Abstract
Kalp yetmezliği ve kardiyak aritmi, dünya çapında mortalite ve morbidite nedenlerinin başında gelmektedir. Ancak, hastalıklı kalbinde patogenezi ve miyokard arıza mekanizması tam açıklığa kavuşturulması kalır. Son zorlayıcı kanıtlar Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikler kardiyak miyositler hücre içi Ca 2 + homeostazı ve iyon kanal faaliyetlerini etkileyen gösteriyor sağlıklı ve hastalıklı kalpleri kardiyak aksiyon potansiyeli ve daralma sorumlu temel mekanizmalar. Gerçekten de, (örneğin, Na +, Ca 2+ ve K + kanalları ve Na + -Ca 2+ değiştirici) ve hücre içi Ca 2 + taşıma proteinleri (örneğin., Ryanodin reseptörleri ve Ca kardiyak aksiyon potansiyelleri altında yatan iyon kanallarının faaliyetleri ve taşıyıcılar sarkoplazmik retikulum (SERCA2a) ya da fosfolamban'ın ve fosforilasyon) 2 + ATPaz geleneksel katı değerlendirme için ölçülürKalp eksitasyon-kasılma (EC) bağlantının temel mekanizmaları yedik. Myofilament kasılma ve gevşeme fonksiyonel birimi ve Myofilament Ca 2 + duyarlılığı myofibril performans uygulanmasında zorunlu ise zarı ve hücre içi Ca + 2 değişiklikler iki elektriksel aktivitesindeki AT kuplaj başlatma sinyalleridir. Bu çalışmanın odak noktası olmadıkça Bununla birlikte, az sayıda çalışma miyokardın fonksiyonel analiz içine Myofilament Ca 2+ duyarlılığını içermektedir. Burada, sarkomer kısalma / yeniden uzaması ve Fura-2 AM (oranlı metrik algılama) ve sıçan kalpleri kardiyak miyozitlerde Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek kullanarak hücre içi Ca 2 + seviyesini ölçen bir protokol açıklar. Temel amacı Ca 2+ duyarlılık mekanik analiz için AK bağlantı dikkate alınması gerektiğini Myofilament vurgulamaktır. i kapsamlı bir soruşturmaöteleme ve terapötik değeri daha etkili stratejiler tasarlamak için değerli bilgiler sağlayacaktır sağlıklı ve hastalıklı kalplerde miyosit kontraktilite altında yatan kanalları, iyon taşıyıcılar, hücre içi Ca 2 + taşıma ve Myofilament Ca 2+ hassasiyeti üzerinde.
Introduction
Kardiyak eksitasyon-kasılma (EC) bağlantı miyokard, yani kalbin 1,2 kasılma fonksiyonu mekanik özelliklerini analiz etmek için temel düzenidir. AK bağlantı sarkolemmal iyon kanallarının faaliyetleri ikincil membran depolarizasyon tarafından başlatılan (örneğin, yama-kelepçe teknikleri ile ölçülebilir voltaj kapılı Na + kanal). (Nanomolar gelen nM sitozolik Ca 2 + konsantrasyonunun artması ryanodin reseptörleri (RyRs) aracılığıyla voltaj bağımlı L-tipi sonraki aktivasyonu Ca 2 + kanal LTCCs aracılığıyla 2+ akını Ca toplu tetikler (LTCCs) ve Ca 2+ açıklaması, ) (uM) seviyesini mikromolar. Sitosolik Ca2 + böyle bir artış, ince filamanların troponin C (TNC) bağlanabilen Ca2 + teşvik eder ve ortaya çıkarır filament kompleks yapı değişiklikleri, aktin-miyosin etkileşimin kolaylaştırmak ve myocardi ulaşıral 3 daralma. Tersine, sitozolik Ca 2 + SR Ca 2 + -ATPase'ın ile sarkoplazmik retikulum (SR) (SERCA2a) geri re-Alınan veya Na + / Ca 2+ eşanjör ve plazmalemmal yoluyla miyosit dışarı ekstrüde edilir Ca + 2 ATPaz 1,2. Sonuç olarak, sitozolik Ca düşüş 2+ aktin-miyozin ve miyosit rahatlama 1-3 ayrışmasından kaynaklanan özgün durumuna ince filamentler yapısal değişiklikleri başlatır. Çoğu memeli kalp hücrelerinin 1 sitosolik Ca2 + kaldırılması% 90 - Bu şemada, SERCA2a aktivitesi, genel olarak 70 oluşturmaktadır miyokardiyal gevşeme hızını belirlemek için kabul edilir. Vb LTCC, RYR ve SERCA2a, böyle anormal Ca 2 + işleme gibi hastalıklı kalp 1-4 bozulmuş kontraktilite ve dinlenmek için birincil mekanizma olarak kabul edilmiştir.
