Myofilament Ca Değerlendirilmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Duyarlılık temelinde Kardiyak Uyarma-kasılma Kaplin

Özet

Bu makale, sıçan kalbinden izole edilen kardiyak miyositlerde kasılma sırasında miyofilament Ca²⁺ duyarlılığındaki değişiklikleri değerlendiren bir protokolü açıklamaktadır. Kardiyak elektrofizyoloji, sistolik/diyastolik sitozol Ca²⁺ seviyeleri ve kasılma/gevşeme ile birlikte bu ölçüm, sağlıklı ve hastalıklı kalplerde kardiyak uyarılma-kasılma eşleşmesine aracılık eden mekanizmaların desteklenmesinde zorunludur.

Özet

Kalp yetmezliği ve kardiyak aritmi, dünya çapında mortalite ve morbidite nedenlerinin başında gelmektedir. Ancak, hastalıklı kalbinde patogenezi ve miyokard arıza mekanizması tam açıklığa kavuşturulması kalır. Son zorlayıcı kanıtlar Myofilament Ca ²⁺ duyarlılık değişiklikler kardiyak miyositler hücre içi Ca ^{2 +} homeostazı ve iyon kanal faaliyetlerini etkileyen gösteriyor sağlıklı ve hastalıklı kalpleri kardiyak aksiyon potansiyeli ve daralma sorumlu temel mekanizmalar. Gerçekten de, (örneğin, Na ^+, Ca ²⁺ ve K ⁺ kanalları ve Na ⁺ -Ca ²⁺ değiştirici) ve hücre içi Ca ^{2 +} taşıma proteinleri (örneğin., Ryanodin reseptörleri ve Ca kardiyak aksiyon potansiyelleri altında yatan iyon kanallarının faaliyetleri ve taşıyıcılar sarkoplazmik retikulum (SERCA2a) ya da fosfolamban'ın ve fosforilasyon) ^{2 +} ATPaz geleneksel katı değerlendirme için ölçülürKalp eksitasyon-kasılma (EC) bağlantının temel mekanizmaları yedik. Myofilament kasılma ve gevşeme fonksiyonel birimi ve Myofilament Ca ^{2 +} duyarlılığı myofibril performans uygulanmasında zorunlu ise zarı ve hücre içi Ca ^{+ 2} değişiklikler iki elektriksel aktivitesindeki AT kuplaj başlatma sinyalleridir. Bu çalışmanın odak noktası olmadıkça Bununla birlikte, az sayıda çalışma miyokardın fonksiyonel analiz içine Myofilament Ca ²⁺ duyarlılığını içermektedir. Burada, sarkomer kısalma / yeniden uzaması ve Fura-2 AM (oranlı metrik algılama) ve sıçan kalpleri kardiyak miyozitlerde Myofilament Ca ²⁺ duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek kullanarak hücre içi Ca ^{2 +} seviyesini ölçen bir protokol açıklar. Temel amacı Ca ²⁺ duyarlılık mekanik analiz için AK bağlantı dikkate alınması gerektiğini Myofilament vurgulamaktır. i kapsamlı bir soruşturmaöteleme ve terapötik değeri daha etkili stratejiler tasarlamak için değerli bilgiler sağlayacaktır sağlıklı ve hastalıklı kalplerde miyosit kontraktilite altında yatan kanalları, iyon taşıyıcılar, hücre içi Ca ^{2 +} taşıma ve Myofilament Ca ²⁺ hassasiyeti üzerinde.

Giriş

Kardiyak eksitasyon-kasılma (EC) bağlantı miyokard, yani kalbin ^1,2 kasılma fonksiyonu mekanik özelliklerini analiz etmek için temel düzenidir. AK bağlantı sarkolemmal iyon kanallarının faaliyetleri ikincil membran depolarizasyon tarafından başlatılan (örneğin, yama-kelepçe teknikleri ile ölçülebilir voltaj kapılı Na ⁺ kanal). (Nanomolar gelen nM sitozolik Ca ^{2 +} konsantrasyonunun artması ryanodin reseptörleri (RyRs) aracılığıyla voltaj bağımlı L-tipi sonraki aktivasyonu Ca ^{2 +} kanal LTCCs aracılığıyla ²⁺ akını Ca toplu tetikler (LTCCs) ve Ca ²⁺ açıklaması, ) (uM) se....

Protokol

protokol Sağlık BM Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uygundur (NIH Yayın No. 85-23, 1996 revize). Bu Seul Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (IACUC onayı No .: SNU-101213-1) tarafından onaylanmıştır.

1. Tampon Hazırlama (Tablo Malzemeleri ve Ekipmanları)

1. MM (deney gününde taze yalıtım çözeltisi 300 ml hazırlayın: NaCl, 135; KCI, 5.4; _MgCl2, 3.5; glukoz, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0.4, taurin, 20; pH 7.4 NaOH ile birlikte).
2. MM (deney gününde taze bir depolama solüsyonu 100 ml hazırlayın: Na....

Sonuçlar

LV miyositler normal ve hipertansif sıçan kalpleri izole edilmiştir. Alan uyarılmasına tepki olarak açık bir şeritlerin (sarkomer temsil eder) ve sabit kasılmalarla çubuk şekilli miyositler uygun miyositler olarak kabul edilir ve kayıt (Şekil 2A) için seçilir. F ŞEKIL 2A'da gösterilen örnekte, Fura 02:00 AG miyosit yatay konumlandırılmış ve miyosit kayıt alanı ve en az arka bölgenin en dahildir kaplayacak şekilde kameranın açıklık ayarlanır -yüklü. k.......

Tartışma

Burada, tek izole kardiyak miyosit içinde Myofilament Ca ²⁺ duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek için protokoller tanımlar ve bu elektrofizyolojik özellikleri yanında parametreyi, hücre içi Ca ^{2 +} transientler ve Myofilament dinamiklerini ölçmek önemini vurgulamaktadır. bir ya da parametrelerin iki kayıtları kalp kasılma ve gevşeme altında yatan mekanizmaları izah olmayabilir olmasıdır. Miyosit daralma ve hücre içi Ca2 ⁺ profil ayrı ayrı ¹ ölçmek geleneksel yöntemlerin aks.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sprague Dawley sıçan	Koatech		8-12 hafta
Pentobarbital Sodyum	Hanlim İlaç (Kore)	AHN901	Sigorta kodu:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glikoz	Sigma	G8270
CaCl2< / sub>	Biosesang	C2002
MgCl 2< / sub >	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4< / sub>	Sigma	M5921
Sodyum Piruvat	Sigma	P2256
Taurin	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Sığır Fetal Albümin	Sigma	A7906
Kollajenaz Tip 2	Worthington	LS004177
Proteaz	Sigma	P6911
Fura-2 ()	Moleküler Problar	F1221
Pluronic F127 DMSO	Invitrogen	P3000MP
Çalkalama Su Banyosu	Chang Shin Bilimsel	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Deneysel Oluşturucu	Miyositlerde EC Birleştirme Verilerinin Elde Edilmesi ve
Analizi Miyosit Kalsiyum & Kasılma Kayıt Sistemi	IonOptix Ltd
Sirkülasyonlu Su Banyosu	BS-Tech	BW2-8
Miyosit Floresan Mikroskobu	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Floresan & Video Algılama	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Floresan & Sistem Arayüzü	IonOptix	FSI700
Uyarma Işık Kaynağı	IonOptix	mSTEP
Yüksek yoğunluklu ARC Lambası Güç kaynağı	Cairn Araştırma Filtresi
tekerlek kontrolörü	IonOptix	GB/MUS200
Dijital Stimülatör	Tıbbi Sistemler Corpart	S-98 Mutimode
Deneysel Çözeltilerin Bileşimleri
İsim	güçlüŞirket	güçlüKatalog Numarası	Yorumlar
İzolasyon Çözeltisi (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Konsantrasyon (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Konsantrasyonu (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Konsantrasyonu (mmol) 5
Glikoz	Sigma	G8270	Konsantrasyonu (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Konsantrasyonu (mmol) 3.5
Taurin	Sigma	CB2742654	Konsantrasyonu (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Konsantrasyon (mmol) 0.4
Depolama Çözeltisi (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Konsantrasyon (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Konsantrasyon (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Konsantrasyon (mmol) 10
Glikoz	Sigma	G8270	Konsantrasyon (mmol) 5.5
CaCl < alt > 2 < / alt >	Biosesang	C2002	Konsantrasyon (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Konsantrasyon (mmol) 29
MgSO4< / sub	>Sigma	M5921	Konsantrasyon (mmol) 5
Sodyum Piruvat	Sigma	P2256	Konsantrasyon (mmol) 5
Taurin	Sigma	CB2742654	Konsantrasyon (mmol) 20
Perfüzyon Çözeltisi (Tiroz çözeltisi, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Konsantrasyon (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Konsantrasyon (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Konsantrasyon (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Konsantrasyonu (mmol) 10
Glikoz	Sigma	G8270	Konsantrasyonu (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Konsantrasyonu (mmol) 1.8          Fura 2AM yüklemesi için, CaCl2 konsantrasyonları 0.25 mM ve 0.5 mM
MgCl2< / sub>	Biosesang	M2001	Konsantrasyonu (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Konsantrasyonu (mmol) 14.5
Kollangenaz Solüsyonu 1
İzolasyon Solüsyonu (30mL)
Sığır Fetal Albümini (BSA solüsyonu 5 ml)			Konsantrasyon (mmol) 1.67 mg / mL
Kollajenaz Tip 2	Worthington	LS004177	Konsantrasyon (mmol) 1 mg / mL
Proteaz	Sigma	P6911	Konsantrasyon (mmol) 0.1 mg / mL
CaCl < sub > 2	Biosesang	C2002	Konsantrasyon (mmol) 0.05 mM
Kollangenaz Solüsyonu 2
İzolasyon Solüsyonu ( 20 mL)
Sığır Fetal Albümini (BSA çözeltisi 3.3 mL)			Konsantrasyon (mmol) 1.67 mg / mL
Kollajenaz Tip 2	Worthington	LS004177	Konsantrasyonu (mmol) 1 mg / mL
CaCl < alt > 2 < / alt >	Biosesang	C2002	Konsantrasyonu (mmol) 0.05 mM
BSA çözeltisi
İzolasyon Çözeltisi ( 40mL)
Sığır Fetal Albümin	Sigma	A7906	Konsantrasyonu (mmol) 400 mg
CaCl < alt > 2 < / alt >	Biosesang	C2002	Konsantrasyonu (mmol) 1mM

içinde% 20 çözelti