Abstract
Hartfalen en hartritmestoornissen zijn de belangrijkste oorzaken van sterfte en ziekte wereldwijd. Toch blijft het mechanisme van de pathogenese en myocardiale storing in het zieke hart volledig worden opgehelderd. Recente overtuigend bewijs toont aan dat veranderingen in de myofilament Ca2 + gevoelige invloed intracellulair Ca2 + homeostase en ionkanaal activiteiten in cardiomyocyten, essentiële mechanismen verantwoordelijk voor de cardiale actiepotentiaal en inkrimping van gezonde en zieke harten. Sterker nog, de activiteiten van ionkanalen en transporteurs onderliggende cardiale actiepotentialen (bijvoorbeeld Na +, Ca 2+ en K + kanalen en de Na + -Ca 2+ wisselaar) en intracellulaire Ca 2+ hanteren eiwitten (bijv., Ryanodinereceptor en Ca 2+ -ATPase in sarcoplasmatisch reticulum (SERCA2a) of fosfolamban en de fosforylatie) worden gewoonlijk gemeten evaluat de fundamentele mechanismen van cardiale excitatie-contractie (EG) koppeling. Zowel elektrische activiteiten in de membraan en intracellulaire Ca2 + veranderingen de triggersignalen van EC koppeling, terwijl myofilament de functionele eenheid van samentrekking en ontspanning en myofilament Ca2 + gevoeligheid noodzakelijk is in de uitvoering van myofibril prestaties. Niettemin weinig studies nemen myofilament Ca2 + gevoeligheid in de functionele analyse van het myocardium tenzij het het focus van de studie. We beschrijven een protocol dat sarcomeer verkorting / re-verlenging en het intracellulaire Ca2 + level behulp Fura-02:00 (ratiometrische detectie) en de veranderingen van myofilament Ca2 + gevoeligheid van cardiale myocyten van ratteharten evalueren meet. Het belangrijkste doel is om te benadrukken dat myofilament Ca 2+ gevoeligheid moet in de EG-koppeling in aanmerking worden genomen voor mechanistische analyse. Uitgebreid onderzoek van de iop de kanalen, ion transporters, intracellulaire Ca 2+ handling en myofilament Ca 2+ gevoeligheid die myocyte contractiliteit in gezonde en zieke harten ten grondslag liggen zal waardevolle informatie voor het ontwerpen van meer effectieve strategieën van translationeel en therapeutische waarde.
Introduction
Cardiale excitatie-contractie (EG) koppeling de grondschema voor de analyse mechanische eigenschappen van het myocardium, dwz de contractiele functie van het hart 1,2. EG koppeling wordt geïnitieerd door membraandepolarisatie secundair aan de activiteiten van sarcolemmale ionkanalen (bijvoorbeeld het spanningsgevoelige Na + kanaal, welke kan worden gemeten met patch-clamp techniek). Daaropvolgende activering van spanningsafhankelijke L-type Ca 2+ kanalen (LTCCs) en Ca 2+ influx via LTCCs leiden tot het grootste deel van Ca 2+ vrijkomen door middel van ryanodinereceptor (RyRs), het verhogen van de cytosolische Ca 2+ concentratie van het nanomolair (nM ) naar micromolair (uM) niveau. Een dergelijke verhoging van cytosolisch Ca2 + bevordert Ca2 + binding aan troponine C (TnC) in dunne filamenten en wekt conformatieveranderingen van het filament complex aan de actine-myosine interactie vergemakkelijken en bereikt myocardial contractie 3. Omgekeerd, het cytosolische Ca2 + weer wordt uptaken terug in het sarcoplasmatisch reticulum (SR) via Ca2 + -ATPase in SR (SERCA2a) of buiten de myocyten geëxtrudeerd via de Na + / Ca2 + uitwisselaar en plasmalemmal Ca2 + ATPase 1,2. Bijgevolg is de daling van cytosolische Ca2 + aanzet conformatieveranderingen van dunne filamenten terug naar de oorspronkelijke toestand, waardoor de dissociatie van actine-myosine en myocyt ontspanning 1-3. In dit schema wordt de activiteit van SERCA2a algemeen beschouwd als de snelheid van myocardiale relaxatie bepalen omdat het goed is voor 70-90% van cytosolische Ca 2 verwijderd in de meeste zoogdiercellen hartcellen 1. Als zodanig abnormale Ca 2+ behandeling door LTCC, RyR en SERCA2a, etc. werd beschouwd als de belangrijkste mechanismen voor de verminderde contractiliteit en ontspanning in het zieke hart 1-4.