2+ toplam hücre içi Ca yaklaşık% 1 EC bağlantı hesaplarında haberci ve Ca 2+ çoğunluğu olarak işlev hücre içi Ca 2 + tamponlar 5,6 bağlıdır serbest sitozolik Ca 2 +. Bu durum, çeşitli Ca 2 + tamponlar, SR, örneğin, membran fosfolipidleri, ATP, fosfokreatin, kalmodulin, parvalbumin, myofibril TNC miyosin, SERCA2a ve calsequestrin kardiyak miyositlerde bol olduğu gerçeğidir. 5,6,7. Aralarında, SERCA2a ve TNC baskın Ca2 + tamponlar 5,6,7 vardır. Ayrıca, Ca 2 + onun tamponlar bağlanmasını seğirme sırasında dinamik bir süreçtir ve ek nedeni bağlayıcı Ca değişikliği 2+ (örneğin, 2+ Ca% 30-50 2+ transientler 7 TNC bağlanır ve Ca sırasında ondan ayırmak) kons 2+ hücre içi Ca değişiklikler de, sitoplazmada serbest Ca 2 + sonuçlarını "serbest"entration. Sonuç olarak, hücre içi Ca 2 + düzeyinin pertürbasyon kasılma disfonksiyonu ve aritmi 8,9 öncüleri olan anormal Myofilament hareketleri, neden olur. (Fizyolojik ve patolojik hem de) pek çok faktör Myofilament Ca 2 + tamponlama ve Myofilament Ca 2+ duyarlılığını 8-10 etkileyen Myofilament proteinlerin post-transkripsiyonel modifikasyonları, kaynakları olabilir. Son zamanlarda, bu Ca 2 + transientler, anormal Ca 2 + bırakma ve aritmiler 8 duraklamaya bağlı güçlendirilmesini tetikleme, Myofilament proteinleri mutasyonlar Ca 2 + bağlayıcı afinite ve hücre içi Ca2 + taşıma artış olduğu bildirilmiştir. Bu anlayış doğrultusunda, biz de yüksek sistolik ve diyastolik Ca 2 + düzeyleri ile ilişkili nöronal nitrik oksit sentaz up-regülasyonu sekonder hipertansif sıçan kalplerinde o Myofilament Ca 2 + duyarsızlaştırma göstermiştirSırayla, Ca 2 + bağımlı inaktivasyon 12 LTCC açığı artırmaktadır 11. Bu nedenle, Myofilament Ca 2+ duyarlılığı hücre içi Ca2 + homeostasis ve miyosit kasılma fonksiyonu bir "aktif" düzenleyicisidir. Bu Myofilament ve Ca arasındaki etkileşimleri analiz etmek için gerekli hale gelmiştir 2+ miyosit AK kavraması ve kalp fonksiyonlarının ayrıntılı bir araştırma için proteinleri ele.
Burada, izole kardiyak miyositlerdeki Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri değerlendiren bir protokol açıklar. Hücre içi Ca 2 + profilinin kapsamlı bir analiz, Myofilament Ca 2+ duyarlılık ve daralma yeni mekanizmaları altında yatan miyokard mekaniği ortaya çıkarmak olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokol Sağlık BM Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uygundur (NIH Yayın No. 85-23, 1996 revize). Bu Seul Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (IACUC onayı No .: SNU-101213-1) tarafından onaylanmıştır.
1. Tampon Hazırlama (Tablo Malzemeleri ve Ekipmanları)
- MM (deney gününde taze yalıtım çözeltisi 300 ml hazırlayın: NaCl, 135; KCI, 5.4; MgCl2, 3.5; glukoz, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0.4, taurin, 20; pH 7.4 NaOH ile birlikte).
- MM (deney gününde taze bir depolama solüsyonu 100 ml hazırlayın: NaCI 120; KCI 5,4; MgSO 4 5'tir; CaCl2 0.2; sodyum piruvat 5'tir; 5.5 glikoz, taurin 20, HEPES 10, manitol 29, pH 7.4 ) NaOH ile.
