 10 מנות ס"מ.
- הכן 10 ס"מ מנות Matrigel לפני תחילת בידול כמתואר שלב 1.3.1.
- כאשר hPSCs ציפוי עבור בידול להתחיל עם צלחת של hPSCs בצפיפות מוכן למעבר (~ 80% ומחוברות) לשאוב בינוני hESC, לשטוף עם PBS ולהוסיף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA על התאים.
- במרץ לנער את צלחת horizontally עבור 2 דקות תוך הדמיה תחת מיקרוסקופ עד MEFs להמריא כמו תאים בודדים. מושבות hPSC צריכות להישאר מחוברות כקולוניות.
- לשאוב טריפסין לאחר MEFs נוקף אבל לפני המושבות hPSCs לנתק.
- הוסף 10 מ"ל של מדיום hESC המכיל 10 מיקרומטר dihydrochloride Y-27632 לצלחת ולנתק את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה על המושבות.
- לשאוב את הפתרון Matrigel מצלחת 10 ס"מ מוכן בשלב 2.1 ולשטוף עם DMEM / F12 כדי להסיר גושים. פלייט hPSCs ביחס של 1: יחס 2 לצלחת Matrigel. התוספת בינוני hESC המכיל 10 מיקרומטר Y-27632 dihydrochloride עד 10 מ"ל. לדגור על 37 מעלות CO / N.
הערה: ציפוי זה אמור לגרום כ 100,000 תאים / 2 ס"מ.
3. אינדוקציה של בידול העצבי
הערה: בידול יש ליזום (יום 0) כאשר hPSCs הם 80% ומחוברות. התאים יכולים להיות מוזנים יומי עם-בינוני hESC10 מיקרומטר Y-27632 המכיל dihydrochloride עד תחילת בידול.
- ביום 0 וביום 1, להאכיל את התאים עם 10 מ"ל של מדיום KSR-בידול המכיל LDN193189 100 ננומטר ו -10 מיקרומטר SB431542.
- ביום 2, להאכיל את התאים עם 10 מ"ל של מדיום בידול KSR המכיל LDN193189 100 ננומטר, 10 מיקרומטר SB431542 ו -3 מיקרומטר CHIR99021.
- ביום 3, להאכיל את התאים עם 10 מ"ל של מדיום KSR-בידול המכיל 10 מיקרומטר SB431542 ו -3 מיקרומטר CHIR99021.
- בימים 4 ו -5 להאכיל את התאים עם 15 מ"ל של 75% בינוני KSR-בידול 25% בינוני N2 בידול המכיל 3 מיקרומטר CHIR99021.
הערה: אל תיבהל לראות כמות גדולה של מוות של תאים מבחינת תאים צפים. זוהי תופעה רגילה שיש לצפות. - בימים 6 ו -7 להאכיל את התאים עם 15 מ"ל של 50% בינוני KSR-בידול 50% בינוני N2 בידול הן המכיל 3 מיקרומטר CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, ו 100 ננומטר EDN3.
- בימים 8ו -9 להאכיל את התאים עם 20 מ"ל של 25% בינוני KSR-בידול 75% N2 בידול הן מדיום המכיל 3 מיקרומטר CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, ו 100 ננומטר EDN3.
- בימים 9 ו -10 להכין PO / לאם / מנות FN כמצוין 1.2.2 עבור מחדש ציפוי של תאים ביום 11.
- ביום 10 תאים להאכיל עם 20 מ"ל של מדיום N2 בידול המכיל 3 מיקרומטר CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, ו 100 ננומטר EDN3.
4. replating בטיפות עבור מפרט NC
- ביום 11 לשאוב לאם / FN מן PO / LAM / FN צלחות המוכנות ויבשות לחלוטין.
- הסר בינוני 11 תאים יום, לשטוף עם PBS ולהוסיף פתרון ניתוק התא 4 מ"ל כגון Accutase לכל צלחת 10 ס"מ. דגירה של 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף 5 מ"ל של מדיום מלאה מלנוציט כדי בצלחת resuspend את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה באופן ידני עם טפטפת 10 מ"ל עד שכל התאים נוקף מהצלחת. מעבירים את ההשעיה לצינור 15 מ"ל.
- ספיןתאים למטה במשך 5 דקות ב 200 XG ו resuspend התאים ב 2 x 10 6 תאים לכל מ"ל במדיום מלאה מלנוציט. ספירת התאים באמצעות ההרחקה trypan הכחולה על hemocytometer או טכניקה מקבילה.
- פלייט 10 μl טיפות קרובים זה לזה (בלעדיהם נגיעה) על PO / לאם / FN 10 ס"מ מנות יבשים. אם הצליח כבר יבש מספיק, הטיפין צריכות מוגדרות היטב בקצוות ולא לרוץ.