2+ die fungeert als de boodschapper in EC koppeling is goed voor ongeveer 1% van de totale intracellulaire Ca 2+ en de meerderheid van Ca 2+ is gebonden aan de intracellulaire Ca 2+ buffers 5,6. Dit komt door het feit dat verschillende Ca2 + buffers zijn overvloedig in cardiomyocyten, bijvoorbeeld membraanfosfolipiden, ATP, creatinefosfaat, calmoduline, parvalbumine, myofibril TnC, myosine, SERCA2a en calsequestrin de SR. 5,6,7. Onder hen, SERCA2a en TnC de overheersende Ca2 + buffers 5,6,7. Bovendien Ca2 + binding aan de buffers is een dynamisch proces in zenuwtrekking (bijvoorbeeld, 30-50% Ca2 + bindt aan TnC en losmaken van het tijdens Ca2 + transiënten 7) en de verandering in Ca2 + binding veroorzaken aanvullende "vrijgeven" van vrij Ca2 + het cytosol, leidt tot veranderingen van de intracellulaire Ca2 + concentration. Derhalve verstoring van de intracellulaire Ca2 + niveau induceert myofilament abnormale bewegingen, die de voorlopers van contractiele dysfunctie en hartritmestoornissen 8,9 zijn. Vele factoren (zowel fysiologische en pathologische) kunnen de bronnen van post-transcriptionele modificaties van myofilament eiwitten, die myofilament Ca 2+ buffering en myofilament Ca 2+ gevoeligheid 8-10 beïnvloeden. Onlangs werd gerapporteerd dat mutaties in myofilament eiwitten verhogen Ca2 + bindingsaffiniteit en intracellulaire Ca2 + handling, triggering pauze-afhankelijke versterking Ca2 + transiënten, abnormale Ca2 + afgifte, en hartritmestoornissen 8. In overeenstemming met dit concept, hebben we ook aangetoond dat myofilament Ca2 + desensibilisatie bij hypertensieve ratten harten secundair aan de up-regulatie van neuronale stikstofoxidesynthase is geassocieerd met verhoogde diastolische en systolische Ca2 + niveaus11, die op zijn beurt, verhoogt de kwetsbaarheid van de LTCC om Ca2 + -afhankelijke 12 inactivering. Daarom myofilament Ca2 + gevoeligheid is een "actieve" regelaar van intracellulair Ca2 + homeostase en myocyt contractiele functie. Het is noodzakelijk geworden om interacties tussen myofilament en Ca 2+ analyseren de behandeling van eiwitten voor grondig onderzoek van myocyten EG koppeling en hartfunctie.
We beschrijven een protocol dat de veranderingen van myofilament Ca2 + gevoeligheid geïsoleerde cardiomyocyten beoordeelt. Uitgebreide analyse van de intracellulaire Ca 2+ profiel, zal myofilament Ca 2+ gevoeligheid en krimp nieuwe mechanismen ontgraven onderliggende myocard mechanica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol is in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren gepubliceerd door de National Institutes of Health van de VN (NIH publicatie nr 85-23, herzien 1996). Het werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Seoul National University (IACUC goedkeuring nr .: SNU-101213-1).
1. Buffer Voorbereiding (tabel materialen en apparatuur)
- Bereid 300 ml verse isolatieoplossing op de dag van het experiment (in mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl2, 3,5; glucose, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4, taurine, 20; pH 7,4 met NaOH).
- Bereid 100 ml vers opslagoplossing op de dag van het experiment (in mM: NaCl 120, KCl 5,4; MgSO4 5, CaCl2 0,2, natrium- pyruvaat 5, glucose 5,5, taurine 20, HEPES 10, mannitol 29; pH 7,4 met NaOH).