- MM perfüzyon çözeltisi 1L (hazırlayın: NaCl, 141.4; KCI, 4; NaH 2 PO 4, 0.33; MGCL2, 1 'dir; HEPES, 10; glukoz, 5.5; CaCl2, 1.8; manitol, 14.5; NaOH ile pH 7.4).
- Izolasyon 25 ml kollajenaz (1 mg / ml), proteaz (0.1 mg / ml), sığır serum albümini (BSA, 1.67mg / ml) ve Ca 2 + (0.05 mM) ilave edilerek kolajenaz çözeltisi 30 ml 1 Hazırlama çözüm.
- Yalıtım çözeltisi 16.7 ml (1 mg / ml), BSA (1.67 mg / ml) ve Ca + 2 (0.05 mM) kolajenaz ekleyerek kolajenaz çözeltisi 2 20 ml hazırlayın.
- yalıtım çözeltisi 40 ml BSA 0.4 g eklenerek BSA çözeltisi 40 ml hazırlayın. 10 ml ve iki bardak içine 30 ml ayrı. : Ca BSA çözeltisi 2 + 30 ml ilave edilir, böylece BSA çözeltisi nihai Ca2 + konsantrasyon 1 mM'dir.
Sol Ventriküler (LV) miyositler İzolasyonunda 2. Hazırlık
- hazırlanması ve izolasyon odasına hayvan tesis temiz ulaşım kafeslerde 8-12 haftalık, erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanları aktarın.
- H37 o C iki su banyoları yemek
Not: Su için bir su banyosu kullanın - ceketli rezervuar ve Langendorff perfüzyon sistemi perfüzyon tüpleri. Tek miyositleri ayırmak amacıyla miyokard doku gövdelerine kışkırtmak diğer su banyosu kullanın. - Sırasıyla, 30 ml ve 20 ml hacim yapmak için 5 ml ve kolajenaz çözeltisi 1 ve 16.7 ml kolagenaz çözeltisi 2 25 ml (yaklaşık olmayan 2+) BSA çözeltisi 3.3 ml.
- Langendorff perfüzyon sistemine sırasıyla (Şekil 1A) izolasyon çözeltisi (100 mi) ve sütun 1 (Col 1) ile sütun 2 kolajenaz çözeltisi 1 (30 mi) (Col 2) ekleyin.
- Langendorff perfüzyon sistemine (Şekil 1A) oksijen birleştirme borusu yoluyla, Sütun 1 ve Col.2 yalıtım solüsyonu ve kolajenaz çözeltisi 1 oksijen. Benzer şekilde, oxygenate kollajenaz çözüm 2 ve üzeri% 100 O 2 ile sallayarak su banyosunda BSA çözeltisiOksijen bağlantı borusu.
LV miyosit 3. İzolasyon
- Pentobarbital sodyum (30 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile SD sıçan anestezisi ve kıstırma ayak ve çekme yansıma eksikliği anestezi durumunu teyit.
- Bir diseksiyon tepsisine sıçan taşıyın. yatar pozisyonda, bant ile vücudun kenarlarına dört ayağı sabitleyin.
- kalbi zarar vermemeye sağlanması, göğüs açmak için cerrahi makas ile göğüs orta eksenel kesiler uygulayın. Bağlantı gemiler (örneğin, üst ve alt vena kava, pulmoner damarları ve aort) ve perikardiyal zarından 13 den kalbi incelemek için temiz makas başka bir çift kullanın.
- Yeterli uzunlukta aort bir kısmını bırakın (5-8 mm), ince forseps ile aort kelepçe ve hızla 1 dakika (Şekil 1A) içinde Langendorff perfüzyon sistemi kanül monte edin. aorta üzerinde sıkıca dikiş ipliği 4/0 kravat.
- Aorta keserek sindirilmiş kalbi ayırın ve taze izolasyon solüsyonu (Şekil 1Bi) içeren balona forseps ile aort tutarak aktarın. Daha küçük parçalara (~ 22 mm, Şekil 1Bii) içine (septum dahil) LV serbest duvar en kesmek için ince makas ve forseps kullanın.
- Önceden ısıtılmış ve oksijenli taze kolajenaz çözeltisi 2 (Şekil 1Biii) ihtiva eden bir şişe içine parçaları aktarın. 10 dakika süre ile çalkalanır. miyosit içeren kollajenaz çözüm 2 oksijen teslim tutun.
