Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Myofilament सीए का आकलन Published: August 1, 2016 doi: 10.3791/54057
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1,2,3
1Department of Physiology & Biomedical Sciences, Ischemic/hypoxic Disease Institute, Seoul National University College of Medicine, 2Yan Bian University Hospital, 3Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester

Abstract

दिल की विफलता और कार्डियक arrhythmias मृत्यु दर और रुग्णता दुनिया भर के प्रमुख कारण हैं। हालांकि, रोगजनन और रोगग्रस्त दिल में दौरे की खराबी की व्यवस्था पूरी तरह से स्पष्ट किया जाना बना रहता है। हाल सम्मोहक सबूत यह दर्शाता है कि myofilament सीए 2 संवेदनशीलता में परिवर्तन हृदय myocytes में intracellular सीए 2 homeostasis और आयन चैनल गतिविधियों को प्रभावित, हृदय संभावित कार्रवाई और स्वस्थ और रोगग्रस्त दिलों में संकुचन के लिए जिम्मेदार आवश्यक तंत्र। दरअसल, आयन चैनल की गतिविधियों और ट्रांसपोर्टरों अंतर्निहित हृदय कार्रवाई की क्षमता (जैसे, ना +, सीए 2 और कश्मीर + चैनलों और ना + 2 + -Ca एक्सचेंजर) और intracellular सीए 2 से निपटने प्रोटीन (जैसे।, Ryanodine रिसेप्टर्स और सीए sarcoplasmic जालिका (SERCA2a) या phospholamban और उसके फोस्फोराइलेशन) में 2 + -ATPase पारंपरिक evalu करने के लिए मापा जाता हैहृदय की उत्तेजना-संकुचन (ईसी) युग्मन के मौलिक तंत्र खा लिया। झिल्ली और intracellular सीए 2 परिवर्तन में दोनों विद्युत गतिविधियों, चुनाव आयोग युग्मन के ट्रिगर संकेत हैं जबकि myofilament संकुचन और कार्यात्मक इकाई है, और myofilament सीए 2 संवेदनशीलता myofibril प्रदर्शन के कार्यान्वयन में जरूरी है। फिर भी, कुछ अध्ययनों मायोकार्डियम के कार्यात्मक विश्लेषण में myofilament सीए 2 संवेदनशीलता को शामिल जब तक यह अध्ययन का ध्यान केंद्रित है। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि उपायों sarcomere छोटा / फिर से लंबी और intracellular सीए 2 स्तर Fura-2 AM (ratiometric का पता लगाने) और चूहे दिल से हृदय myocytes में myofilament सीए 2 संवेदनशीलता के परिवर्तन का मूल्यांकन का उपयोग कर का वर्णन है। मुख्य उद्देश्य यह है कि myofilament सीए 2 संवेदनशीलता यंत्रवत विश्लेषण के लिए चुनाव आयोग युग्मन में ध्यान में रखा जाना चाहिए पर जोर देना है। मैं की व्यापक जांचचैनल, आयन ट्रांसपोर्टरों, intracellular सीए 2 + हैंडलिंग, और myofilament सीए 2 संवेदनशीलता है कि स्वस्थ और रोगग्रस्त दिलों में myocyte सिकुड़ना आबाद translational और चिकित्सकीय मूल्य के अधिक प्रभावी रणनीति तैयार करने के लिए बहुमूल्य जानकारी प्रदान करेंगे।

Introduction

कार्डिएक उत्तेजना-संकुचन (ईसी) युग्मन मायोकार्डियम, यानी, दिल 1,2 के सिकुड़ा समारोह के यांत्रिक गुणों का विश्लेषण करने के लिए मौलिक योजना है। चुनाव आयोग युग्मन झिल्ली विध्रुवण sarcolemmal आयन चैनल की गतिविधियों के लिए माध्यमिक द्वारा शुरू की है (जैसे, वोल्टेज gated ना + चैनल, पैच दबाना तकनीक के माध्यम से मापा जा सकता है)। वोल्टेज gated एल प्रकार के बाद सक्रियण सीए 2 चैनल (LTCCs) और सीए LTCCs के माध्यम से 2 + तांता सीए के थोक ट्रिगर 2 + ryanodine रिसेप्टर्स (RyRs) के माध्यम से जारी है, nanomolar से साइटोसोलिक सीए 2 एकाग्रता में वृद्धि (एनएम ) micromolar करने के लिए (माइक्रोन) के स्तर पर। साइटोसोलिक सीए 2 में ऐसी वृद्धि actin-मायोसिन बातचीत की सुविधा को बढ़ावा देता है सीए 2 ट्रोपोनिन सी (टीएनसी) पतली तंतु में करने के लिए बाध्य है और elicits रेशा परिसर के गठनात्मक परिवर्तन और myocardi उपलब्ध हो जाता हैअल 3 संकुचन। इसके विपरीत, साइटोसोलिक सीए 2 वापस एसआर में sarcoplasmic जालिका (एसआर) सीए 2 -ATPase के माध्यम से (SERCA2a) में फिर से uptaken है या ना + / सीए 2 एक्सचेंजर और plasmalemmal के माध्यम से myocyte से बाहर चली जाती है सीए 2 ATPase 1,2। नतीजतन, साइटोसोलिक सीए में गिरावट 2+ पतली तंतु के गठनात्मक परिवर्तन वापस मूल राज्य के लिए, उकसाती actin-मायोसिन और myocyte छूट 1-3 की हदबंदी में जिसके परिणामस्वरूप। सबसे स्तनधारी हृदय कोशिकाओं 1 में साइटोसोलिक सीए 2 हटाने के 90% - इस योजना में, SERCA2a की गतिविधि को आम तौर पर, क्योंकि यह 70 के लिए खातों दौरे छूट की गति का निर्धारण करने के लिए माना जाता है। इस तरह, असामान्य सीए 2 से निपटने LTCC, RYR और SERCA2a आदि के आधार पर बिगड़ा सिकुड़ना और रोगग्रस्त दिल 1-4 में छूट के लिए प्राथमिक तंत्र माना गया है।