- Bereid 1 liter perfusie-oplossing (in mM: NaCl, 141,4, KCl, 4; NaH 2PO 4, 0,33; MGCl 2, 1; HEPES, 10; glucose, 5,5; CaCl2, 1,8; mannitol, 14,5; pH 7,4 met NaOH).
- Bereid 30 ml collagenase oplossing 1 door toevoeging van collagenase (1 mg / ml), protease (0,1 mg / ml), runderserumalbumine (BSA, 1.67mg / ml) en Ca2 + (0,05 mM) tot 25 ml isolatie oplossing.
- Bereid 20 ml collagenase oplossing 2 door toevoeging van collagenase (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml) en Ca2 + (0,05 mM) 16,7 ml isolatieoplossing.
- Bereid 40 ml van BSA door toevoeging 0,4 g BSA aan 40 ml isolatieoplossing. Aparte 10 ml en 30 ml in twee bekers. Voeg Ca2 + aan 30 ml BSA oplossing zodat de uiteindelijke Ca2 + -concentratie in de BSA oplossing 1 mM.
2. Voorbereiding van de Isolatie van de linker ventriculaire (LV) Myocytes
- Transfer 8-12 weken oude, mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten in schoon vervoer kooien van de dieren mogelijkheid om de voorbereiding en de isolatiekamer.
- Heet twee waterbaden tot 37 o C.
Opmerking: Gebruik een waterbad voor het water - een mantel reservoir en de perfusie buizen van de Langendorff perfusie-systeem. Gebruik de andere waterbad hartspierweefsel trunks schudden om het ene myocyten te scheiden. - Voeg 5 ml en 3,3 ml van de BSA-oplossing (zonder Ca 2+) tot 25 ml collagenase oplossing 1 en 16,7 ml collagenase oplossing 2 om het volume op 30 ml en 20 ml.
- Voeg isolatieoplossing (100 ml) en collagenase oplossing 1 (30 ml) naar kolom 1 (Kol 1) en 2 kolom (Kol 2) in het Langendorff perfusie systeem, respectievelijk (Figuur 1A).
- Zuurstof de isolatie-oplossing en collagenase oplossing 1 in Col. 1 en Col.2 via de zuurstof verbindingsbuis in het Langendorff perfusie-systeem (Figuur 1A). Evenzo oxygenaat collagenase oplossing 2 en de BSA oplossing in de schudwaterbad met 100% O 2 via dezuurstof verbindingsbuis.
3. Isolatie van LV myocyten
- Verdoven een SD rat via intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium (30 mg / kg) en bevestig de narcose status via teen knijpen en het ontbreken van terugtrekking reflectie.
- Verplaats de rat naar een dissectie lade. In rugligging, zet de vier poten aan de zijden van het lichaam met tape.
- Solliciteer thoracale mid-axiale insnijdingen met chirurgische schaar om de kist te openen, zodat het hart niet te beschadigen. Met een paar schone schaar om het hart ontleden van de verbindende vaten (bv superior en inferior vena cava, longvaten en aorta) en pericardiale membraan 13.
- Laat een deel van de aorta van een voldoende lengte (5-8 mm), klem de aorta met fijne pincet en de canule van het Langendorff perfusie systeem snel te monteren binnen 1 min (Figuur 1A). Bind hechtdraad 4/0 strak over de aorta.
- Demonteer de verteerde hart door het snijden van de aorta en over te dragen door het vasthouden van de aorta met een tang in de kolf met vers isolatie-oplossing (figuur 1Bi). Gebruik fijne schaar en forceps meeste van de LV vrije wand (inclusief het septum) in kleinere stukjes (~ 22 mm, figuur 1Bii).
- Breng de stukken in een kolf die voorverwarmd en zuurstofrijk vers collagenase oplossing 2 (figuur 1Biii). Schud gedurende 10 minuten. Blijven leveren zuurstof aan de myocyten bevattende collagenase oplossing 2.
- Verplaats de myocyten - vering met een 10 ml centrifugebuis met behulp van druppelaars met een zuigingsbol en voeg Ca 2+ - bevattende BSA-oplossing (1: 1 in volume). Centrifugeer bij 30 g gedurende 2 minuten en gooi de supernatant. Re-schorten de myocyt pellet in 5 ml van de BSA-oplossing. Centrifuge en gooi de supernatant.
- Verspreiden de myocyten pellets en houden myocyten in 10 ml pre-geoxygeneerde opslagoplossing bij kamertemperatuur (Figuur 1Biv-vi).
- Herhaal de procedures (stappen 3,7-3,9) met de resterende LV weefsel in de kolf.
Opmerking: Houd herhalen procedures (stappen 3,7-3,9) totdat het meeste LV weefsel verdwijnt om een goede opbrengst van myocyten te verkrijgen. - Houd de myocyten in opslagoplossing voor 6-8 uur bij KT tot eind experimenten.
4. gelijktijdige metingen van intracellulaire Ca 2 + transiënten en Myocyte Contractie
- Load LV myocyten met acetoxymethyl ester Fura-02:00 (2 uM).
Opmerking: Voer alle laad- procedures en experimenten met geladen myocyten in een donkere buis (figuur 1Bvii).- centrifuge de myocyten suspensie (1 ml) bij 2000 xg gedurende 10 sec. Verwijder het supernatant en resuspendeer de myocyt pellet in 1 ml Tyrode oplossing met een lage Ca 2+ concentratie (250 uM, Tafel materialen en apparatuur).
- Add Fura-02:00 en poloxameer 407 (2 pl) voorzichtig dispergeren myocyten suspensie en het mengsel bij kamertemperatuur houden (20-24 ° C) gedurende 15 min (Fig 1Bvii).
- Centrifugeer het mengsel gedurende 5 sec Verwijder de bovenstaande vloeistof en de verspreiding van de myocyt pellet in 1 ml perfusie oplossing die 500 uM Ca2 +. Na 10 min centrifugeren van het mengsel gedurende 5 sec Verwijder de bovenstaande vloeistof.
- Voeg frisse perfusievloeistof (500 uM Ca2 +, 1 ml) en houd de Fura-02:00 - loaded myocyte pellet in deze oplossing voor opnames.
- Meting van myocyten LV contractie en intracellulair Ca2 +
- Voordat u gaat opnemen, vul de perfusie buis die door middel van een looptwater jas met de Tyrode oplossing, die is voorverwarmd tot 36 o C.
- Plaats een paar druppels van de Fura 02:00 - geladen LV myocyten schorsing, op de kamer van een omgekeerde fluorescentie microscoop voor 5-8 min. perfuseren langzaam de Tyrode-oplossing (2,2 ml / min).
- Druk op de knop "start" op het frontpaneel van de digitale stimulator om het veld stimulatie (2 Hz) te starten.
Opmerking: De uitgangsspanning (10 V, 5 msec) wordt toegepast op de myocyten in de kamer via platinadraden aan weerszijden van de kamer.- Selecteer myocyten dat contract stabiel (niet die het weergeven van hyper- of hypo-contractie) voor de opname.
- Stel de myocyte keuze in de horizontale stand van de videogebaseerd sarcomeer detectiesysteem en de focus van de microscoop te passen om optimale beelden te verkrijgen sarcomeren. Plaats de paarse rechthoekige doos op het gebied waarin duidelijke sarcomeres duidelijk worden waargenomen tot het gemiddeldevan sarcomeer lengtes (rood piek) toont een enkelvoudige scherpe piek (Figuur 2A, lager afbeelding).
- Noteer de veranderingen van sarcomeerlengte reactie op veldstimulatie (figuur 2A en B).
Opmerking: Gebruik de geladen myocyten binnen 1 - 2 uur. - Stel het diafragma van de camera, zodat het veld in de videogebaseerd sarcomeer detectiesysteem is de grootte van de myocyten (Figuur 2A). Stimuleren van de myocyten met excitatie bij 360 nm / 380 nm en emissie bij 510 nm (overname frequentie 1000 Hz). Neem sarcomeer verkorten en de fura2 AM verhouding met veldstimulatie (figuur 2B).