- (BSA çözeltisi içeren - 2+ bir emme ampul ile damlatıcıları kullanarak 10 ml santrifüj tüpüne süspansiyon ve Ca ekleyin - miyosit TaşıHacim olarak 1: 1). 2 dakika süreyle 30 g Santrifüj ve süpernatant atın. BSA çözeltisi 5 ml miyosit pelet yeniden askıya. Santrifüj süpernatantı atmak ve.
- Miyosit pelet dağılması ve oda sıcaklığında (Şekil 1Biv-VI) önceden oksijenli bir depolama solüsyonu 10 ml miyositleri tutun.
- şişede kalan LV dokusu ile - prosedürleri (3.9 3.7 adımlar) tekrarlayın.
LV dokusunun çoğu miyositler iyi bir verim elde etmek için kaybolana kadar tekrar - (3.9 3.7 adımlar) prosedürleri tekrarlayarak tutun: Not. - Deneylerin sonuna kadar oda sıcaklığında 6-8 saat süreyle depolama çözümü myositler tutun.
Hücre içi Ca 2 Geçici ve miyosit daralma 4. Eşzamanlı Ölçümleri
- asetoksimetilester Fura-2 AM (2 mcM) ile yük LV miyositler.
Not: Karanlık bir tüp (Şekil 1Bvii) yüklenen miyositler tüm yükleme prosedürleri ve deney gerçekleştirin.- centr10 saniye boyunca 2000 x g'de miyosit süspansiyonu (1 mi) ifuge. Süpernatantı atın ve düşük Ca 2 + konsantrasyonu (250 uM, Masa Malzemeleri ve Ekipmanları) ile Tyrode çözeltisi 1 ml miyosit pelet yeniden askıya.
- Yavaşça miyosit süspansiyon, dispers, Fura-2AM ve poloksamer 407 (2 ul) ekleyin ve oda sıcaklığında karışımın tutulması - 15 dakika boyunca (20 ila 24 ° C) (Şekil 1Bvii).
- Santrifüj Karışım 5 saniye için, yüzer tabaka atılır ve 500 uM Ca2 + içeren perfüzyon çözeltisi 1 ml miyosit pelet dağılır. 10 dakika sonra, 5 saniye için karışım santrifüj ve supernatant atın.
- Taze perfüzyon çözeltisi (500 uM Ca2 +, 1 mi) ilave edilir ve, Fura-2AM tutulması - kayıtları için bu çözeltiye yüklenen miyosit pelet.
- LV miyosit kasılması ve hücre içi Ca ölçümü 2 +
- kaydetmeden önce, bir geçiyor perfüzyon tüpü doldurmakbir Tyrode çözeltisi ile su gömleği 36 o C önceden ısıtılmış
- 8 dakika - 5 için ters bir floresan mikroskop odasının yüklenen LV miyosit süspansiyon - Bir Fura 2 AM birkaç damla koyun. Yavaş yavaş Tyrode çözeltisi (2.2 mL / dakika) serpmek.
- alan stimülasyonu (2 Hz) başlatmak için dijital stimülatörü ön panelinde bulunan "start" düğmesine basın.
Not: çıkış gerilimini (10 V, 5 msn süre) bölmenin her iki yanında yer alan platin teller üzerinden bölme miyosit uygulanır.- stabil olduğu sözleşme Seç miyositler kayıt (hiper veya hipo-daralma göstererek olmayanlar).
- video tabanlı sarkomer algılama sisteminin yatay pozisyonda seçim miyosit ayarlayın ve sarkomer optimum görüntü elde etmek için mikroskop odağı ayarlayın. net sarkomer açıkça ortalamanın kadar gözlenir hangi alanda mor dikdörtgen kutu yerleştirinsarkomer uzunlukları (kırmızı tepe) bir tekil sivri bir tepe (Şekil 2A, alt resim) gösterir.
- Alan stimülasyonu (Şekil 2A ve B) cevaben sarkomer uzunluğunun değişiklikleri kaydedin.
Not: 1 içinde yüklü miyositleri kullanın - 2 saat. - Video tabanlı sarkomer algılama sistemine alan miyosit (Şekil 2A) boyutu böylece kameranın diyafram ayarlayın. 510 nm (satın alma frekansı 1000 Hz) 360 nm / 380 nm eksitasyon ve emisyon ile miyosit uyarır. Tutanak sarkomer kısalma ve alan uyarımı (Şekil 2B) ile Fura2 AM oranı.