2 है कि कुल intracellular सीए के 2 + 1% के आसपास के लिए चुनाव आयोग युग्मन खातों में दूत और सीए 2 के बहुमत के रूप में कार्य intracellular सीए 2 + बफ़र्स 5,6 करने के लिए बाध्य है। यह सच है कि विभिन्न सीए 2 buffers, हृदय myocytes में प्रचुर मात्रा में हैं जैसे, झिल्ली फॉस्फोलिपिड, एटीपी, phosphocreatine, calmodulin, parvalbumin, myofibril TNC, मायोसिन, SERCA2a, और एसआर में calsequestrin के कारण है। 5,6,7। उनमें से, SERCA2a और TnC प्रमुख सीए 2 बफ़र्स 5,6,7 हैं। इसके अलावा, सीए 2 अपनी बफ़र्स के लिए बाध्य चिकोटी के दौरान एक गतिशील प्रक्रिया है (जैसे, सीए के 2 + 30-50% TnC को बांधता है और 2 + यात्रियों 7 सीए के दौरान यह से अलग कर देना) और सीए में परिवर्तन 2+ बाध्यकारी कारण अतिरिक्त cytosol करने के लिए स्वतंत्र सीए 2 की "रिलीज", परिणाम intracellular सीए के परिवर्तन में 2 + सान्द्रentration। नतीजतन, intracellular सीए 2 स्तर की गड़बड़ी असामान्य myofilament आंदोलनों, जो सिकुड़ा रोग और arrhythmias 8,9 के पूर्ववर्ती हैं लाती है। कई कारकों (दोनों शारीरिक और रोग) myofilament प्रोटीन के बाद ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों, जो प्रभावित करते myofilament सीए 2 बफरिंग और myofilament सीए 2 संवेदनशीलता 8-10 का स्रोत हो सकता है। हाल ही में, यह बताया गया कि myofilament प्रोटीन में उत्परिवर्तन सीए 2 बंधन आत्मीयता और intracellular सीए 2 से निपटने में वृद्धि, सीए 2 + यात्रियों, असामान्य सीए 2 रिलीज, और arrhythmias 8 के ठहराव पर निर्भर potentiation ट्रिगर। इस अवधारणा के साथ लाइन में, हम भी उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहे दिल न्यूरोनल नाइट्रिक ऑक्साइड synthase की अप-नियमन के लिए माध्यमिक में है कि myofilament सीए 2 desensitization से पता चला है ऊंचा डायस्टोलिक और सिस्टोलिक सीए 2 के स्तर के साथ जुड़ा हुआ है11, जो बारी में, सीए 2 निर्भर निष्क्रियता से 12 LTCC के जोखिम बढ़ जाती है। इसलिए, myofilament सीए 2 संवेदनशीलता एक "सक्रिय" intracellular सीए 2 + homeostasis और myocyte सिकुड़ा समारोह का नियामक है। यह myofilament और सीए के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हो गया है 2+ myocyte चुनाव आयोग युग्मन और हृदय समारोह की पूरी तरह से जांच के लिए प्रोटीन से निपटने।

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि पृथक हृदय myocytes में myofilament सीए 2 संवेदनशीलता के परिवर्तन का आकलन का वर्णन है। Intracellular सीए 2 + प्रोफ़ाइल के व्यापक विश्लेषण, myofilament सीए 2 संवेदनशीलता और संकुचन उपन्यास अंतर्निहित तंत्र दौरे यांत्रिकी पता लगाना होगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रोटोकॉल की देखभाल और प्रयोगशाला पशु स्वास्थ्य के संयुक्त राष्ट्र के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा प्रकाशित के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार है (एनआईएच प्रकाशन नहीं 85-23, संशोधित 1996)। यह सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) (IACUC अनुमोदन कोई SNU .:-101213-1) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. बफर तैयारी (तालिका सामग्री और उपकरण)

  1. (मिमी में प्रयोग के दिन पर ताजा अलगाव समाधान की 300 मिलीलीटर की तैयारी: सोडियम क्लोराइड, 135, KCl, 5.4, 2 MgCl, 3.5, ग्लूकोज, 5; HEPES, 5; ना 2 HPO 4, 0.4, बैल की तरह, 20; पीएच 7.4 NaOH के साथ)।
  2. (मिमी में प्रयोग के दिन पर ताजा भंडारण समाधान के 100 मिलीलीटर की तैयारी: सोडियम क्लोराइड 120; KCl 5.4; MgSO 4 5; 2 CaCl 0.2; सोडियम पाइरूवेट 5; ग्लूकोज 5.5; बैल की तरह 20; HEPES 10; mannitol 29; 7.4 पीएच NaOH के साथ)।
  3. छिड़काव समाधान की 1L (मिमी में तैयार: सोडियम क्लोराइड, 141.4, KCl, 4; नः 2 4 पीओ, 0.33, एमजीसीएल 2, 1; HEPES, 10; ग्लूकोज, 5.5; 2 CaCl, 1.8; mannitol, 14.5; पीएच NaOH के साथ 7.4)।
  4. अलगाव के 25 मिलीलीटर को कोलैजिनेज़ (1 मिलीग्राम / एमएल), प्रोटीज (0.1 मिलीग्राम / एमएल), गोजातीय सीरम albumin (बीएसए, 1.67mg / एमएल), और सीए 2 (0.05 मिमी) जोड़कर collagenase समाधान 1 की 30 मिलीलीटर की तैयारी उपाय।
  5. (1 मिलीग्राम / एमएल), बीएसए (1.67 मिलीग्राम / एमएल), और सीए 2 (0.05 मिमी) अलगाव के समाधान के 16.7 मिलीलीटर कोलैजिनेज़ जोड़कर collagenase समाधान 2 की 20 मिलीलीटर की तैयारी।
  6. अलगाव समाधान के 40 मिलीलीटर के लिए बीएसए की 0.4 ग्राम जोड़कर बीएसए समाधान के 40 मिलीलीटर की तैयारी। अलग-अलग 10 मिलीलीटर और दो बीकर में 30 मिलीलीटर। सीए बीएसए समाधान के लिए 2 + 30 मिलीलीटर जोड़ें ताकि बीएसए समाधान में अंतिम सीए 2 एकाग्रता 1 मिमी है।