הערה: זה יוצר סביבה מקומית צפיפות גבוהה עבור התאים, וזה חשוב כאשר replating התאים, תוך שמירה על חדר בתוך הצלחת להתרחבות. - אפשר טיפות לעמוד ב RT במשך 10-20 דקות, כדי לאפשר לתאים לדבוק, ואז לאט לאט (לא להפריע תאים המצורפת) להוסיף 10 מ"ל של מדיום מלאה מלנוציט. זז צלחת אל האינקובטור.
5. הרחבת מלנוציט אבות
- המשך האכלה עם מדיום מלנוציט מלא כל 2 עד 3 ימים.
הערה: פיגמנטציה צריך להתחיל להיות גלוי within אשכולות של תאים עד סוף השבוע הראשון ולהיות ברורים מאוד מצד בשבוע השני. הצג את הצלחת מעל רקע לבן כמו דף הנייר להבחין מוקדם אלה אשכולות קטנים וחשוכים. תאים יהפכו יותר ויותר פיגמנט לאורך זמן, עד שהצליח כולו הוא אחיד פיגמנט (ראה תרשים 2B). - תאי המעבר פעם בשבוע ביחס של ~ 1: 6 (ציפוי כמו טיפות כבר לא נחוץ בשלב זה). השתמש Accutase לנתק תאים ולשטוף פעמיים עם מדיום Neurobasal רגיל לפני מחדש ציפוי במדיום מלאה מלנוציט. שמור על תאים על PO / LAM / צלחות FN.
הערה: מצאנו כי המדיום המלא מלנוציט הוא מתאים ביותר עבור שמירה והרחבת hESC ו מלנוציטים נגזרים iPSC. עם זאת, תאים יכולים להיות מתורבתים בקצרה במדיום זמין מסחרי M254 אבל התקשורת פשוט מעלה את הסיכון של תאים המתים והרמה מהצלחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מספק שיטה להפקה, מלנוציטים בוגר פיגמנט לחלוטין מן hPSCs בצורה במבחנה ללא מזין, עלות היעילה, לשחזור. בניגוד לפרוטוקול פאנג הוקם בעבר et al. עבור מלנוציטים נגזרים hPSC, הפרוטוקול המתואר אינו המחייב בינוני מותנים ומפחית את דרישת הזמן. פאנג ואח הפרוטוקול. מנוצל בינוני מותנה משורת תאים בעכברים מייצר WNT3A ולקח עד 6 שבועות לדמיין פיגמנטציה 6,12. כדי להטות את תאי גזע רכס העצביים כלפי גורל מלנוציט (melanoblasts), אנו מסירים את מעכבי BMP ו- TGFβ (LDN ו SB בהתאמה) לאחר דופק מוקדם ובהמשך להציג BMP4 אקסוגניים EDN3 איתות ביום שישי תוך שמירת הפעלת Wnt (CHIR) 6. Melanoblasts וכתוצאה מכך ניתן לאפיין על ידי ביטוי של KIT ו MITF, וכן אחזקה של SOX10 expression 6. ביטוי של SOX10 ניתן דמיין באזורים בצלחת תרבות יוצרות רכסים ידי תרבות 11 יום (איור 1 ב - C).
בעקבות אינדוקצית melanoblast, תאי passaged על PO / LAM / צלחות FN ואכילה עם מדיום מלא מלנוציט. זהו מדיום עשיר מאוד כי יש יתרון נוסף של להיות סלקטיבית לאוכלוסייה מלנוציט, ביטול הצורך כל תא פלורסנט המופעל מיון 6. במהלך ההבשלה מלנוציט, התא upregulates הגנים המלנין TYR ו TYRP1 תוך שמירה רבים מהגנים melanoblast, כולל TYRP2. תאי גזע Day25 נגזרו מלנוציטים כתם כראוי עבור חלבוני ייצור המלנין TYRP1 ו TYRP2 (איור 2). פרוטוקול זה הוא איתן ויש בו נעשה שימוש עם קו hESC H9 ועל פני כמה קווי iPSC. לאחרונה, פרוטוקול זה שימש כדי לשחזר את ul בנאמנות תכונות trastructural של מחלות פיגמנטציה באמצעות קווי iPSC מטופל ספציפי 6.