Myofilament Ca 2+ Hassasiyet 5. Değerlendirme
- Ölçülen değer ile hem (- (20 izleri 10) ve aynı miyosit ve sarkomer uzunluğu vs Fura-2 oranı faz-düzlem döngü arsa sarkomer uzunlukları ve kararlı durumda 2 + transientler Ca ortalamas ve delta değişiklikleri; Şekil 2C).
- Her arsa,% 50 rahatlama de Fura -2 oranı (EC 50, Şekil 2C) tanımlar. Döngü ve her müdahale EC 50 hem karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LV miyositler normal ve hipertansif sıçan kalpleri izole edilmiştir. Alan uyarılmasına tepki olarak açık bir şeritlerin (sarkomer temsil eder) ve sabit kasılmalarla çubuk şekilli miyositler uygun miyositler olarak kabul edilir ve kayıt (Şekil 2A) için seçilir. F ŞEKIL 2A'da gösterilen örnekte, Fura 02:00 AG miyosit yatay konumlandırılmış ve miyosit kayıt alanı ve en az arka bölgenin en dahildir kaplayacak şekilde kameranın açıklık ayarlanır -yüklü. kayıt alanında, (kayıt programı aracılığıyla) tıklayıp bilgisayar ekranında bu kutuyu sürükleyerek mor kutunun boyutlarını ayarlayın. Ortalama sarkomer uzunluğu bir sivri kırmızı tepe gösterdiğinde, (Şekil 2A, alt resim) kaydetmeye başlayın.
Sarkomer boyu ve hücre içi Ca2 + transie Hem NTS (Fura-2 oranları) aynı miyositler (Şekil 3A) aynı anda kaydedilir. Sarkomer uzunluğu ve Ca 2+ geçici ortalama izleri Şekil 3B gösterilmiştir. Bireysel, diyastolik / sistolik sarkomer uzunlukları, zamanı (PT) zirve ve sarkomer kısalma genliği ve miyosit kasılma dinamiğini incelemek için ölçülür. % 50 gevşeme (TR 50) Zaman miyosit gevşemesine değerlendirmek için analiz edilir. Benzer şekilde, diyastolik ve sistolik Fura-2 oranı (Ca 2 + transientler), zaman Ca2 + geçici ve Ca zaman sabiti 2+ geçici çürüme (tau) ve miyosit kasılma ve gevşeme (Tablo değerlendirmek için analiz edilir (PT) zirve 1). Bu örnekte, Ca 2 + transientler genlikleri orta hipertansif sıçan LV miyositler artmıştır ve daralma orta (Şekil 3B ve Tablo 1) azalır.
içerik "fo: keep-together.within sayfa =" 1 "> Ayrıca, Fura arasındaki ilişkiler - 2 oranı ve sarkomer uzunluğu (LV miyosit Myofilament Ca 2+ duyarlılığını gösteren) hem sahte ve hipertansif sıçanlarda çizilir ( . - Şekil 3C) Fura 2 miyosit gevşeme aşamasında sarkomer uzunluğu yörünge sitozol Ca 2+, Myofilament Ca 2 + bağlayıcı ve sarkomer uzunluğu 14 bir yarı-denge tanımlar, bu nedenle gevşeme fazı arasında iki karşılaştırılır grupları. hipertansif gruptan miyositlerde yörüngenin sağa kayma Ca2 + (Şekil 3C) karşı azalmış Myofilament tepki gösterir. Bu duruma göre, hücre içi Ca2 + konsantrasyonu artar yarım gevşeme (EC50) için gerekli olan (Şekil 3C) , hipertansiyon Myofilament Ca 2 + -desensitization atıfta.Sıçan kalp LV miyositleri izole etmek için 1. Prosedürler rakam. (A) aort yoluyla kanüle kalbine izolasyon çözümü serpmek için kullanılan Langendorff perfüzyon sistemi (içerlek, perfüzyon sistemine monte kalp büyütülmüş görüntüsü) (B) i - iii. Kollajenaz çözüm 1 ile sindirim sonra kalp ve kabı ve kap içinde AG doku parçalara (B) IV - VI.:. miyosit süspansiyon, depolama çözelti içinde kolajenaz çözeltisi 2, santrifüj işleminden sonra miyosit pelet ve yeniden süspansiyon haline miyosit pelet ilave edildikten sonra (B) VII: Kuluçka, LV inkübe Fura 2 am içinde miyositler - içeren izolasyon çözüm (2 uM Fura 02:00, 250 uM Ca 2 + 2 ul poloksamer 407 ile); washout, 500 uM Ca 2+ ile