2. बाएं निलय (एल.वी.) myocytes के अलगाव के लिए तैयारी

  1. तैयारी और अलगाव के कमरे में पशु सुविधा से 8-12 सप्ताह पुरानी है, पुरुष Sprague-Dawley (एसडी) स्वच्छ परिवहन पिंजरों में चूहों स्थानांतरण।
  2. एच37 ओ सी के लिए दो पानी स्नान खाने
    नोट: पानी के लिए एक पानी के स्नान का प्रयोग करें - जैकेट जलाशय और Langendorff छिड़काव प्रणाली का छिड़काव ट्यूबों। आदेश में एकल myocytes को अलग करने में दौरे ऊतक चड्डी आंदोलन करने के लिए अन्य नहाने के पानी का प्रयोग करें।
  3. 5 मिलीलीटर और collagenase समाधान 1 और 16.7 मिलीलीटर collagenase समाधान 2 की 25 मिलीलीटर के लिए बीएसए समाधान (सीए के बिना 2 +) के 3.3 मिलीलीटर 30 मिलीग्राम और 20 मिलीलीटर मात्रा को बनाने के लिए क्रमश: जोड़ें।
  4. अलगाव समाधान (100 मिलीलीटर) और collagenase समाधान 1 (30 मिलीलीटर) स्तंभ 1 (कर्नल 1) और स्तंभ से 2 (कर्नल 2) Langendorff छिड़काव प्रणाली, क्रमशः (चित्रा 1 ए) में जोड़ें।
  5. Langendorff छिड़काव प्रणाली (चित्रा 1 ए) में ऑक्सीजन कनेक्शन ट्यूब के माध्यम से अलगाव समाधान और कर्नल 1 और Col.2 में collagenase समाधान 1 आक्सीजन के साथ मिलना। इसी तरह, आक्सीजन collagenase समाधान 2 और बीएसए के माध्यम से 100% ओ 2 के साथ मिलाते हुए पानी में स्नान समाधानऑक्सीजन कनेक्शन ट्यूब।

3. एल.वी. myocytes का अलगाव

  1. असंवेदनता pentobarbital सोडियम (30 मिलीग्राम / किग्रा) की intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से एक एसडी चूहे और पैर की अंगुली बन्द रखो और वापसी प्रतिबिंब की कमी से संवेदनाहारी स्थिति की पुष्टि।
  2. एक विच्छेदन ट्रे को चूहे ले जाएँ। लापरवाह स्थिति में, टेप के साथ शरीर के पक्षों के चार पैर सुरक्षित।
  3. शल्य कैंची के साथ वक्ष मध्य अक्षीय चीरों लागू छाती खोलने के लिए, दिल को नुकसान नहीं सुनिश्चित करने। जोड़ने वाली वाहिकाओं (जैसे, बेहतर और अवर रग Cava, फेफड़े के पात्र और महाधमनी) और पेरिकार्डियल झिल्ली 13 से दिल टुकड़े करना स्वच्छ कैंची की एक और जोड़ी का प्रयोग करें।
  4. एक पर्याप्त लंबाई की महाधमनी के एक हिस्से को छोड़ दो (5 - 8 मिमी), ठीक संदंश के साथ महाधमनी दबाना, और तेजी से 1 मिनट (चित्रा 1 ए) के भीतर Langendorff छिड़काव प्रणाली की प्रवेशनी माउंट। महाधमनी के ऊपर कसकर सीवन धागे 4/0 बाँधो।
  5. महाधमनी काटने से पच दिल उतरो और ताजा अलगाव समाधान (चित्रा 1Bi) युक्त कुप्पी में संदंश के साथ महाधमनी धारण करके यह हस्तांतरण। छोटे टुकड़ों (~ 22 मिमी, चित्रा 1Bii) में (पट सहित) एल.वी. मुक्त दीवार के सबसे कटौती करने के लिए ठीक कैंची और संदंश का प्रयोग करें।
  6. एक कुप्पी पूर्व गर्म और ऑक्सीजन ताजा collagenase समाधान 2 (चित्रा 1Biii) युक्त में टुकड़े स्थानांतरण। 10 मिनट के लिए हिला। myocyte युक्त collagenase समाधान 2 को ऑक्सीजन पहुंचाने रखें।
  7. निलंबन एक 10 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए एक सक्शन बल्ब के साथ droppers का उपयोग कर और सीए 2 + जोड़ने - - बीएसए समाधान युक्त (myocyte ले जाएँ1: 1 की मात्रा में)। 2 मिनट के लिए 30 ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। बीएसए समाधान के 5 मिलीलीटर में myocyte गोली फिर से निलंबित। अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  8. Myocyte छर्रों फैलाने और आर टी (चित्रा 1Biv-vi) में पूर्व ऑक्सीजन भंडारण समाधान के 10 मिलीलीटर में myocytes रहते हैं।
  9. कुप्पी में शेष एल.वी. ऊतक के साथ - प्रक्रिया (3.9 कदम 3.7) दोहराएँ।
    नोट: प्रक्रियाओं दोहरा रखें (कदम 3.7 के - 3.9) फिर एल.वी. ऊतक के सबसे तक myocytes की एक अच्छी उपज प्राप्त करने के लिए गायब हो जाता है।
  10. प्रयोगों के अंत तक आरटी पर 6-8 घंटे के लिए भंडारण समाधान में myocytes रखें।