איור 1. צעדים קריטיים בפרוטוקול בידול מלנוציט הנגזרות hESC. (א) תוכנית פרוטוקול בידול. KSR: בינוני KSR-בידול, N2: בינוני N2 בידול, LDN: LDN193189, SB: SB431542, CHIR: CHIR99021, BMP4: עצם המוךפו"גנטי שהולך חלבון 4, EDN3: אנדותלין-3, ROCKi: B dihydrochloride Y-27632 - C. מציג brightfield (B) ואת הקרינה GFP (C) תמונה של בידול ביום 11 לפני replating באמצעות pSOX10 מהונדס: קו hESC GFP. בחושך רכסים גלוי תמונות brightfield מועשרים בתאי SOX10 + כי יהיה להצמיח melanoblasts ולבסוף מלנוציטים. להעלות / 53,806 / 53806fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מלנוציט ואת שלבי ביניים. (א) יום פיגמנט 25 תאים (מימין) ניתן דמיינו בקלות להבחין בין יום 11 תאים (משמאל) כאשר pelleted. (ב) על ידי ביום 20 של פרוטוקול התרבות תכיל הוא חסרי צבע, מלנוציטים התבגרות מלאת מלנוציטים בוגר, פיגמנט. (C - ד) מלנוציטים ניתן דמיינו תחת שדה בהיר ואת מלנוציטים פיגמנט הן התבגרות מלא כתם עבור TYRP2 סמן melanoblast / מלנוציט. (E - F) רק את הכתם מלנוציטים פיגמנט עבור TYRP1 סמן מלנוציט בשלב מאוחר.לקבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבור הבידול המוצלח של מלנוציטים מ hPSCs את ההצעות הבאות צריכות להילקח בחשבון. בראש ובראשונה, חשוב לעבוד בתנאי תרבות סטרילית בכל העת. בנוסף, חשוב להתחיל עם פלוריפוטנטיים, hPSCs מובחן לחלוטין; אם האוכלוסייה החלה מכילה תאים מובחנים התשואה תמיד תרד כגורם הזיהום לא יכול להיות מופנה כלפי מלנוציטים ועלול עוד יותר לשבש את תאי מבדילים כראוי.
כדי להבטיח את התאים נשארים פלוריפוטנטיים דואגים להתאים לכללים והמבוססים לצורך תחזוקת תאי גזע; להאכיל מעבר קבוע וחתן התרבויות להסיר תאים מובחנים לפני passaging. כאשר passaging על חלבון דביק לבידול חשוב כי המאכל מצופה כראוי כדי למנוע מתאי הרמת הנחה במהלך ההתמיינות.
Melanoblast שונהentiation יש ליזום סביב צפיפות התאים 80%; צפיפות גבוהה מדי תוביל למות תא גדל בעוד צפיפות נמוכה מדי תשפיע בידול שלילי. כאשר passaging, התאים יש לרחוץ פעמיים כדי להסיר כל פתרון ניתוק התא לפני ציפוי. כדי למקסם הישרדות ביום 11, חשוב מעבר התאים לתוך צפיפות גבוהה, ברווח גם טיפות כי הם ללא שינוי במשך 20 דקות, כך התאים להתקבץ לדבוק.
פרוטוקול זה אפקטיבי יצירת מספר רב של מלנוציטים, ויהיה בעל ערך כאשר לומדים דגימות חולה אדם של כמות מוגבלת. יתר על כן, כאשר אוכלוסיית מלנוציט נגזר-PSC היא סלקטיבית להרחבת אוכלוסיית מלנוציט ניתן להכפיל למספר גדול מאוד של תאים גם אם תשואות הבידול במספרים נמוכים או באחוזים של מלנוציטים. ייזום הפרוטוקול עם iPSCs פותח את האפשרות ללימוד מחלות התפתחותיות דגימות מטופל ספציפיות. li אחתmitation של פרוטוקול זה הוא עובדה מלנוציטים נגזרות כמו monoculture ללא כל סוגי התאים אחרים הנמצאים יוצרות הנישה הרגילה שלהם in vivo. יתר על כן הפרוטוקול דורש מומחיות בטכניקות התרבות והתמיינות hPSC. עם זאת, עם ההתפתחויות האחרונות hPSCs לייצר שדה iPSC הפך יותר ויותר לניהול ושיטות hPSCs culturing הפכו לעניין שבשגרה. נכון להיום, פרוטוקול נוצל במעבדה שלנו לייצר מלנוציטים מקו הס H9, וכן מ -14 קווי שב"ס שנוצר בין 5 תורמים שונים.
Et נציץ אל. השתמשו בפרוטוקול זה בהצלחה עבור הגזירה של מלנוציטים מן hESC האדם iPSCs 6. העיתון הוכיח כי iPSCs נגזר חולים עם מומי פיגמנטציה יכול להיות מובחן לתוך מלנוציטים והפרוטוקול מיוצר בנאמנות melanosomes של גודל פנוטיפי וכמות הקשורים במחלה.
ה- Work מאויר אחד מיישומים רבים אפשריים בפרוטוקול עם השימוש iPSC נגזרת מלנוציטים ללימוד מנגנוני מחלה והציג את האפשרות של דרוג את ייצור להקרנת תרופה 6,29. חשוב לציין, העיתון הפגין את איתנות השחזור של הפרוטוקול לייצר מלנוציטים מתוך קבוצה גדולה של קווי hiPSC ברורים גנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין המחברים אינטרסים מנוגדים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק לחוקרים מלנומה מקרן ג'ואנה מ ניקולאי ועל ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב תחת רות ל Kirschstein הלאומית למחקר שירות הפרס F31. עבודה זו נתמכה על עוד דרך מענקי NYSTEM והיוזמה תא גזע Tri-המוסדית (סטאר הקרן).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
References
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
