Summary
Questo lavoro descrive un protocollo in vitro la differenziazione di produrre pigmentate, i melanociti maturi da cellule staminali pluripotenti umane tramite una cresta neurale e melanoblast fase intermedia utilizzando un protocollo senza alimentatore 25 giorni.
Introduction
Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) forniscono una piattaforma per imitare la differenziazione normale in un modo scalabile per la modellazione della malattia, lo screening di stupefacenti, e le terapie di sostituzione cellulare 1-6. Di particolare interesse, hPSCs aprono strade per studiare difficili da isolare o tipi di cellule rare / transitori in cui i campioni dei pazienti sono scarse. Cellule staminali pluripotenti Inoltre, indotte (iPSCs) permettono ai ricercatori di studiare lo sviluppo e la modellazione della malattia in modo specifico paziente a svelare i meccanismi unici 1,2,7-11. Il protocollo precedentemente pubblicato per la differenziazione dei melanociti da hPSCs richiede fino a 6 settimane di differenziazioni e coinvolge le cellule di coltura con medium condizionato dalle cellule L-Wnt3a 12. Il protocollo prima presentata da Mica et al. E qui descritto produce cellule pigmentate in tre settimane e rimuove l'ambiguità e incoerenze associate a mezzo condizionato.
I melanociti are derivati dalla cresta neurale, una popolazione di cellule migratoria unici per vertebrati. La cresta neurale è definita durante gastrulation e rappresenta una popolazione di cellule sul bordo della piastra neurale, al confine tra la ectoderma neurale e non neurale. Durante neurulazione, il tessuto nervoso evolve da una piastra neurale per formare pieghe neurali, che convergono sulla linea mediana dorsale, con conseguente 13,14 tubo neurale.
Le cellule della cresta neurale emergono dalla piastra tetto del tubo neurale, di fronte alla notocorda, e subiscono una transizione epitelio mesenchimale prima di migrare via per dare luogo ad una popolazione eterogenea di cellule differenziate. I destini delle cellule della cresta sono definite in parte dalla posizione anatomica della lamiera del tetto lungo l'asse del corpo dell'embrione. Derivati di cellule della cresta neurale includono linee caratteristiche di entrambi mesoderma (cellule muscolari lisce, osteoblasti, adipociti, condrociti) e le cellule ectoderma (melanociti, Schwann cells, neuroni) 14. Le cellule staminali della cresta neurale upregulate il fattore di trascrizione SOX10 e possono essere isolate da cellule di fluorescenza-attivato l'ordinamento con anticorpi anti p75 e HNK1.
Le cellule della cresta neurale destinato a diventare melanociti passare attraverso una fase melanoblast e upregulate KIT e MITF (fattore di trascrizione microftalmia-associato) 6,21 MITF è un regolatore Master di Sviluppo melanociti ed è un fattore di trascrizione responsabile del controllo gran parte dello sviluppo melanociti 22- 24. melanoblasts umani migrano allo strato basale dell'epidermide dove risiedono sia nel ringrosso capelli o circondato da cheratinociti nell'epidermide (unità formanti pigmentazione) da utilizzare come precursori delle maturi, melanociti pigmentati. La differenziazione e la maturazione delle melanoblasts in melanociti pigmentati avviene in concomitanza con la colonizzazione del bulbo pilifero e l'espressione della filiera di produzione di melanina (TYRP1, TYR, OCA2 ePMEL) 25,26.
Isolare melanociti umani e melanoblasts da pazienti è costoso, difficile e limitante nella quantità. Questo protocollo consente ai ricercatori di differenziare hPSCs (indotta o embrionali) in melanociti o precursori melanociti in un metodo ben definito, rapida, riproducibile, scalabile ed economica, senza l'ordinamento delle cellule. Il protocollo è stato utilizzato in precedenza per identificare i difetti malattie specifiche quando differenziare iPSCs da pazienti con disturbi della pigmentazione.
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Protocol
NOTA: Il protocollo di melanociti qui delineato è stato dimostrato da Mica et al.
1. Preparazione del terreno di coltura, patinata Piatti e manutenzione di hPSCs
- Media Preparazione
Nota: Conservare tutto media a 4 ° C al buio fino a 2 settimane. Filtro di medie per la sterilizzazione.- Preparare DMEM / 10% FBS. Mescolare 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep e 5 ml di L-glutammina. Filtro per la sterilizzazione.
- Preparare hESC-media. Mescolare 800 ml DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml di L-glutammina, 10 ml minimo indispensabile soluzione MEM aminoacidi, 1 ml di beta-mercaptoetanolo, e 5 ml Pen / Strep. Dopo filtrazione aggiungere 10 ng / ml FGF-2.