4. intracellular सीए 2 + यात्रियों और myocyte संकुचन का एक साथ माप

  1. acetoxymethyl एस्टर Fura-2 AM (2 माइक्रोन) के साथ लोड एल.वी. myocytes।
    नोट: एक अंधेरे ट्यूब (चित्रा 1Bvii) में भरी हुई myocytes के साथ सभी लोडिंग प्रक्रियाओं और प्रयोगों का प्रदर्शन।
    1. centr10 सेकंड के लिए 2,000 XG पर myocyte निलंबन (1 मिलीलीटर) ifuge। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एक कम सीए 2 एकाग्रता (250 सुक्ष्ममापी, टेबल सामग्री और उपकरण) के साथ Tyrode समाधान के 1 मिलीलीटर में myocyte गोली फिर से निलंबित।
    2. Fura-2 और Poloxamer 407 (2 μl) जोड़ें, धीरे myocyte निलंबन फैलाने, और आरटी पर मिश्रण रखें - 15 मिनट के लिए (20 से 24 ओ सी) (चित्रा 1Bvii)।
    3. अपकेंद्रित्र मिश्रण 5 सेकंड के लिए, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और छिड़काव 500 माइक्रोन सीए 2 युक्त समाधान के 1 मिलीलीटर में myocyte गोली फैलाने के। 10 मिनट के बाद, 5 सेकंड के लिए मिश्रण अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. ताजा छिड़काव समाधान (500 माइक्रोन सीए 2, 1 मिलीलीटर) जोड़ें और Fura-02:00 रख - रिकॉर्डिंग के लिए इस समाधान में भरी हुई myocyte गोली।
  2. एल.वी. myocyte संकुचन और intracellular सीए के मापन 2+
    1. रिकॉर्डिंग से पहले, छिड़काव ट्यूब कि एक के माध्यम से चलाता भरनेTyrode समाधान है, जो है के साथ पानी जैकेट 36 ओ सी के लिए पूर्व गर्म
    2. 8 मिनट - भरी हुई एल.वी. myocyte निलंबन 5 के लिए एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के चैंबर पर - Fura 2 बजे के कुछ बूँदें रखें। धीरे-धीरे Tyrode समाधान (2.2 मिलीग्राम / मिनट) छिड़कना।
    3. डिजिटल उत्तेजक क्षेत्र उत्तेजना (2 हर्ट्ज) शुरू करने के लिए के सामने पैनल पर "शुरू" बटन दबाएँ।
      नोट: उत्पादन में वोल्टेज (10 वी, 5 मिसे अवधि) myocytes के लिए चैम्बर में प्लैटिनम तारों चैम्बर के दोनों तरफ तैनात माध्यम से लागू किया जाता है।
      1. myocytes चुनें कि अनुबंध स्थिरतापूर्वक रिकॉर्डिंग के लिए नहीं है (उन अति या hypo-संकुचन दिखाते हैं)।
    4. वीडियो आधारित sarcomere पहचान प्रणाली की क्षैतिज स्थिति में पसंद की myocyte समायोजित करें और sarcomeres का इष्टतम छवियों को प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप का ध्यान समायोजित। क्षेत्र में जो स्पष्ट sarcomeres स्पष्ट रूप से औसत तक मनाया जाता है पर बैंगनी आयताकार बॉक्स की स्थितिsarcomere लंबाई (लाल चोटी) की एक विलक्षण तेज चोटी (2A चित्रा, कम छवि) को प्रदर्शित करता है।
    5. क्षेत्र उत्तेजना (चित्रा 2A और बी) के जवाब में sarcomere लंबाई के परिवर्तन रिकॉर्ड।
      नोट: 1 के भीतर भरी हुई myocytes का प्रयोग करें - 2 घंटा।
    6. कैमरे के एपर्चर समायोजित इतना है कि वीडियो आधारित sarcomere का पता लगाने प्रणाली में क्षेत्र myocyte (2A चित्रा) के आकार है। 510 एनएम (अधिग्रहण आवृत्ति 1,000 हर्ट्ज) पर 360 एनएम / 380 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ myocyte उत्तेजित। रिकार्ड sarcomere छोटा और Fura2 AM क्षेत्र उत्तेजना (चित्रा 2 बी) के साथ अनुपात।

5. Myofilament सीए 2 संवेदनशीलता का आकलन

  1. औसत sarcomere लंबाई और सीए स्थिर राज्य में 2 + यात्रियों (10 - 20 निशान) और बनाम ही myocyte की sarcomere लंबाई Fura-2 के अनुपात के चरण-विमान पाश साजिश (दोनों मापा मूल्य के साथऔर डेल्टा परिवर्तन, चित्रा -2)।
  2. प्रत्येक भूखंड में, 50% छूट पर Fura -2 अनुपात (ईसी 50, चित्रा -2) को परिभाषित। दोनों पाश और प्रत्येक हस्तक्षेप के चुनाव आयोग के 50 की तुलना करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एल.वी. myocytes सामान्य और उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहे दिल से अलग कर रहे हैं। स्पष्ट स्त्रिअतिओन्स (sarcomeres का प्रतिनिधित्व) और क्षेत्र उत्तेजना के जवाब में स्थिर संकुचन के साथ छड़ी के आकार myocytes इष्टतम myocytes माना जाता है और रिकॉर्डिंग (2A चित्रा) के लिए चुने गए हैं। उदाहरण एफ igure 2A में दिखाया गया है, एक Fura 2 AM -loaded एल.वी. myocyte क्षैतिज तैनात है और कैमरे के एपर्चर निकाला जाता है तो यह है कि myocyte रह रहे रिकॉर्डिंग क्षेत्र और कम से कम पृष्ठभूमि क्षेत्र के सबसे शामिल है। रिकॉर्डिंग के क्षेत्र में, क्लिक करें और (रिकॉर्डिंग कार्यक्रम के माध्यम से) कंप्यूटर स्क्रीन पर इस बॉक्स को खींचकर बैंगनी बॉक्स के आयामों को समायोजित। जब औसत sarcomere लंबाई एक तेज लाल पीक पता चलता है, रिकॉर्डिंग (चित्रा 2A, कम छवि) शुरू करते हैं।