izolasyon çözümü ile LV miyositleri yıkayın; depolama, Fura-2 AM tutmak - yüklü AG miyositleri içinde500 mcM Ca 2 + içeren taze izolasyon çözüm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sarkomer kısalma ve Fura-2 oranı (hücre içi Ca 2 + düzeyinin göstergesidir) Şekil 2. ölçülmesi. (A) sarkomerinde şeması, bir Fura-2 -yüklü LV miyosit bir görüntü ve ortalama sarkomer uzunluğu (kırmızı tepe) bilgisayarda görüntülenir. Alt panelde, siyah çizgi ilgi mor bölgesi içinde her yatay piksel hattı ortalamasıdır. mavi çizgi her bir ucunda sıfırlanmıştır aynı verilerdir. kırmızı çizgi FFT hesaplamıştır sinyal sayısını temsil Hızlı Fourier dönüşümü (FFT) güç spektrumu vardır. Bir keskin peak temiz sarkomer kayıt anlamına gelir. (B) sarkomer uzunluğu ve alan stimülasyonu (2 Hz) yanıt olarak Fura -2 oranının Eşzamanlı kayıtları. Aynı LV sarkomer uzunluğu vs Fura 2 oranında (C) Faz-düzlem arsa miyosit (bu parametrelerin gerçek uzunluğu hem / Fura 2 oranı ve delta değişiklikleri incelendiğinde unutmayın). AK 50 (% 50 gevşeme de Fura 2 oranı, okla gösterilen daire) gruplar arasında Myofilament Ca 2+ duyarlılık niteliksel bir fark var. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil sham ve hipertansif sıçanlarda LV miyosit daralma analizi 3. Temsilcisi sonuçları. (A) sarkomer s Ham izlerihortening ve Fura - plasebo ve hipertansif sıçanların LV miyositlerde 2 oranı ölçümü (B) sarkomer uzunluğu ve Fura ortalama izleri -. 2 sinyaller. Iki grupta - 2 sarkomer uzunluğu genel oranı (bu parametrelerin 2 oranı ve delta değişiklikler hem gerçek uzunluğu ve Fura -) ortalama izleri analiz parametreler Tablo l'de Fura 1. (C), faz-düzlemi grafikleri gösterilmektedir . Yörünge döngü sağa kaydırılır ve AK 50 Myofilament Ca 2 + duyarsızlaştırma düşündüren, hipertansiyon daha yüksek olma eğilimindedir. PT, zaman (sn) tepe; % 50 gevşeme (sn) zaman: .tr 50 - Tau, Ca 2 + geçici çürüme (sn) zaman sabiti (bir üstel fonksiyonu ile 2 oranında Fura düşüş safhasını takarak elde edilir). 
Büyük halini görmek için buraya tıklayınızbu rakamın.
| parametreler | sahte | Hipertansiyon | |
| Hücre içi Ca 2 + | Diastolik Ca 2+ | 1,189 | 1,124 |
| Sistolik Ca 2+ | 1.71 | 1,691 | |
| Genlik (Δ oranı) | 0,521 | 0.567 | |
| zirveye zamanı (PT, s) | 0.021 | 0.031 | |
| Tau (ler) | 0.079 | 0.076 | |
| sarkomer | diastolik | 1,758 | 1.78 |
| sarkomer uzunluğu (mm) | |||
| sarkomer | 0.122 | 0.115 | |
| Kısaltmak (16; uzunluk, aa) | |||
| zirveye zamanı (PT, s) | 0.064 | 0.055 | |
| % 50 Zaman | 0.032 | 0.03 | |
| Gevşeme (TR 50, s) | |||
| EC50 | [Ca2 +],% 50 sarkomer relengthening i (Fura-2 oran) | 0,2382 | 0,3224 |
Fura Tablo 1. Analiz - 2 oranı (hücre içi Ca2 +) ve sarkomer uzunluğu ölçümleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, tek izole kardiyak miyosit içinde Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek için protokoller tanımlar ve bu elektrofizyolojik özellikleri yanında parametreyi, hücre içi Ca 2 + transientler ve Myofilament dinamiklerini ölçmek önemini vurgulamaktadır. bir ya da parametrelerin iki kayıtları kalp kasılma ve gevşeme altında yatan mekanizmaları izah olmayabilir olmasıdır. Miyosit daralma ve hücre içi Ca2 + profil ayrı ayrı 1 ölçmek geleneksel yöntemlerin aksine, mevcut yöntem aynı anda aynı kardiyak miyositler iki parametre incelenmektedir.