- Preparare medio KSR-differenziazione: Mescolare 820 ml Knockout DMEM, 150 ml di KSR, 10 ml di L-glutammina, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimo indispensabile soluzione aminoacidi e 1 ml di β-mercaptoetanolo. Filtro per la sterilizzazione.
- Preparare medio N2-differenziazione. Sciogliere 12 g DMEM / F12 in polvere in 980 ml dH 2 O. Aggiungere 1,55 g di glucosio, 2 g di sodio bicarbonato e 100 mg apo transferrina umana. Mescolare 2 ml dH 2 O con 25 mg di insulina umana e 40 microlitri 1 N NaOH; una volta sciolto, aggiungere il composto al mezzo. Aggiungere 100 ml dicloridrato putrescina, 60 microlitri selenite, 100 ml progesterone. Portare il volume finale di 1 litro con dH 2 O prima della filtrazione.
- Preparare medio melanociti completa. Combinare il 50% medio Neurobasal, il 30% DMEM bassa di glucosio, e il 20% MCDB201. Per questo componente aggiuntivo: 0,8% ITS +, 250 Nm L-glutammina, 100 micron Acido ascorbico (L-AA), 50 ng / ml tossina colerica, 50 ng / ml SCF, 0,05 micron desametasone, 100 nM EDN3, 4 ng / FGF2 ml . filtro sterile quindi aggiungere i reagenti rimanenti: 2% B27 supplemento, 25 ng / ml BMP4, 3 micron CHIR99021, 500 micron cAMP.
- Rivestimento di cultura Piatti
- Effettuare rivestimento utilizzando proteine gelatinosa come Matrigel. All'apertura, aliquota e congelare Matrigel in 1 ml parti per evitare il congelamento ripetitivo disgelo cycles. Scongelare e risospendere un 1 ml un'aliquota congelato con 19 ml DMEM / F12. Tavola 5 ml su un piatto 10 cm. Incubare i piatti per 1 ora a RT. Aspirare la proteina gelatinosa immediatamente prima placcatura le cellule e lavare con DMEM / F12.
- Effettuare il rivestimento utilizzando Poli-L ornitina hydrobromide / mouse laminina-I / fibronectina (PO / Lam / FN). piatto Cappotto con PBS contenente 15 mg / ml Poly-L ornitina bromidrato. Incubare O / N a 37 ° C in un incubatore umidificato. Aspirare la soluzione e lavare le piastre con PBS per tre volte prima del rivestimento con PBS contenente 1 mg / ml di mouse laminina-I e 2 mg / ml fibronectina. Incubare le stoviglie O / N a 37 ° C in un incubatore umidificato.
- Prima di placcatura cellule, aspirare la soluzione e lasciare le piastre asciugare completamente senza coperchio nella cappa coltura tissutale. Lasciare le piastre ad asciugare per circa 10-15 min.
Nota: I piatti sono asciutto e pronto per la placcatura cella quando strutture cristalline affiorano ad occhio. il plates possono essere mantenuti con PBS contenente LAM / FN in incubatrice per due settimane, fino a quando il liquido non evapori. Le piastre possono essere conservati essiccati a temperatura ambiente per qualche ora.
- Prima di placcatura cellule, aspirare la soluzione e lasciare le piastre asciugare completamente senza coperchio nella cappa coltura tissutale. Lasciare le piastre ad asciugare per circa 10-15 min.
- Manutenzione di hPSCs
Nota: hPSCs sono mantenuti sul 0,1% di gelatina e mouse mitoticamente inattivato fibroblasti embrionali (MEF) in hESC-media. Le cellule devono essere divisi ogni 6-8 giorni.- Coat un piatto 10 centimetri con 0,1% di gelatina in PBS a temperatura ambiente per 5 min.
- Scongelare MEF congelati rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Aspirare la gelatina e piastra le cellule. MEF piastra a una densità di ~ 50.000 cellule / cm 2 in DMEM / 10% FBS. Incubare MEF a 37 ° CO / N prima di aggiungere hPSCs.
- Aspirare il% FBS DMEM / 10 dalla piastra MEF preparato, lavare piatto con PBS e aggiungere 10 ml di hESC-media con hPSCs. Passaggio le hPSCs in un rapporto di 1: 5/10 seconda densità prima passaging.
Nota: Se i hPSCs vengono scongelati o diversi passaggi come singole cellule, supcomplemento con 10 mM Y-27632 dicloridrato (Rocki) fino al primo passaggio. - Nutrire le cellule quotidianamente con fresco 10 ml di hESC-media.