दोनों sarcomere लंबाई और intracellular सीए 2 transie एनटीएस (Fura-2 के अनुपात में) एक ही myocytes (चित्रा 3 ए) से एक साथ दर्ज हैं। Sarcomere लंबाई और सीए 2 + यात्रियों की औसत निशान चित्रा 3 बी में दिखाया जाता है। व्यक्तिगत रूप से, डायस्टोलिक / सिस्टोलिक sarcomere लंबाई, समय चोटी (पीटी), और sarcomere छोटा आयाम और myocyte सिकुड़ना की गतिशीलता की जांच करने के लिए मापा जाता है। 50% छूट (टीआर 50) के लिए समय myocyte की छूट आकलन करने के लिए विश्लेषण किया है। इसी तरह, डायस्टोलिक और सिस्टोलिक Fura-2 के अनुपात (सीए 2 + यात्रियों), समय चोटी (पीटी) सीए 2 + यात्रियों और सीए के समय लगातार 2 + क्षणिक क्षय (ताऊ) का आकलन करने के लिए myocyte संकुचन और विश्राम (तालिका विश्लेषण कर रहे हैं 1)। इस उदाहरण में, सीए 2 + यात्रियों के आयाम मामूली उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहे से एल.वी. myocytes में बढ़ रहे हैं और संकुचन मामूली कम है (चित्रा 3 बी और 1 टेबल)।

सामग्री "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "> इसके अलावा, Fura के बीच संबंधों - 2 अनुपात और sarcomere लंबाई (एल.वी. myocytes की myofilament सीए 2 संवेदनशीलता का संकेत है) दोनों दिखावा और उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहों में प्लॉट किए जाते हैं ( । - चित्रा 3 सी) Fura 2 myocyte के विश्राम के चरण के दौरान sarcomere लंबाई प्रक्षेपवक्र cytosol सीए 2, myofilament सीए 2 बंधन, और sarcomere लंबाई 14 वर्ष की एक अर्ध-संतुलन को परिभाषित करता है, इसलिए, विश्राम चरण दो के बीच तुलना की जाती है समूहों। दाहिनी ओर उच्च रक्तचाप से ग्रस्त समूह से myocytes में प्रक्षेपवक्र की पारी सीए 2 (चित्रा 3 सी) के लिए एक कम myofilament प्रतिक्रिया इंगित करता है। तदनुसार, intracellular सीए 2 + एकाग्रता आधा छूट (ईसी 50) के लिए आवश्यक बढ़ जाती है (चित्रा 3 सी) , उच्च रक्तचाप में myofilament सीए 2 -desensitization का जिक्र है।


चूहे दिल से एल.वी. myocytes अलग-थलग करने के लिए चित्रा 1. प्रक्रिया। (ए) Langendorff छिड़काव प्रणाली दिल महाधमनी के माध्यम से cannulated में अलगाव समाधान छिड़कना के लिए इस्तेमाल किया (इनसेट, छिड़काव प्रणाली पर मुहिम शुरू की दिल का बढ़ाया छवि) (ख) मैं - III:। Collagenase समाधान 1 के साथ पाचन के बाद दिल और एक डिश और फ्लास्क में एल.वी. ऊतक विच्छेदित (बी) के चतुर्थ - छठी:।। myocyte निलंबन collagenase समाधान 2, centrifugation के बाद myocyte गोली, और फिर से निलंबित कर दिया myocyte गोली भंडारण समाधान में के अलावा के बाद (बी) सातवीं: ऊष्मायन, एल.वी. सेते Fura 2:00 में myocytes - युक्त अलगाव समाधान (2 माइक्रोन Fura 2 AM, 250 माइक्रोन के सीए 2 और 2 μl Poloxamer 407 के साथ); वार्शआउट, 500 माइक्रोन सीए 2 के साथ अलगाव के समाधान के साथ एल.वी. myocytes धो; में लोड एल.वी. myocytes - भंडारण रखने के Fura-2 AMताजा अलगाव 500 माइक्रोन सीए 2 युक्त समाधान। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. sarcomere छोटा और Fura-2 के अनुपात (intracellular सीए 2 स्तर का संकेत) के मापन। (ए) sarcomere का एक चित्र, एक Fura-2 -loaded एल.वी. myocyte की एक छवि है और औसतन sarcomere लंबाई (लाल पीक) को कंप्यूटर पर प्रदर्शित कर रहे हैं। कम पैनल में, काले लाइन ब्याज की बैंगनी क्षेत्र के भीतर प्रत्येक क्षैतिज पिक्सेल लाइन का औसत है। ब्लू लाइन ही डेटा प्रत्येक के अंत में चुना है। लाल रेखा फास्ट फूरियर रूपांतरण (FFT) सत्ता स्पेक्ट्रम है, जो संकेत FFT की गणना की है की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है। एक तेज पीईएके एक साफ sarcomere रिकॉर्डिंग बनाम ही एल.वी. की sarcomere लंबाई Fura 2 अनुपात (सी) चरण विमान साजिश का मतलब है। (बी) sarcomere लंबाई और क्षेत्र उत्तेजना (2 हर्ट्ज) के जवाब में Fura -2 अनुपात का एक साथ रिकॉर्डिंग। myocyte (ध्यान दें कि दोनों वास्तविक लंबाई / Fura 2 अनुपात और डेल्टा इन मापदंडों के परिवर्तनों का विश्लेषण किया जाता है)। चुनाव आयोग 50 (50% छूट पर Fura 2 अनुपात, चक्र तीर द्वारा संकेत) समूह के बीच myofilament सीए 2 संवेदनशीलता के गुणात्मक तुलना नहीं है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. दिखावा और उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहों में एल.वी. myocyte संकुचन के विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम है। (ए) sarcomere रों कच्चा निशानhortening और Fura - दिखावा और उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहों से एल.वी. myocytes में 2 अनुपात माप (बी) sarcomere लंबाई और Fura की औसत निशान -। 2 का संकेत है। औसतन निशान में विश्लेषण पैरामीटर तालिका में दिखाए जाते हैं 1. (सी) Fura के पहले चरण का विमान भूखंडों - 2 अनुपात बनाम sarcomere लंबाई (दोनों वास्तविक लंबाई और Fura - इन मानकों में से 2 अनुपात और डेल्टा परिवर्तन) को दो समूहों में । प्रक्षेपवक्र पाश सही करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है और चुनाव आयोग में 50 उच्च रक्तचाप में अधिक हो जाता है, सुझाव myofilament सीए 2 desensitization। पीटी, समय चोटी (एसईसी); 50% छूट (एसईसी) के लिए समय: .tr 50 - ताऊ, सीए 2 क्षणिक क्षय (एसईसी) के समय लगातार (एक घातीय समारोह के साथ 2 अनुपात Fura की गिरावट चरण फिटिंग द्वारा प्राप्त)। चित्र तीन एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा की।