5. Beoordeling van Myofilament Ca 2+ Gevoeligheid
- Middel de sarcomeer lengte en Ca2 + transiënten in steady state (10 - 20 sporen) en stel de fase-vlak lus van de Fura-2 verhouding vs. sarcomeerlengte dezelfde myocyten (beide met meetwaardes en delta veranderingen; figuur 2C).
- In elk perceel, definiëren Fura -2-ratio op 50% ontspanning (EC 50, figuur 2C). Vergelijk zowel de lus en EC 50 van elke interventie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LV myocyten zijn geïsoleerd van normale en hypertensieve rat harten. Staafvormige myocyten met duidelijke strepen (die sarcomeren) en stabiele samentrekt ingevolge veldstimulatie worden beschouwd als de optimale myocyten zijn en zijn gekozen voor opname (Figuur 2A). In de in F igure 2A bijvoorbeeld een Fura 02:00-geladen LV myocyten is horizontaal geplaatst en het diafragma van de camera wordt ingesteld dat de myocyten neemt het grootste deel van het veld opnemen en minimale achtergrondgebied is inbegrepen. Op het gebied van de opname, stel de afmetingen van de paarse doos door te klikken en dit vak op de computer scherm te slepen (door middel van het opnameprogramma). Wanneer de gemiddelde sarcomeer lengte toont één scherpe rode piek, beginnen met opnemen (onderste afbeelding figuur 2A).
Zowel sarcomeer lengte en intracellulaire Ca 2+ Transie gen (Fura-2 ratio) ook geregistreerd van dezelfde myocyten (Figuur 3A). De gemiddelde sporen sarcomeerlengte en Ca2 + transiënten worden getoond in figuur 3B. Individueel, diastolische / systolische sarcomeer lengte, tijd om piek (PT) en sarcomeer verkorting worden gemeten om de amplitude en de dynamiek van myocyte contractiliteit te onderzoeken. Tijd om 50% relaxatie (TR 50) wordt geanalyseerd om de relaxatie van de myocyte beoordelen. Ook de diastolische en systolische Fura-2's (Ca2 + transiënten), tijd tot piek (PT) Ca2 + transiënten en tijdconstante van Ca2 + voorbijgaande decay (tau) geanalyseerd myocyten contractie en relaxatie (Tabel beoordelen 1). In dit voorbeeld worden de amplitudes Ca2 + transiënten matig verhoogd LV myocyten van een hypertensieve ratten en contractie matig verlaagd (Figuur 3B en Tabel 1).
content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Bovendien, de relaties tussen de Fura - 2 ratio en sarcomeer lengte (met vermelding van de myofilament Ca 2+ gevoeligheid van LV myocyten) zijn uitgezet in zowel sham en hypertensieve ratten ( . Figuur 3C) The Fura 2 - sarcomeerlengte traject gedurende de rustfase van de myocyten definieert een quasi-evenwicht van cytosol Ca2 +, Ca2 + bindende myofilament en sarcomeerlengte 14, daarom wordt de relaxatiefase vergeleken tussen de twee groepen. de verschuiving naar rechts van het traject in myocyten van de hypertensieve groep aangeeft verlaagde myofilament respons op Ca2 + (figuur 3C). Derhalve is de intracellulaire Ca2 + -concentratie vereist voor half ontspanning (EC50) wordt verhoogd (Figuur 3C) Onder verwijzing naar myofilament Ca2 + -desensitization bij hypertensie.Figuur 1. Procedures voor het isoleren van LV myocyten van de rat hart. (A) De Langendorff perfusie systeem om de isolatie oplossing in het hart canule via de aorta perfuseren (bijvoegsel, vergroot beeld van de gemonteerde hart op het perfusie systeem) (B) i - iii. Het hart na digestie met collagenase oplossing 1 en ontleed LV weefsel in een schotel en kolf (B) iv - vi:.. myocyte suspensie na toevoeging van collagenase oplossing 2, myocyten pellet na centrifugatie, en geresuspendeerd myocyt pellet in opslagoplossing (B) vii: Incubatie incubeer LV myocyten in Fura 02:00 - met isolatie-oplossing (2 uM Fura 02:00, 250 pm Ca 2+ en met 2 pl poloxameer 407); uitwassen wassen LV myocyten met isolatie oplossing met 500 uM Ca2 +; opslag, houden Fura-02:00 - geladen LV myocyten inverse isolatie oplossing die 500 uM Ca 2+. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Meting van sarcomeer verkorting en de Fura-2-ratio (een indicatie van de intracellulaire Ca2 + level). (A) Een diagram van sarcomeer, een beeld van een Fura-2-geladen LV myocyten en de gemiddelde sarcomeer lengte (de rode piek) worden weergegeven op de computer. In het onderste paneel, de zwarte lijn is het gemiddelde van elke horizontale pixel lijn binnen de paarse gebied van belang. De blauwe lijn is dezelfde gegevens nulpunt aan elk uiteinde. De rode lijn is de Fast Fourier Transform (FFT) vermogensspectrum, waarbij het aantal signalen van de FFT heeft berekend vertegenwoordigt. Een scherpe peak betekent een schone sarcomeer opname. (B) gelijktijdig opnames van sarcomeer lengte en de Fura -2 verhouding in reactie op het veld stimulatie (2 Hz). (C) Phase-plane plot van de Fura 2-ratio versus sarcomeer lengte van de zelfde LV myocyten (er rekening mee dat zowel de werkelijke lengte / Fura 2 ratio en delta veranderingen van deze parameters worden geanalyseerd). EC 50 (Fura 2-ratio op 50% ontspanning, cirkel aangegeven met pijl) is de kwalitatieve vergelijking van myofilament Ca 2+ gevoeligheid tussen de groepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Representatieve resultaten van de analyse van LV myocyte krimp in sham en hypertensieve ratten. (A) Raw sporen van sarcomeer shortening en Fura - 2 verhouding meting LV myocyten van sham en hypertensieve ratten (B) Gemiddeld sporen van sarcomeer lengte en Fura -. 2 signalen. Parameters in de gemiddelde sporen geanalyseerd worden getoond in Tabel 1. (C) Fase-vlak lagen der Fura - 2 verhouding vs. sarcomeerlengte (zowel de werkelijke lengte en Fura - 2 verhouding en delta veranderingen van deze parameters) in de twee groepen . Het traject lus naar rechts en EC 50 meestal hoger in hypertensie, suggereert myofilament Ca2 + desensitisatie. PT, tijd om piek (sec); Tau, tijd constante van Ca 2+ transient verval (sec) (verkregen door het aanbrengen van de achteruitgang fase van het Fura - 2 verhouding met een exponentiële functie) .tr 50: tijd om 50% ontspanning (sec). 
Klik hier om een grotere versie te bekijkenvan dit cijfer.
| parameters | schijn | hypertensie | |
| Intracellulaire Ca2 + | Diastolische Ca 2+ | 1.189 | 1.124 |
| Systolische Ca 2+ | 1.71 | 1,691 | |
| Amplitude (Δ ratio) | 0,521 | 0,567 | |
| Tijd om piek (PT, s) | 0,021 | 0,031 | |
| Tau (s) | 0.079 | 0,076 | |
| sarcomeer | diastolische | 1.758 | 1.78 |
| sarcomeerlengte (pm) | |||
| sarcomeer | 0,122 | 0,115 | |
| Het verkorten van (16; lengte, mm) | |||
| Tijd om piek (PT, s) | 0,064 | 0,055 | |
| Tijd tot 50% | 0,032 | 0.03 | |
| Ontspanning (TR 50, s) | |||
| EC50 | [Ca 2+] i (Fura-2-ratio) van 50% sarcomeer relengthening | 0,2382 | 0,3224 |
Tabel 1. Analyse van de Fura - 2 verhouding (intracellulaire Ca 2+) en sarcomeer lengte metingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we de protocollen om veranderingen van myofilament Ca 2+ gevoeligheid in enkele geïsoleerde hartspiercel beoordelen en benadrukken het belang van het meten van deze parameter naast elektrofysiologische eigenschappen, intracellulaire Ca 2+ transiënten en myofilament dynamiek. Dit komt omdat de opname van een of twee van de parameters niet de onderliggende mechanismen cardiale contractie en ontspanning kan expliciteren. In tegenstelling tot conventionele werkwijzen die myocyten contractie en de intracellulaire Ca2 + profiel individueel 1 meet de onderhavige methode wordt beide parameters gelijktijdig in dezelfde cardiale myocyten.
Een aantal werkwijzen worden algemeen gebruikt om de myofilament Ca2 + gevoeligheid van spieren of myocyten 15,16,17, bijvoorbeeld onderzoek naar de wisselwerking tussen exogene Ca2 + en sarcomeer / cel lengte / spanning in huid myocyten beoordelen(Behandeling met detergentia zoals saponine of β-esin aan het membraan permeabel). Lengtes worden gemeten met foto-diode en laserstraal diffractie technieken en spanning met kracht transducers of koolstofvezels). Deze technieken worden veel gebruikt in de spieren studies omdat kwantitatieve beoordelingen van myofilament Ca2 + gevoeligheid mogelijk. Echter endogene ionkanaal activiteiten op het plasmamembraan en intracellulaire Ca2 + hanteren, die nodig zijn om het mechanisme van myofilament initiëren, worden verwaarloosd deze technieken. Bovendien, de spierstrips of myocyten bestudeerd vooraf uitgerekt tot een bepaalde diastolische lengte, onder deze omstandigheden, kan de initiële sarcomeerlengte afwijken van de werkelijke diastolische lengte van de myocyten (met name bij ziekte en ingrepen). Dit wijst op het voordeel van de huidige meting, waar celorganellen blijven relatief onverstoorbaar, daardoor, waardoor de uitgebreide evaluatie van myocyte contractiele functie.
Begrijpelijk, de kwaliteit van de myocyten (Ca 2+ -tolerating) en de optimale belading van Fura - 02:00 zijn twee belangrijke elementen voor een succesvolle evaluatie van myofilament Ca 2+ gevoeligheid. Dienovereenkomstig zijn verscheidene wijzigingen aangebracht aan het protocol om leefbare staafvormige myocyten verkrijgen (60-80% van totale cellen, zoals eerder beschreven 18,19,20). Eerst wordt een lage dosis van Ca2 + toegevoegd aan de oplossingen tijdens het oplossen processen (bijvoorbeeld de Ca2 + concentratie 50 uM in de collagenase oplossingen en 200 pM in de opslagoplossing). Ten tweede, tijdens het verteringsproces, BSA toegevoegd aan de collagenase oplossingen membraan stabiliteit. Ten derde, de meeste oplossingen zuurstof tijdens isolatie, waarbij het percentage van functionele myocyten en de duur van de experimenten (6-8 uur) verbetert. Ten vierde, zijn geïsoleerde myocyten in storage-oplossing c gehoudenontaining 200 uM Ca2 +.
Om optimale belading te verkrijgen met Fura 02:00 worden twee verschillende Ca2 + concentraties (250 en 500 uM) gebruikt en poloxameer 407 (2 pl, 20% bereid in dimethylsulfoxide) wordt toegevoegd om de permeabiliteit van Fura-02:00 verbeteren door het membraan en de stabiliteit in myocyten. Opgemerkt wordt dat alle Ca 2+ indicator kleurstoffen Ca2 + buffers 21. Daarom moeten onderzoekers voorkomen dat het gebruik van een hoge concentratie van Fura-2 AM of een langere incubatie overmatig buffering en verminderde myocyten contractiliteit voorkomen. Het wordt aanbevolen dat myocyten contractie zonder Fura - 2 laden regelmatig wordt gecontroleerd, dat is een essentiële stap om de kwaliteit van myocyten en de laadstatus te schatten. Variabiliteit in het laden is onvermijdelijk. Daarom is het belangrijk om de variabiliteit van myocyten contractie controleren met name of het aantal verdragsluitende myocyten in de kamer is gelijk voor en eenfter laden. Analyse van hyper- of hypo-verdragsluitende myocyten mogen worden omdat zij de gemiddelde stand van myocyten te vertegenwoordigen en vertekende en evaluaties veroorzaken.
Opgemerkt wordt dat de gemeten veranderingen in het Fura 2 verhouding weerspiegelingen van de intracellulaire Ca2 + niveau, in plaats van de eigenlijke chemische concentratie van Ca2 +. Daarom is de hier beschreven werkwijze beoordeelt kwalitatieve veranderingen van myofilament Ca2 + gevoeligheid, in plaats van de werkelijke gevoeligheid van myofilamenten Ca 2+. Kalibratie van Fura - 2 signaal naar de intracellulaire Ca2 + -concentratie is de oplossing voor betrouwbare Ca2 + concentratie in individuele myocyten verwerven. De kalibratieprocedure vereist loading myocyten met verschillende concentraties Ca2 + geconjugeerd Fura - 02:00 (Ca2 + concentratie variërend 0-39 uM), en de verkregen Fura - 2's zijn berekend met het ge volgende formule: [Ca 2,] = Kd * (R - Rmin) / (Rmax - R) * F380max / F380min 21. Het is mogelijk om de gecombineerde gemiddelde waarden Ca2 + concentraties leiden door zo'n kalibratieprocedure. Omdat het laden van Ca2 + indicatoren varieert tussen myocyten en kalibratie wordt niet uitgevoerd in een afzonderlijke cel, Ca2 + concentraties niet nauwkeurig verkregen. Bovendien, als F360 / F380 plaats wordt gemeten dan F340 / F380 (zoals in de onderhavige studie), de Fura 2 verhouding minder nauwkeurig is (omdat F360 is het isobestische golflengte van Fura-2 fluorescentie 22). Toch is het nog steeds geldig werkwijze kwalitatieve veranderingen in myofilament Ca2 + gevoeligheid fysiologische experimenten, vooral in de zieke menselijke harten waar myofilamenten gelijktijdig kunnen worden gewijzigd na veranderingen in de intracellulaire omgeving te evalueren. Aanbevolen wordt deze werkwijze in combinatie met andere methoden (zoals deschreven eerder in de discussie sectie) om de ware gevoeligheid van myofilamenten nauwkeurig te analyseren om Ca 2+.
De andere beperking van de methode in de studie van myocyten contractie is onbelast. Het kan onderschatten of de veranderingen in myofilament Ca 2+ gevoeligheid overschatten. Daarom nauwkeurig myofilament Ca2 + gevoeligheid te bepalen, moeten uitgevoerd kunnen worden met alternatieve maten voor zowel kwalitatieve als kwantitatieve beoordeling.
De techniek is toepasbaar voor het beoordelen ventrikelfunctie bij gezonde en zieke harten, met inbegrip van menselijke cardiale monsters binnen het cellulaire redox milieu en post-transcriptionele modificaties worden gewijzigd, waardoor gelijktijdige veranderingen in myofilament functies. In het bijzonder, ionkanalen, intracellulaire ion homeostase en regulerende eiwitten in myofilamenten zijn interactief; daarom al deze componenten functioneren concert tot hart prestaties te bepalen in vivo (bijvoorbeeld zoals gemeten in de echocardiografie).
Concluderend beschrijven we een methode om de wijzigingen van myofilament Ca2 + gevoeligheid evalueren en benadrukken het belang van analyse van deze parameter in combinatie met cardiale elektrofysiologie, intracellulair Ca2 + behandeling en myocyten contractie volledige profiel van myocyten functie. Myofilament Ca 2+ gevoeligheid moet regelmatig worden gemeten in mechanistische studies met zieke hart modellen, waarbij veranderingen in deze parameters, evenals verschillende intracellulaire signaalroutes zijn met elkaar verbonden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door Basic Science Research Program door de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (2013068067); door de Brain Korea 21 Graduate Programme van het Koreaanse ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie, Seoul National University Hospital, de Koreaanse Society of Hypertension (2013), SK Telecom Research Fund (nr. 3420130290) en van de National Natural Science Foundation of China (NSFC 31.460.265; NSFC 81.260.035).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
References
- Bers, D. M., et al.
- Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
- Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
- Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
- Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
- Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
- Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
- Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
- Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
- Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336 (2013).
- Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
- Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
- Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
- Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
- Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
- Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
- Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
- Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
- Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