- Prima di iniziare una differenziazione rimuovere eventuali colonie pluripotenti che sembrano contenere cellule differenziate, bordi irregolari, o centri trasparenti 28. Meccanicamente rimuovere e aspirare le colonie irregolari con una pipetta sotto una cappa a flusso laminare con un microscopio da dissezione.
2. placcatura di hPSCs per la differenziazione
Nota: le condizioni di differenziazione sono descritti per 10 piatti cm.
- Preparare 10 cm piatti Matrigel prima di iniziare la differenziazione come descritto al punto 1.3.1.
- Quando placcatura hPSCs per una differenziazione iniziano con un piatto di hPSCs ad una densità pronto per il passaggio (~ 80% confluenti) aspirare il hESC-media, lavare con PBS e aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina-EDTA alle cellule.
- Agitare vigorosamente il horizontall piattoy per 2 minuti, mentre la visualizzazione al microscopio fino a quando il MEF sollevare come singole cellule. Le colonie HPSC devono rimanere attaccati come colonie.
- Aspirare il tripsina dopo i MEF hanno sollevato, ma prima che le colonie hPSCs staccano.
- Aggiungere 10 ml di hESC-mezzo contenente 10 mM Y-27632 dicloridrato alla piastra e staccare le cellule pipettando su e giù per le colonie.
- Aspirare la soluzione Matrigel dal 10 centimetri piatto preparato al punto 2.1 e lavare con DMEM / F12 per eliminare grumi. Piastra le hPSCs in un rapporto 1: 2 sulla piastra Matrigel. Aggiungere hESC-mezzo contenente 10 mM Y-27632 dicloridrato fino a 10 ml. Incubare a 37 ° CO / N.
Nota: Questo rivestimento dovrebbe tradursi in circa 100.000 cellule / cm 2.
3. Induzione di differenziazione neurale
Nota: La differenziazione deve essere iniziata (giorno 0) quando le hPSCs sono 80% confluenti. Le cellule possono essere alimentati quotidianamente con hESC-mediumcontenente 10 mM Y-27632 dicloridrato fino all'inizio della differenziazione.
- Il giorno 0 e 1 giorno, nutrire le cellule con 10 ml di terreno KSR-differenziazione contenente 100 nM LDN193189 e 10 micron SB431542.
- Il giorno 2, nutrire le cellule con 10 ml di terreno KSR-differenziazione contenente 100 nM LDN193189, 10 micron SB431542 e 3 micron CHIR99021.
- Il giorno 3, nutrire le cellule con 10 ml di terreno KSR-differenziazione contenente 10 mM SB431542 e 3 micron CHIR99021.
- Nei giorni 4 e 5 nutrire le cellule con 15 ml di 75% medio KSR-differenziazione e il 25% di media N2-differenziazione contenente 3 micron CHIR99021.
Nota: non essere allarmato per vedere una grande quantità di morte cellulare in termini di cellule galleggianti. Questo è normale e prevedibile. - Nei giorni 6 e 7 di alimentazione delle cellule con 15 ml di 50% medio KSR-differenziazione e il 50% di media N2-differenziazione entrambi contenenti 3 micron CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3.
- Nei giorni 8e 9 nutrire le cellule con 20 ml di 25% medio KSR-differenziazione e il 75% di media N2-differenziazione entrambi contenenti 3 micron CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3.
- Nei giorni 9 e 10 preparare piatti PO / Lam / FN, come indicato al punto 1.2.2 per ri-placcatura delle cellule il giorno 11.
- Il giorno 10 celle di alimentazione con 20 ml di terreno N2-differenziazione contenente 3 micron CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3.
4. replating in gocce per NC Specification
- Il giorno 11 aspirato Lam / FN dal Po / LAM / piastre preparate FN e asciugare completamente.
- Rimuovere media a partire dal giorno 11 cellule, lavare con PBS e aggiungere la soluzione di distacco delle cellule 4 ml come Accutase per 10 cm piatto. Incubare per 25 minuti a 37 ° C.
- Aggiungere 5 ml di terreno completo Melanocita al piatto e risospendere le cellule pipettando manualmente su e giù con una pipetta 10 ml fino a quando tutte le celle hanno tolto la piastra. Trasferire la sospensione in una provetta da 15 ml.
- Gira lacellule scorrimento per 5 minuti a 200 xg e risospendere le cellule a 2 x 10 6 cellule per ml in mezzo completo Melanocyte. Contare le cellule utilizzando l'esclusione blu trypan su un emocitometro o tecnica equivalente.
- goccioline piastra 10 microlitri vicine tra loro (senza toccarle) sulle secche PO / Lam / FN 10 cm piatti. Se la piastra è stata sufficientemente asciugato, le goccioline dovrebbero essere ben bordi definiti e non correre.
Nota: Questo crea un ambiente locale ad alta densità per le cellule, il che è importante quando replating cellule, mantenendo camera entro il piatto per l'espansione. - Lasciare le goccioline riposare a temperatura ambiente per 10-20 minuti per consentire alle cellule di aderire, poi lentamente (per non disturbare le cellule attaccate) aggiungere 10 ml di terreno pieno melanociti. Spostare piatto per l'incubatore.
5. Espansione melanocita Progenitori
- Continuare l'alimentazione con il mezzo Melanocyte completa ogni 2 o 3 giorni.
Nota: Pigmentazione dovrebbe iniziare ad essere visibile well'ambito gruppi di cellule dalla fine della prima settimana e diventare molto chiaro dalla seconda settimana. Osservando la lastra su uno sfondo bianco, quale un foglio di carta di discernere questi primi piccoli ammassi oscuri. Le cellule saranno diventano progressivamente più pigmentata nel tempo, fino a quando l'intera piastra è uniformemente pigmentata (vedere Figura 2B). - cellule Passage una volta a settimana con un rapporto di circa 1: 6 (placcatura come gocce non è più necessario in questa fase). Utilizzare Accutase dissociare le cellule e lavare due volte con il mezzo Neurobasal pianura prima di ri-placcatura in media completa melanociti. Mantenere le cellule su PO / LAM / piastre FN.
Nota: Abbiamo scoperto che il medium completa Melanocyte è più adatto per il mantenimento e l'espansione hESC e melanociti iPSC-derivati. Tuttavia, le cellule possono essere coltivate in terreno brevemente M254 disponibile in commercio ma i media semplificato aumenta il rischio di cellule morenti e sollevamento dalla piastra.
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Representative Results
Questo protocollo fornisce un metodo per derivare completamente pigmentate, melanociti adulte hPSCs in un alimentatore-libera, economicamente efficiente e riproducibile modo in vitro. In contrasto con il precedentemente stabilito Fang et al. Protocollo per melanociti HPSC-derivati, il protocollo descritto non richiede terreno condizionato e diminuisce il tempo richiesto. Il protocollo Fang et al. Utilizzato mezzo condizionato da una linea di cellule murine Wnt3a-produzione e ha preso fino a 6 settimane di visualizzare la pigmentazione 6,12. Per polarizzare le cellule staminali della cresta neurale verso un destino melanociti (melanoblasts), togliamo gli inibitori BMP e TGFβ (rispettivamente LDN e SB) dopo un impulso precoce e successivamente introdurre BMP4 esogeno e EDN3 segnalazione al giorno sei, pur mantenendo attivazione Wnt (CHIR) 6. I melanoblasts risultanti possono essere caratterizzati da espressione di KIT e MITF, così come la manutenzione di SOX10 esprESSIONE 6. L'espressione di SOX10 può essere visualizzato nelle aree nel piatto cultura che formano creste di giorno 11 la cultura (Figura 1B - C).
Dopo l'induzione melanoblast, le cellule sono diversi passaggi su PO / LAM / piastre FN e nutriti con il mezzo pieno melanociti. Questo è un mezzo estremamente ricco che ha l'ulteriore vantaggio di essere selettivo per la popolazione melanociti, eliminando la necessità di qualsiasi cella fluorescente-Activated ordinamento 6. Durante la maturazione melanociti, la cellula fa aumentare la melanina sintesi geni TYR e TYRP1, pur mantenendo molti dei geni melanoblast, tra cui TYRP2. Cellule staminali Day25 deriva melanociti macchia in modo appropriato per le proteine produzione di melanina e TYRP1 TYRP2 (Figura 2). Questo protocollo è robusto ed è stato usato con la linea hESC h9 e su più linee IPSC. Più di recente, questo protocollo è stato utilizzato per riprodurre fedelmente l'ul caratteristiche trastructural di malattie della pigmentazione che utilizzano paziente-specifici linee IPSC 6.
Figura 1. passaggi critici nel protocollo di differenziazione dei melanociti hESC-derivati. (A) Lo schema di protocollo di differenziazione. KSR: medio KSR-differenziazione, N2: medio N2-differenziazione, LDN: LDN193189, SB: SB431542, CHIR: CHIR99021, BMP4: proteina morfogenetica 4, EDN3: endotelina-3, Rocki: Y-27632 dicloridrato B - C. Mostra campo chiaro (B) e fluorescenza GFP immagine (C) della differenziazione il giorno 11 prima di replating utilizzando un pSOX10 transgenico: linea GFP hESC. Le creste scure visibili nelle immagini campo chiaro sono arricchiti per le cellule SOX10 + che darà luogo a melanoblasts e alla fine melanociti. caricare / 53806 / 53806fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Melanocita e stadi intermedi. (A) il giorno pigmentata 25 celle (a destra) può essere facilmente visualizzati e distinto dal giorno 11 celle (a sinistra) quando pellet. (B) Di giorno 20 del protocollo cultura conterrà entrambi non pigmentate, con scadenza melanociti e completamente maturi, melanociti pigmentati. (C - D) I melanociti possono essere visualizzati in campo chiaro e sia la maturazione e melanociti completamente pigmentate della macchia per il melanoblast / melanociti marcatore TYRP2. (E - F) Solo il pigmentata melanociti macchia per la fase tardiva marcatore melanociti TYRP1.ottenere = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per la differenziazione di successo dei melanociti da hPSCs i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Innanzitutto, è essenziale lavorare in condizioni di coltura sterili in ogni momento. Inoltre, è importante iniziare con pluripotenti, hPSCs completamente indifferenziate; se la popolazione di partenza contiene cellule differenziate del rendimento invariabilmente cadere come gli agenti inquinanti non possono essere indirizzate verso i melanociti e può anche distruggere ulteriormente le celle correttamente differenziazione.
Per garantire le cellule rimangono pluripotenti fare attenzione a rispettare le regole consolidate per la manutenzione delle cellule staminali; alimentare e di passaggio regolarmente e lo sposo le culture per rimuovere le cellule differenziate entro passaging. Quando passaging sulla proteina gelatinosa per la differenziazione è importante che il piatto sia correttamente rivestito per impedire alle cellule di sollevamento fuori durante la differenziazione.
Il Melanoblast differisconoziazione deve essere iniziata intorno densità cellulare 80%; troppo alte densità porterà ad un aumento della morte cellulare, mentre troppo basse densità influenzerà negativamente la differenziazione. Quando passaging, le cellule devono essere lavati due volte per rimuovere qualsiasi soluzione distacco cellulare prima della placcatura. Per massimizzare la sopravvivenza il giorno 11, è importante passaggio delle cellule in alta densità, goccioline distanziati che sono intatto per 20 min, in modo che le cellule si raggruppano e aderiscono.
Questo protocollo è efficace nel generare un gran numero di melanociti, e sarà utile quando si studia campioni umani pazienti di quantità limitate. Inoltre, come la popolazione melanocita PSC-derivato è selettiva ed espandibile popolazione melanocita può essere moltiplicato per un gran numero di cellule, anche se i rendimenti di differenziazione numeri bassi o percentuali di melanociti. Avvio il protocollo con iPSCs apre la possibilità per lo studio delle malattie dello sviluppo e campioni specifici del paziente. uno limitation di questo protocollo è il fatto melanociti sono derivati come monocoltura senza tutti gli altri tipi di cellule presenti che formano loro normale nicchia in vivo. Inoltre, il protocollo richiede competenze nella cultura e nella differenziazione delle tecniche HPSC. Tuttavia, con i recenti sviluppi nel campo producendo hPSCs IPSC è diventato sempre più gestibile e metodi per hPSCs di coltura sono diventati di routine. Fino ad oggi, il protocollo è stato utilizzato nel nostro laboratorio per la produzione di melanociti dalla linea hES H9, così come da 14 linee iPS generate da 5 diversi donatori.
Mica et al. Usato questo protocollo con successo per la derivazione di melanociti da hESC umana e iPSCs 6. Il documento ha dimostrato che iPSCs derivati da pazienti con difetti di pigmentazione potrebbero essere differenziate in melanociti e il protocollo prodotte fedelmente melanosomi delle dimensioni fenotipica e la quantità associata con la malattia.
il work illustrato una delle tante possibili applicazioni per il protocollo con l'uso di melanociti iPSC-derivati per lo studio dei meccanismi della malattia e ha introdotto la possibilità di scalare la produzione per lo screening di droga 6,29. È importante sottolineare che la carta ha dimostrato la solidità e la riproducibilità del protocollo per la produzione di melanociti da un ampio insieme di linee hiPSC geneticamente distinte.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi in conflitto di rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio per i ricercatori di melanoma dal Joanna M. Nicolay Foundation e dal National Institutes of Health sotto Ruth L. Kirschstein Nazionale Premio Research Service F31. Questo lavoro è stato ulteriormente supportato attraverso sovvenzioni dal NYSTEM e l'iniziativa di cellule staminali Tri-istituzionale (Starr Foundation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
References
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