पैरामीटर्स दिखावा उच्च रक्तचाप
Intracellular सीए 2 + डायस्टोलिक सीए 2 1.189 1.124
सिस्टोलिक सीए 2 1.71 1.691
आयाम (Δ अनुपात) 0.521 0.567
शिखर तक समय (पीटी, ओं) 0.021 0.031
ताउ (s) 0.079 0.076
sarcomere डायस्टोलिक 1.758 1.78
sarcomere लंबाई (माइक्रोन)
sarcomere 0.122 0.115
कमी (16; लंबाई, मिमी)
शिखर तक समय (पीटी, ओं) 0.064 0.055
50% करने के लिए समय 0.032 0.03
छूट (टीआर 50, ओं)
EC50 [सीए 2 +] मैं (Fura-2 के अनुपात) 50% sarcomere relengthening के लिए 0.2382 0.3224

तालिका 1 Fura का विश्लेषण - 2 अनुपात (intracellular सीए 2) और sarcomere लंबाई माप।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ, हम एक अलग हृदय myocyte में myofilament सीए 2 संवेदनशीलता के परिवर्तन का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है और electrophysiological गुण के साथ इस पैरामीटर, intracellular सीए 2 + यात्रियों, और myofilament गतिशीलता को मापने के महत्व पर जोर। इसका कारण यह है एक या मापदंडों के दो बच्चों की रिकॉर्डिंग तंत्र हृदय संकुचन और अंतर्निहित बयान नहीं कर सकता है। पारंपरिक तरीकों कि myocyte संकुचन और intracellular सीए 2 प्रोफ़ाइल को व्यक्तिगत रूप से 1 मापने के विपरीत, वर्तमान पद्धति एक साथ एक ही हृदय myocytes में दोनों मानकों परख होती है।

तरीकों की एक संख्या में आम तौर मांसपेशियों या myocytes 15,16,17, जैसे, चमड़ी myocytes में बहिर्जात सीए के बीच बातचीत की परीक्षा 2 + और ​​sarcomere / सेल लंबाई / तनाव की myofilament सीए 2 संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं(जैसे सैपोनिन या β-esin झिल्ली permeabilize के रूप में डिटर्जेंट के साथ इलाज)। लंबाई फोटो डायोड और लेजर बीम विवर्तन तकनीक, और बल ट्रांसड्यूसर या कार्बन फाइबर) के साथ तनाव के साथ मापा जाता है। इन तकनीकों में व्यापक रूप से पेशी के अध्ययन में इस्तेमाल कर रहे हैं, क्योंकि वे myofilament सीए 2 संवेदनशीलता के मात्रात्मक आकलन सक्षम करें। हालांकि, प्लाज्मा झिल्ली और intracellular सीए 2 से निपटने में अंतर्जात आयन चैनल गतिविधियों, उन myofilament के यांत्रिकी आरंभ करने के लिए आवश्यक हैं, इन तकनीकों में उपेक्षित रहे हैं। इसके अलावा, मांसपेशियों स्ट्रिप्स या myocytes अध्ययन के तहत पूर्व बढ़ाकर एक निश्चित डायस्टोलिक लंबाई करने के लिए कर रहे हैं, और इन परिस्थितियों में, प्रारंभिक sarcomere लंबाई myocytes (विशेष रूप से बीमारी की स्थिति में और उपायों के साथ) की वास्तविक लंबाई डायस्टोलिक से अलग कर सकते हैं। यह वर्तमान माप जहां सेलुलर organelles अपेक्षाकृत बेफिक्र रहते हैं, जिससे लाभ पर प्रकाश डाला गया, व्यापक evalu सक्षम करने के लिएmyocyte सिकुड़ा समारोह का समझना।