Pek çok sayıda yöntem, genel olarak kas veya miyositler 15,16,17, örneğin, cidarlı miyositlerde eksojen Ca arasındaki etkileşimlerin incelenmesi + 2 ve sarkomerinde / hücre uzunluğu / gerginlik Myofilament Ca 2 + duyarlılığını değerlendirmek için kullanılır(Örneğin membran geçirgenliği saponin veya β-esin olarak deterjanlar ile tedavi). Uzunluklar kuvvet dönüştürücüler veya karbon elyafı) ile foto-diyot ve lazer ışını kırınım teknikleri ve gerilim ölçülür. Onlar Myofilament Ca 2+ duyarlılık nicel değerlendirmeler olanak çünkü bu teknikler yaygın kas çalışmalarında kullanılmaktadır. Ancak, plazma zarı ve hücre içi Ca2 + kullanım endojen iyon kanal aktiviteleri, bu Myofilament mekaniği başlatmak için gerekli olan, bu tekniklerde ihmal edilmiştir. Buna ek olarak, çalışma kapsamında kas şeritleri ya miyositler önceden gerilmiş belirli diyastolik uzunluğa, ve bu şartlar altında, ilk sarkomer uzunluğu (özellikle hastalık koşullarında ve uygulamalarla) miyositler gerçek diyastolik uzunluğundan farklı olabilir. Bu kapsamlı değerlendirmeleri mevcuttur sağlayan hücre organelleri ve böylece nispeten soğukkanlı olmaya devam akım ölçümü avantajı vurgulamaktadırmiyosit kontraktil fonksiyonun yapımı.
Anlaşılır, miyositler (Ca 2 + -tolerating) ve Fura optimal yükleme kalitesi - 02:00 Myofilament Ca 2+ duyarlılık başarılı değerlendirilmesi için iki temel unsuru vardır. (Daha önce tarif edildiği gibi 18,19,20, toplam hücre% 60-80) Bu duruma göre, çeşitli modifikasyonlar uygulanabilir çubuk şekilli miyositleri elde etmek için protokol uygulanır. İlk olarak, Ca2 +, düşük bir dozda, sindirim işlemleri (örneğin, Ca2 + konsantrasyonu kolajenaz Çözeltilerin 50 uM ve depolama çözelti içinde 200 mm olan) içinde çözeltiler ilave edilir. İkinci olarak, sindirim sırasında BSA membran stabilitesini artırmak için kolajenaz çözeltilerine ilave edilir. Üçüncü olarak, çözümlerin çoğu fonksiyonel miyositlerin yüzdesi ve deneyler süresini (6-8 saat) geliştirir izolasyon sırasında oksijenli edilir. Dördüncü olarak, izole miyositler depolama çözümü c tutuluriçeren gruptur 200 uM Ca 2 +.
Fura 2 am optimal yükleme elde etmek için, iki farklı Ca2 + konsantrasyonu (250 ve 500 uM) kullanılmıştır ve poloksamer 407 (2 ul,% 20 dimetil sülfoksid içinde hazırlanır) zarından, Fura-2AM geçirgenliğini arttırmak için eklenir ve miyositlerde stabilitesi. Tüm Ca 2 + göstergesi boyalar Ca + 2 tamponları 21 olduğu not edilmelidir. Bu nedenle, araştırmacılar aşırı tamponlama ve azaltılmış miyosit kasılma önlemek için Fura-2 AM yüksek bir konsantrasyon veya daha uzun bir inkübasyon kullanmaktan kaçınmalısınız. 2 yükleme rutin miyosit kalitesini ve yükleme durumunu tahmin etmek için önemli bir adımdır, hangi kontrol edilir - Fura olmadan miyosit daralma tavsiye edilir. Yükleme değişkenlik kaçınılmazdır. Nedenle, odasında miyositleri yakalanma sayısının öncesi ve benzer olup olmadığı, özellikle, miyosit kasılma değişkenliği kontrol etmek önemlidirFrangoulis yükleniyor. onlar miyositler ortalama durumunu temsil etmemektedir ve önyargılı sonuçları ve değerlendirmeler neden olabilir, çünkü hiper veya hipo-sözleşme miyositler analizi kaçınılmalıdır.
Fura 2 oranında ölçülen değişikliklere, hücre içi Ca2 + seviyesi yansımaları yerine Ca 2 gerçek kimyasal konsantrasyonu olduğuna dikkat edilmelidir. Bu nedenle, burada tarif edilen yöntem Myofilament Ca 2 + duyarlılık gibi niteliksel değişiklikleri de yerine Ca 2 myofilaments gerçek hassasiyetini değerlendirir. Fura kalibrasyonu - hücre içi Ca2 + konsantrasyonu 2 sinyal bireysel miyositlerde güvenilir Ca 2 + konsantrasyonları elde etmek çözümdür. 2 AM (Ca, 0 ila 39 uM arasında değişen 2 + konsantrasyon), ve elde edilen Fura - - Kalibrasyon prosedürü Ca konsantrasyonları ile yükleme miyositleri gerektirir 2+ Fura konjüge edilmiş 2 oranları th hesaplanıre Aşağıdaki formül: [Ca2 +] i = Kd * (R - Rmin) / (Rmax - R) * F380max / F380min 21. Tür bir kalibrasyon prosedürü ile Ca + 2 konsantrasyonlarında toplanmış ortalama değerlerinin hesaplanması mümkündür. Ca 2+ göstergelerin yükleme tek bir hücre içinde yapılmaz miyositler ve kalibrasyon arasında değişken olduğundan, ancak, Ca 2 + konsantrasyonları doğru kazanılmış olabilir. F360 / F380 (bu çalışmada olduğu gibi) F340 / F380 yerine ölçülmüş ise (F360 Fura-2 floresan 22 isobestic dalga boyu olduğu için) Dahası, Fura 2 oranı daha az doğrudur. Bununla birlikte, yine de, özellikle myofilaments eş zamanlı hücre ortamında değişikliklerden sonra değiştirilebilir hastalıklı insan kupa, fizyolojik deneylerde Myofilament Ca 2 + duyarlılık gibi niteliksel değişiklikleri değerlendirmek için geçerli bir yöntemdir. (Bu yöntem, alternatif yöntemlerle birleştirilir önerilir şekilde detam Ca 2+ için myofilaments gerçek duyarlılığını analiz etmek) Tartışma bölümünde daha önce tarif.
miyosit daralma çalışmada yöntemin diğer sınırlama yüksüz bir durumdur. Bu hafife veya Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri tahmin edebilir. Bu nedenle, doğru Myofilament Ca 2+ duyarlılığını değerlendirmek, analiz nitel ve nicel hem de değerlendirme için alternatif ölçümlerle yapılmalıdır.
teknik, insan kardiyak hücresel redoks ortamı ve transkripsiyon sonrası modifikasyonlar değiştirilir örnekleri, Myofilament fonksiyonları birlikte değişiklikler ile sonuçlanır dahil olmak üzere sağlıklı ve hastalıklı kupa, miyokard fonksiyonunu tahmin etmek için de geçerlidir. Özellikle, iyon kanalları, hücre içi iyon homeostazisi ve myofilaments düzenleyici proteinler interaktif; Bu nedenle, tüm bu bileşenler Concer işlev(ekokardiyografi ölçüldüğünde, örneğin) t, in vivo olarak, kalp performansını belirlemek için.
Sonuç olarak, Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır ve miyosit fonksiyonunun tam profilini elde etmek için kalp elektrofizyoloji ile birlikte, hücre içi Ca 2 + taşıma ve miyosit daralma bu parametreyi analiz önemini vurgulamaktadır. Myofilament Ca 2+ duyarlılığı hastalıklı kalp modellerini, bu parametrelerdeki değişimler yanı sıra çeşitli hücre içi sinyal yolları birbiriyle kullanarak mekanik çalışmalar rutin ölçülmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu araştırma Eğitim, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (2013068067) tarafından finanse Kore Ulusal Araştırma Vakfı (ÇKS) ile Temel Bilimler Araştırma Programı tarafından desteklenen; Eğitim, Bilim ve Teknoloji, Seul Ulusal Üniversitesi Hastanesi, Hipertansiyon Kore Derneği'nin (2013), SK Telecom Araştırma Fonu Kore Bakanlığı Beyin Kore 21 Yüksek Lisans Programı tarafından (no. 3420130290) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC 31460265; NSFC 81260035).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
References
- Bers, D. M., et al.
- Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
- Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
- Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
- Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
- Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
- Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
- Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
- Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
- Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336 (2013).
- Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
- Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
- Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
- Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
- Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
- Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
- Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
- Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
- Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