जाहिर है, myocytes (सीए 2 -tolerating) और Fura का इष्टतम लोडिंग की गुणवत्ता - 02:00 myofilament सीए 2 संवेदनशीलता के सफल मूल्यांकन के लिए दो महत्वपूर्ण तत्व हैं। तदनुसार, कई संशोधनों प्रोटोकॉल के आदेश व्यवहार्य छड़ के आकार myocytes प्राप्त करने के लिए (कुल कोशिकाओं के 60-80%, जैसा कि पहले 18,19,20 वर्णित) लागू कर रहे हैं। सबसे पहले, सीए 2 के एक कम खुराक पाचन प्रक्रियाओं (जैसे, सीए 2 एकाग्रता collagenase समाधान में 50 माइक्रोन के और भंडारण समाधान में 200 माइक्रोन है) के दौरान समाधान करने के लिए जोड़ा गया है। दूसरा, पाचन प्रक्रिया के दौरान बीएसए collagenase समाधान करने के लिए झिल्ली स्थिरता को बढ़ाने के लिए कहा है। तीसरा, समाधान का सबसे अलगाव है, जो कार्यात्मक myocytes का प्रतिशत और प्रयोगों की अवधि (6-8 घंटा) को बढ़ाता दौरान ऑक्सीजन रहे हैं। चौथा, पृथक myocytes में भंडारण समाधान सी रखा जाता हैontaining 200 माइक्रोन के सीए 2।

Fura 02:00 के साथ इष्टतम लोड हो रहा है प्राप्त करने के लिए, दो अलग अलग सीए 2 सांद्रता (250 और 500 माइक्रोन) इस्तेमाल कर रहे हैं और Poloxamer 407 (2 μl, 20% डाइमिथाइल sulfoxide में तैयार) झिल्ली के माध्यम से Fura-02:00 की पारगम्यता बढ़ाने के लिए जोड़ा जाता है और myocytes में अपनी स्थिरता। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सभी सीए 2 सूचक रंगों सीए 2 बफ़र्स 21 हैं। इसलिए, शोधकर्ताओं Fura-2 AM के एक उच्च एकाग्रता या एक लंबी ऊष्मायन का उपयोग कर अत्यधिक बफरिंग और कम myocyte सिकुड़ना से बचने के लिए बचना चाहिए। यह सिफारिश की है कि बिना Fura myocyte संकुचन - 2 लोड हो रहा है नियमित रूप से जाँच की है, जो myocyte की गुणवत्ता और लदान स्थिति अनुमान लगाने के लिए एक आवश्यक कदम है। लदान में परिवर्तनशीलता अनिवार्य है। इसलिए, यह myocyte संकुचन की परिवर्तनशीलता जाँच करने के लिए, विशेष रूप से, चाहे कक्ष में myocytes करार की संख्या पहले और एक समान है महत्वपूर्ण हैfter लोड हो रहा है। क्योंकि वे myocytes की औसत स्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं करते और पक्षपाती परिणाम और मूल्यांकन के कारण हो सकता है अति या hypo-करार myocytes के विश्लेषण से बचा जाना चाहिए।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि Fura 2 अनुपात में मापा परिवर्तन सीए 2 की वास्तविक रासायनिक एकाग्रता intracellular सीए 2 स्तर का प्रतिबिंब है, बजाय हैं। इसलिए, विधि यहाँ वर्णित सीए 2 को myofilaments की वास्तविक संवेदनशीलता myofilament सीए 2 संवेदनशीलता के गुणात्मक परिवर्तन, बजाय मूल्यांकन करता है। Fura की कैलिब्रेशन - 2 संकेत intracellular सीए 2 + एकाग्रता के लिए अलग-अलग myocytes में विश्वसनीय सीए 2 सांद्रता प्राप्त करने के लिए समाधान है। 2 AM (सीए 2 एकाग्रता 0 से 39 माइक्रोन के को लेकर), और प्राप्त Fura - - अंशांकन प्रक्रिया सीए के विभिन्न सांद्रता के साथ myocytes लोड की आवश्यकता है 2+ Fura संयुग्मित 2 अनुपातों वें के साथ गणना कर रहे हैंई निम्न सूत्र: [सीए 2 +] मैं = केडी * (आर - Rmin) / (Rmax - आर) * F380max / F380min 21। यह एक ऐसी अंशांकन प्रक्रिया के माध्यम से सीए 2 सांद्रता के जमा औसत मान प्राप्त करने के लिए संभव है। हालांकि, क्योंकि सीए 2 संकेतक की लोडिंग myocytes और अंशांकन के बीच चर एक व्यक्ति के सेल में नहीं किया जाता है है, सीए 2 सांद्रता सही हासिल नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, अगर F360 / F380 F340 / F380 के बजाय मापा जाता है (वर्तमान अध्ययन के रूप में), Fura 2 अनुपात कम सटीक (क्योंकि F360 Fura-2 प्रतिदीप्ति 22 के isobestic तरंग दैर्ध्य है)। फिर भी, यह अभी भी शारीरिक प्रयोगों में myofilament सीए 2 संवेदनशीलता में गुणात्मक परिवर्तन, विशेष रूप से रोगग्रस्त मानव मन, जहां myofilaments समन्वित रूप intracellular पर्यावरण में परिवर्तन के बाद बदला जा सकता है में आकलन करने के लिए एक वैध तरीका है। यह सिफारिश की है कि इस विधि वैकल्पिक तरीकों के साथ संयुक्त है (के रूप में डीचर्चा खंड में पहले से मानते) ठीक करने के लिए सीए 2 myofilaments का सच संवेदनशीलता का विश्लेषण करने के लिए।

myocyte संकुचन के अध्ययन में विधि के अन्य सीमा उतार शर्त है। यह बहुत मूल्यवान समझना या myofilament सीए 2 संवेदनशीलता में परिवर्तन overestimate सकता है। इसलिए, सही myofilament सीए 2 संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने, विश्लेषण दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन के लिए वैकल्पिक माप के साथ किया जाना चाहिए।

तकनीक मानव हृदय के नमूने, जहां सेलुलर redox पर्यावरण और बाद ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों बदल रहे हैं, myofilament कार्यों में सहवर्ती परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप सहित स्वस्थ और रोगग्रस्त दिल, में दौरे समारोह का आकलन करने के लिए लागू है। विशेष रूप से, आयन चैनल, intracellular आयन homeostasis और myofilaments में नियामक प्रोटीन बातचीत कर रहे हैं; इसलिए, इन सभी घटकों concer में समारोहटी (, जैसे के रूप में इकोकार्डियोग्राफी में मापा) विवो में दिल प्रदर्शन को निर्धारित करने के लिए।

अंत में, हम myofilament सीए 2 संवेदनशीलता के परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि का वर्णन है और myocyte समारोह का एक पूरा प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ संयोजन, intracellular सीए 2 हैंडलिंग, और myocyte संकुचन में इस पैरामीटर का विश्लेषण करने के महत्व पर जोर। Myofilament सीए 2 संवेदनशीलता रोगग्रस्त दिल मॉडल है, जहां इन मानकों में परिवर्तन के साथ ही विभिन्न intracellular संकेत दे रास्ते का उपयोग कर रहे हैं परस्पर यंत्रवत अध्ययनों में नियमित तौर पर मापा जाना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

इस शोध कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) शिक्षा, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (2013068067) द्वारा वित्त पोषित के माध्यम से बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था; शिक्षा, विज्ञान और प्रौद्योगिकी, सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी अस्पताल, उच्च रक्तचाप के कोरियाई सोसायटी (2013), एस के दूरसंचार रिसर्च फंड के कोरियाई मंत्रालय के ब्रेन कोरिया 21 स्नातकोत्तर कार्यक्रम द्वारा (कोई। 3420130290) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन से (NSFC 31460265; NSFC 81260035)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague Dawley rat Koatech 8-12 weeks
Pentobarbital Sodium Hanlim Pharmaceutical (Korea) AHN901 Insurance code:645301220
NaCl Sigma S9625
KCl Sigma P4504
NaH2PO4 Sigma S8282
HEPES Sigma H3375
Glucose Sigma G8270
CaCl2 Biosesang C2002
MgCl2 Biosesang M2001
Mannitol Sigma M4125
MgSO4 Sigma M5921
Sodium Pyruvate Sigma P2256
Taurine Merck 8.08616.1000
Na2HPO4  Sigma 71649
Bovine Fetal Albumin Sigma A7906
Collagenase Type 2 Worthington LS004177
Protease Sigma P6911
Fura-2 (AM) Molecular Probes F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO Invitrogen P3000MP
Shaking Water Bath Chang Shin Scientific Model: C-108
IonWizard Softwae Suite IonOptix Ltd Experimental Builder Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System IonOptix Ltd
Circulating Water Bath BS-Tech BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope Nikon DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power IonOptix
Fluorescence & Video Detection IonOptix MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface IonOptix FSI700
Excitation Light Source IonOptix mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply Cairn Reseach
Filter wheel controller IonOptix GB/MUS200
Digital Stimulator Medical Systems Corportion S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name Company Catalog Number Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl Sigma S9625 Concentration (mmol) 135
KCl Sigma P4504 Concentration (mmol) 5.4
HEPES Sigma H3375 Concentration (mmol) 5
Glucose Sigma G8270 Concentration (mmol) 5
MgCl2 Biosesang M2001 Concentration (mmol) 3.5
Taurine Sigma CB2742654 Concentration (mmol) 20
Na2HPO4  Sigma 71649 Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl Sigma S9625 Concentration (mmol) 120
KCl Sigma P4504 Concentration (mmol) 5.4
HEPES Sigma H3375 Concentration (mmol) 10
Glucose Sigma G8270 Concentration (mmol) 5.5
CaCl2 Biosesang C2002 Concentration (mmol) 0.2
Mannitol Sigma M4125 Concentration (mmol) 29
MgSO4 Sigma M5921 Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate Sigma P2256 Concentration (mmol) 5
Taurine Sigma CB2742654 Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl Sigma S9625 Concentration (mmol) 141.4
KCl Sigma P4504 Concentration (mmol) 4
NaH2PO4 Sigma S8282 Concentration (mmol) 0.33
HEPES Sigma H3375 Concentration (mmol) 10
Glucose Sigma G8270 Concentration (mmol) 5.5
CaCl2 Biosesang C2002 Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2 Biosesang M2001 Concentration (mmol) 1
Mannitol Sigma M4125 Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2 Worthington LS004177 Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease Sigma P6911 Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2 Biosesang C2002 Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2 Worthington LS004177 Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2 Biosesang C2002 Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin Sigma A7906 Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2 Biosesang C2002 Concentration (mmol) 1mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bers, D. M., et al. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
  2. Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
  3. Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
  4. Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
  5. Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
  6. Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
  7. Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
  8. Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
  9. Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
  10. Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336 (2013).
  11. Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
  12. Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
  13. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
  14. Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
  15. Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
  16. Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
  17. Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
  18. Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
  19. Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
  20. Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
  21. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  22. Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).

Tags

सेलुलर जीवविज्ञान अंक 114 हृदय myocytes हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी intracellular सीए myofilament सीए संकुचन उत्तेजना संकुचन युग्मन
Myofilament सीए का आकलन<sup&gt; 2 +</sup&gt; संवेदनशीलता अंतर्निहित कार्डिएक उत्तेजना संकुचन युग्मन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Z. H., Jin, C. L., Jang, J.… More

Zhao, Z. H., Jin, C. L., Jang, J. H., Wu, Y. N., Kim, S. J., Jin, H. H., Cui, L., Zhang, Y. H. Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling. J. Vis. Exp. (114), e54057, doi:10.3791/54057 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter