Abstract
Hjertesvikt og hjerterytmeforstyrrelser er de viktigste årsakene til dødelighet og sykelighet på verdensbasis. Imidlertid fortsatt mekanismen for patogenesen og hjerteinfarkt feil i den syke hjerte til å bli avklart. Nyere overbevisende bevis viser at endringer i myofilament Ca 2+ følsomhet påvirke intracellulær Ca 2+ Homeostase og ionekanal aktiviteter i hjertemuskelceller, de grunnleggende mekanismene som er ansvarlig for hjertets aksjonspotensial og sammentrekning hos friske og syke hjerter. Faktisk aktiviteter ionekanaler og transportører underliggende hjerteaksjonspotensialer (f.eks Na +, Ca 2+ og K + -kanaler og Na + -CA 2+ leren) og intracellulære Ca 2+ håndtering proteiner (f.eks., Ryanodine reseptorer og Ca 2+ -ATPase i sarkoplasmatisk retikulum (SERCA2a) eller phospholamban og dens fosforylering) blir vanligvis målt til å evaluspiste de grunnleggende mekanismene for hjerte eksitasjon-kontraksjon (EF) kobling. Både elektriske aktiviteter i membranen og intracellulære Ca 2+ endringene er trigger signaler om EF kopling, mens myofilament er funksjonell enhet av sammentrekning og avslapping, og myofilament Ca 2+ følsomhet er viktig i gjennomføringen av myofibril ytelse. Likevel er det få studier innlemme myofilament Ca 2+ følsomhet til funksjonell analyse av hjertemuskelen med mindre det er fokus for studien. Her beskriver vi en protokoll som måler sarcomere forkortelse / re-forlengelse og den intracellulære Ca 2+ nivå ved hjelp av Fura-2 AM (ratiometrisk deteksjon) og vurdere endringer av myofilament Ca 2+ følsomhet i hjertemuskelceller fra rottehjerter. Hovedmålet er å understreke at myofilament Ca 2+ følsomhet bør tas hensyn til i EF kopling for mekanistisk analyse. Omfattende etterforskning av ipå kanaler, ion transportører, intracellulær Ca 2+ håndtering og myofilament Ca 2+ følsomhet som ligger til grunn myocyte kontraktilitet hos friske og syke hjerter vil gi verdifull informasjon for å designe mer effektive strategier for translasjonsforskning og terapeutisk verdi.
Introduction
Cardiac eksitasjon-kontraksjon (EC) kobling er den grunnleggende skjema for analyse av mekaniske egenskapene til hjertemuskelen, dvs. den kontraktile funksjon av hjertet 1,2. EF kopling er initiert av membran depolarisering sekundært til aktiviteter sarcolemmal ionekanaler (f.eks spenningsstyrte Na + kanal, som kan måles via patch-clamp teknikker). Påfølgende aktivering av de spenningsstyrte L-type Ca 2+ kanaler (LTCCs) og Ca 2+ tilstrømningen via LTCCs utløse parten av Ca 2+ frigjøring gjennom ryanodine reseptorer (RyRs), øker cytosoliske Ca 2+ konsentrasjon fra nanomolar (nM ) mikromolar (uM) nivå. En slik økning i cytosol-Ca 2+ fremmer Ca 2 + binding til troponin C (TNC) i tynne filamenter og utløser konformasjonsendringer av filamentet komplekset for å lette den aktin-myosin interaksjon og oppnår myocardial sammentrekning tre. Omvendt, cytosoliske Ca 2+ gjen uptaken tilbake inn i det sarkoplasmatiske retikulum (ER) via Ca2 + -ATPase i SR (SERCA2a) eller ekstruderes ut av muskelceller via Na + / Ca2 + veksleren og den plasmalemmal Ca 2+ ATPase 1,2. Følgelig nedgangen i cytosolisk Ca2 + setter i gang konformasjonsendringer av tynne filamenter tilbake til den opprinnelige tilstand, noe som resulterer i dissosiasjonen av aktin-myosin og myocyte avslapping 1-3. I denne ordningen, er aktiviteten til SERCA2a generelt ansett for å bestemme hastigheten av hjerteinfarkt avslapping fordi den står for 70-90% av cytosoliske Ca 2+ fjerning i de fleste pattedyr hjertet celler 1. Som sådan, unormal Ca 2+ håndtering av LTCC, RyR og SERCA2a, etc. har blitt ansett som den viktigste mekanismer for svekket kontraktilitet og avslapning i den syke hjertet 1-4.
2+ som fungerer som budbringer i EF koblings står for rundt 1% av total intracellulær Ca 2+ og flertallet av Ca 2+ er bundet til intracellulære Ca 2 + buffere 5,6. Dette skyldes det faktum at ulike Ca 2 + buffere er rikelig i hjertemuskelceller, for eksempel membran fosfolipider, ATP, phosphocreatine, calmodulin, parvalbumin, myofibril TNC, myosin, SERCA2a, og calsequestrin i SR. 5,6,7. Blant dem, SERCA2a og TNC er de dominerende Ca 2 + buffere 5,6,7. Videre Ca 2+ binding til sine buffere er en dynamisk prosess i rykk (f.eks 30-50% av Ca 2+ binder seg til TNC og distansere seg fra den i løpet Ca 2 + transienter 7) og endring i Ca 2+ bindende årsaken ekstra "release" av fri Ca2 + til cytosol, resulterer i forandringer av intracellulær Ca 2 + konsentration. Følgelig forstyrrelse av den intracellulære Ca 2+ nivå induserer unormale myofilament bevegelser, som er forløperne til kontraktile dysfunksjon og arytmier 8,9. Mange faktorer (både fysiologiske og patologiske) kan være kilder til post-transcriptional modifikasjoner av myofilament proteiner, som påvirker myofilament Ca 2+ buffering og myofilament Ca 2+ følsomhet 8-10. Nylig ble det rapportert at mutasjoner i myofilament proteiner øke Ca 2+ bindende affinitet og intracellulær Ca 2+ håndtering, utløser pause avhengig forsterkning av Ca 2+ transienter, unormal Ca 2+ utslipp og arytmier 8. I tråd med dette konseptet, har vi også vist at myofilament Ca 2 + reduksjon av følsomhet hos hypertensive rottehjerter sekundære til den opp-regulering av nevronal nitrogenoksid syntase er assosiert med forhøyet diastolisk og systolisk Ca 2+ nivåer11, som i sin tur øker sårbarheten i LTCC til Ca 2+ -avhengige inaktive 12. Derfor er myofilament Ca2 + følsomhet en "aktiv" regulator av intracellulær Ca2 + homeostase og myocyte kontraktile funksjon. Det har blitt nødvendig å analysere samspillet mellom myofilament og Ca 2+ håndtering proteiner for grundig undersøkelse av myocyte EF kopling og hjertefunksjon.
Her beskriver vi en protokoll som vurderer endringer av myofilament Ca 2+ følsomhet i isolerte hjertemuskelceller. Omfattende analyse av intracellulær Ca 2+ profil, vil myofilament Ca 2+ følsomhet og sammentrekning grave opp nye mekanismer underliggende hjerteinfarkt mekanikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr publisert av FNs National Institutes of Health (NIH publikasjon nr 85-23, revidert 1996). Den ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Seoul National University (IACUC godkjenning nr .: SNU-101213-1).
1. Buffer Forberedelse (Tabell Materialer og utstyr)
- Fremstille 300 ml frisk isolasjon løsning på dagen for eksperimentet (i mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl2, 3,5; glukose, 5; HEPES, 5; Na2 HPO 4, 0,4, taurin, 20; pH 7,4 med NaOH).
- Fremstille 100 ml frisk lagringsløsning på dagen for eksperimentet (i mM: NaCl 120, KCl 5,4; MgSO4 5; CaCl2 0,2; natrium-pyruvat 5; glukose 5,5; taurin 20, HEPES 10, mannitol 29; pH 7,4 med NaOH).
- Forbered 1L av perfusjon løsning (i mm: NaCl, 141,4; KCI, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MGCl 2, 1; HEPES, 10; glukose, 5,5; CaCl2, 1,8; mannitol, 14,5; pH 7,4 med NaOH).
- Fremstille 30 ml kollagenase oppløsning 1 ved tilsetning av kollagenase (1 mg / ml), protease (0,1 mg / ml), bovin serum albumin (BSA, 1.67mg / ml), og Ca 2 + (0,05 mM) i 25 ml isolerings løsning.
- Fremstille 20 ml kollagenase oppløsning 2 ved tilsetning av kollagenase (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml), og Ca 2 + (0,05 mM) til 16,7 ml av isolasjon oppløsning.
- Fremstille 40 ml BSA-oppløsning ved tilsetning av 0,4 g BSA til 40 ml av isolasjon oppløsning. Separat 10 ml og 30 ml i to kanner. Legg Ca2 + til 30 ml BSA-oppløsning, slik at den endelige Ca2 + konsentrasjonen i BSA-oppløsning er 1 mM.
2. Forberedelse til Isolering av venstre ventrikkel (LV) muskelceller
- Overfør 8-12 uker gamle, Sprague-Dawley (SD) rotter i rene transport bur fra dyret anlegget til utarbeidelse og isolasjon rom.
- Hspise to vannbad til 37 o C.
Merk: Bruk en vannbad i vannet - med kappe reservoar og perfusjon rør av Langendorff perfusjon system. Bruk den andre vannbad for å agitere hjerteinfarkt vev badebukser for å skille enkeltmuskelceller. - Tilsett 5 ml og 3,3 ml av BSA-oppløsning (uten Ca 2 +) til 25 ml kollagenase oppløsning 1 og 16,7 ml kollagenase oppløsning 2 for å gjøre opp volumet til 30 ml og 20 ml, respektivt.
- Legg isolasjon oppløsning (100 ml) og kollagenase oppløsning 1 (30 ml) til kolonne 1 (Kol 1) og kolonne 2 (Kol 2) i Langendorff-perfusjon system, henholdsvis (figur 1A).
- Oksygenere isolasjon løsning og kollagenase oppløsning 1 i spalte 1 og Col.2 via oksygenet forbindelse røret i Langendorff-perfusjon system (figur 1A). Tilsvarende oksygenatom kollagenaseoppløsning 2 og den BSA-oppløsning i rystende vannbad med 100% O 2 viaoksygen tilkobling tube.
3. Isolering av LV muskelceller
- Bedøve et SD rotte via intraperitoneal injeksjon av pentobarbital natrium (30 mg / kg) og bekreft bedøvelse status ved tå klemming og mangel på uttak refleksjon.
- Flytt rotte til en disseksjon skuffen. I liggende stilling, festes de fire benene til sidene av kroppen med tape.
- Påfør thorax mid-aksiale snitt med kirurgisk saks for å åpne brystet, slik at du ikke skader hjertet. Bruk en annen par rene saks for å dissekere hjerte fra koblings fartøy (f.eks, superior og inferior vena cava, lungekar, og aorta) og perikard membranen 13.
- La en del av aorta av en tilstrekkelig lengde (5 - 8 mm), klemme aorta med fin pinsett, og raskt montere kanylen av Langendorff-perfusjon system innen 1 min (figur 1A). Tie suturtråden 4/0 tett over aorta.
- Demontere den fordøyd hjertet ved å kutte i aorta og overføre den ved å holde aorta med pinsett i kolben inneholdende fersk isolasjon oppløsning (figur 1Bi). Bruk fin saks og pinsett til å kutte det meste av LV frie veggen (inkludert septum) i mindre biter (~ 22 mm, figur 1Bii).
- Overfør bitene i en kolbe som inneholder forvarmet og oksygenrikt frisk collagenase løsning 2 (figur 1Biii). Rystes i 10 min. Hold levere oksygen til myocyte holdige kollagenaseoppløsning 2.
- Flytt myocyte - suspensjonen til en 10 ml sentrifugerør ved hjelp av drop med en sugekilden og legge Ca 2+ - inneholder BSA løsning (1: 1 i volum). Sentrifuger ved 30 g i 2 min og kast supernatanten. Re-suspendere myocyte pellet i 5 ml BSA løsning. Sentrifuger og kast supernatanten.
- Dispergere myocyte pelletene og holde myocytter i 10 ml pre-oksygenert lagringsløsning ved romtemperatur (figur 1Biv-vi).
- Gjenta fremgangsmåten (trinn 3.7 til 3.9) med den gjenværende LV vev i kolben.
Merk: Hold gjenta fremgangsmåten (trinn 3.7 til 3.9) igjen før det meste av LV vev forsvinner for å få et godt utbytte av muskelceller. - Hold muskelceller i lagringsløsning for 6-8 timer ved romtemperatur frem til utgangen av eksperimenter.
4. samtidige målinger av intracellulær Ca 2 + transienter og myocyte Sammentrekning
- Load LV muskelceller med acetoksymetylester Fura-2 AM (2 mm).
Merk: Utfør alle lasteprosedyrer og eksperimenter med lastet muskelceller i en mørk tube (figur 1Bvii).- Centrifuge den myocyte suspensjonen (1 ml) ved 2000 xg i 10 sek. Kast supernatanten og re-suspendere myocyte pellet i 1 ml Tyrode løsning med lav Ca 2+ konsentrasjon (250 mikrometer, Bord Materialer og utstyr).
- Legg Fura-2AM og poloksamer 407 (2 ul), forsiktig dispergere myocyte suspensjonen, og holde blandingen ved romtemperatur (20-24 ° C) i 15 minutter (figur 1Bvii).
- Sentrifuger blandingen i 5 sek Kast supernatanten og dispergere myocyte pellet i 1 ml av perfusjon oppløsning inneholdende 500 mM Ca 2+. Etter 10 min sentrifuger blandingen i 5 sek og kast supernatanten.
- Legg frisk perfusjon løsning (500 mM Ca 2+, 1 ml) og holde Fura-2AM - lastet myocyte pellet i denne løsningen for opptak.
- Måling av LV myocyte sammentrekning og intracellulær Ca 2+
- Før opptak, fylle perfusjon rør som går gjennom envannkappe med Tyrode løsning, som er forvarmet til 36 o C.
- Plasser et par dråper av Fura 2 AM - lastet LV myocyte suspensjon på kammeret av en omvendt fluorescens mikroskop for 5-8 min. Sakte perfuse den Tyrode-oppløsning (2,2 ml / min).
- Trykk på "Start" -knappen på frontpanelet på den digitale stimulator for å starte feltstimulering (2 Hz).
Merk: utgangsspenning (10 V, 5 msek varighet) påføres på myocytter i kammeret gjennom platinatråder plassert på hver side av kammeret.- Velg muskelceller at kontrakten stabilt (ikke de viser hyper- eller hypo-kontraksjon) for opptak.
- Juster myocyte av valget i den horisontale posisjonen til videobasert sarcomere deteksjonssystem og justere fokus i mikroskop for å få optimale bilder av sarcomeres. Plasser den lilla rektangulære boksen på det området der klare sarcomeres er tydelig observert inntil den gjennomsnittligeav sarcomere lengder (red peak) viser en enestående skarp topp (figur 2A, lavere bilde).
- Registrere endringene i sarcomere lengde som reaksjon på feltstimulering (figur 2A og B).
Merk: Bruk lastet muskelceller innen 1-2 timer. - Juster åpning av kameraet, slik at feltet i videobasert sarcomere deteksjonssystem er størrelsen på myocyte (figur 2A). Stimulere myocyte med eksitasjon ved 360 nm / 380 nm og emisjon ved 510 nm (oppkjøp frekvens 1000 Hz). Record sarcomere forkorting og fura2 AM forholdet med feltstimulering (figur 2B).
5. Vurdering av Myofilament Ca 2+ Følsomhet
- Gjennomsnittlig sarcomere lengder og Ca 2 + transienter ved steady-state (10 - 20 spor) og plotte faseplan sløyfe av forholdet Fura-2 vs sarcomere lengden på samme myocyte (begge med målt verdis og delta endringer; Figur 2C).
- Definere i hver tomt, Fura -2 ratio på 50% avslapning (EC 50, figur 2C). Sammenligne både sløyfen og EC 50 av hvert intervensjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LV muskelceller er isolert fra normale og hypertensive rottehjerter. Stavformede muskelceller med klare striper (som representerer sarcomeres) og stabile sammentrekninger i respons til felt stimulering anses å være de optimale muskelceller og er valgt for opptak (figur 2A). I det eksempel som er vist i f-igur 2A, en Fura 2-am -loaded LV myocyte er plassert horisontalt og åpningen av kameraet er justert slik at den myocyte opptar mesteparten av opptaksfeltet og minimal bakgrunnsområdet er inkludert. I opptaket feltet, justere dimensjonene av den lilla boksen ved å klikke og dra denne boksen på dataskjermen (gjennom innspillingsprogram). Når den gjennomsnittlige sarcomere lengden viser en skarp rød topp, starte opptak (figur 2A, lavere bilde).
Både sarcomere lengde og intracellulær Ca 2+ transie NTS (Fura-2 forholdstall) registreres samtidig fra samme muskelceller (figur 3A). De gjennomsnittlige spor av sarcomere lengde og Ca 2+ transienter er vist i figur 3B. Individuelt, diastolisk / systolisk sarcomere lengder, tid til topp (PT), og sarcomere forkorting er målt for å undersøke amplitude og dynamikken i myocyte kontraktilitet. Tid til 50% avslapping (TR 50) er analysert for å vurdere avslapning av muskelceller. Tilsvarende diastolisk og systolisk Fura-2-forhold (Ca 2 + transienter), tid til topp (PT) av Ca 2 + transienter og tidskonstanten Ca 2 + forbigående råte (tau) er analysert for å vurdere myocyte sammentrekning og avslapping (tabell 1). I dette eksempel blir amplitudene av Ca 2 + transienter moderat økt i LV myocytter fra en hypertensiv rotte og sammentrekning er moderat redusert (figur 3B og tabell 1).
innhold "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Dessuten er forholdet mellom Fura - er to forhold og sarcomere lengde (som indikerer myofilament Ca 2+ følsomheten LV muskelceller) plottet i både falske og hypertensive rotter ( fig. 3C) for Fura 2 - sarcomere lengde bane under avslapning fase av myocyte definerer en kvasi-likevekt av cytosol Ca2 +, Ca2 + myofilament binding, og sarcomere lengde 14, og derfor er det avslapping fasesammenlignet mellom de to grupper. den høyrerettet forskyvning av banen i myocytter fra den hypertensive gruppe angir en redusert myofilament respons på Ca 2+ (figur 3C). Følgelig, den intracellulære Ca2 + konsentrasjon som er nødvendig for halv avslapning (EC 50) økes (figur 3C) , med henvisning til myofilament Ca 2+ -desensitization i hypertensjon.Figur 1. Prosedyrer for å isolere LV muskelceller fra rottehjerte. (A) Langendorff-perfusjon system som benyttes til å gjennomstrømme den isolasjon oppløsningen inn i hjertet kanylert via aorta (innfelt, forstørret bilde av det monterte hjerte på perfusjon system) (B) i - iii.: Hjertet etter spaltning med kollagenase oppløsning 1 og dissekert LV vev i en skål og kolbe (B) iV - vI:.. myocyte suspensjonen etter tilsetting av collagenase løsning 2, myocyte pelleten etter sentrifugering, og resuspendert myocyte pellet i lagringsløsningen (B) vii: inkubering, inkuber LV muskelceller i Fura 2AM - holdig isolasjon løsning (2 mikrometer Fura 2 AM, 250 mikrometer Ca 2+ og med 2 ul poloxamer 407); utvasking, vask LV muskelceller med isolasjon løsning med 500 mM Ca 2+; lagring, holde Fura-2 AM - lastet LV muskelceller ifrisk isolasjon løsning som inneholder 500 mM Ca 2+. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Måling av sarcomere forkorting og forholdet Fura-2 (som indikerer den intracellulære Ca2 + nivå). (A) Et diagram av sarcomere, et bilde av en Fura-2 -loaded LV myocyte og gjennomsnitt sarcomere lengde (den røde peak) vises på datamaskinen. I den nedre panelet, er den svarte linjen gjennomsnittet av hver horisontale pixel linje i lilla regionen av interesse. Den blå kurven er de samme dataene satt til null ved hver ende. Den røde linjen er den rask Fourier transform (FFT) effektspekter, som representerer antall signaler FFT har beregnet. En skarp peak betyr en ren sarcomere opptak. (B) samtidige opptak av sarcomere lengde og den Fura -2-forholdet som reaksjon på feltstimulering (2Hz). (C) Fase-planet plotting av forholdet mellom Fura 2 mot sarcomere lengde av samme LV myocyte (merk at både den faktiske lengde / Fura 2 grad og delta endringer av disse parametrene er analysert). EC 50 (Fura 2 ratio på 50% avslapning, sirkel angitt med pil) er kvalitativ sammenligning av myofilament Ca 2+ følsomhet mellom gruppene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative resultatene av analysen av LV myocyte sammentrekning i humbug og hypertensive rotter. (A) Rå spor av sarcomere shortening og Fura - 2 ratio måling i LV muskelceller fra humbug og hypertensive rotter (B) Gjennomsnittlig spor av sarcomere lengde og Fura -. 2 signaler. Parametere som ble analysert i de gjennomsnittlige traser er vist i tabell 1. (C) Fase-plane plott av Fura - 2 forholdet vs. sarcomere lengde (både den faktiske lengden og Fura - 2-forhold og delta endringer i disse parametrene) i de to grupper . Banen sløyfe er forskjøvet til høyre og EC 50 har en tendens til å være høyere i hypertensjon, noe som tyder myofilament Ca 2+ desensitivisering. PT, tid til topp (sek); Tau, tidskonstant på Ca 2+ forbigående nedbrytning (sek) (oppnådd ved å montere nedgangen fasen av Fura - 2-forhold med en eksponentialfunksjon) .TR 50: tid til 50% relaksasjon (sek). 
Klikk her for å se en større versjonav denne figur.
| parametere | Sham | hypertensjon | |
| Intracellulær Ca 2+ | Diastolisk Ca 2+ | 1,189 | 1.124 |
| Systolisk Ca 2+ | 1.71 | 1,691 | |
| Amplitude (Δ ratio) | 0,521 | 0,567 | |
| Tid til topp (PT, s) | 0,021 | 0.031 | |
| Tau (s) | 0.079 | 0,076 | |
| sarcomere | diastolisk | 1,758 | 1.78 |
| sarcomere lengde (mm) | |||
| sarcomere | 0,122 | 0,115 | |
| Avkortning (16; lengde, mm) | |||
| Tid til topp (PT, s) | 0.064 | 0,055 | |
| Tid til 50% | 0,032 | 0,03 | |
| Avslapping (TR 50, s) | |||
| EC50 | [Ca2 +] (Fura-2 forhold) for 50% sarcomere relengthening | 0,2382 | 0,3224 |
Tabell 1. Analyse av Fura - 2-forhold (intracellulær Ca2 +) og sarcomere lengdemålinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi protokollene for å vurdere endringer av myofilament Ca 2+ følsomhet i enkelt isolert hjerte myocyte og understreker viktigheten av å måle denne parameteren sammen med elektrofysiologiske egenskaper, intracellulære Ca 2 + transienter, og myofilament dynamikk. Dette er fordi opptakene av en eller to av parametrene ikke kan explicate mekanismene bak hjerte- sammentrekning og avslapping. I motsetning til konvensjonelle fremgangsmåter som måler myocyte sammentrekning og den intracellulære Ca2 + profil individuelt 1, den foreliggende fremgangsmåte tar for begge parametrene samtidig i samme hjertemuskelceller.
Et antall fremgangsmåter er vanligvis brukt for å vurdere myofilament Ca 2+ følsomhet av muskler eller myocytter 15,16,17, f.eks, undersøkelse av vekselvirkningene mellom eksogene Ca 2+ og sarcomere / celle lengde / spennings i flådd muskelceller(Behandlet med detergenter som saponin eller β-Esin for å permeabilisere membranen). Lengder er målt med fotodiode og laserstråle diffraksjon teknikker, og spenningen med krafttransdusere eller karbonfibre). Disse teknikkene er mye brukt i muskel studier fordi de gjør det mulig kvantitative vurderinger av myofilament Ca 2+ følsomhet. Imidlertid endogene ionekanal aktiviteter i plasmamembranen og intracellulære Ca2 + håndtering, de som er nødvendig for å initiere mekanikken i myofilament, er neglisjert i disse teknikkene. I tillegg muskelstrimler eller myocytter som studeres er forstrukket til en viss diastolisk lengde, og under disse betingelser, kan den innledende sarcomere lengde være forskjellig fra den faktiske diastoliske lengden av myocytter (særlig i sykdomstilstander og med inngrep). Dette understreker fordelen av strømmåling der cellulære organ forbli relativt uforstyrret, og dermed, slik at omfattende de vurderteasjon av myocyte kontraktile funksjon.
Forståelig nok, kvaliteten på muskelceller (Ca 2+ -tolerating) og optimal lasting av Fura - 2am er to viktige elementer for en vellykket vurdering av myofilament Ca 2+ følsomhet. Følgelig er flere modifikasjoner anvendes til protokollen for å oppnå levedyktige stavformede myocytter (60-80% av totale celler, som beskrevet tidligere 18,19,20). For det første er en lav dose av Ca 2+ tilsatt til løsningene i løpet av fordøyelsesprosesser (for eksempel, er det Ca2 + konsentrasjon 50 uM i kollagenase løsninger og 200 uM i lagringsløsningen). For det andre, i løpet av fordøyelsesprosessen, blir BSA tilsatt til kollagenase løsninger for å forbedre membranstabilitet. For det tredje er de fleste av løsningene oksygenert under isolasjon, noe som øker prosenten av funksjonelle myocytter og varigheten av forsøkene (6-8 timer). Fjerde, er isolerte muskelceller holdes i lagringsløsning containing 200 mikrometer Ca 2+.
For å oppnå optimal belastning med Fura 2 AM, blir to forskjellige Ca 2 + konsentrasjoner (250 og 500 uM) som brukes og poloksamer 407 (2 ul; 20% fremstilt i dimetylsulfoksyd) ble tilsatt for å forbedre permeabiliteten av Fura-2AM gjennom membranen og stabiliteten i muskelceller. Det bør bemerkes at alle Ca 2+ indikatorfarger er Ca 2 + buffere 21. Derfor bør forskere unngå å bruke en høy konsentrasjon av Fura-2 AM eller en lengre inkubasjon for å unngå overdreven bufring og redusert myocyte kontraktilitet. Det anbefales at myocyte sammentrekning uten Fura - 2 lasting er rutinemessig sjekket, som er et viktig skritt for å anslå kvaliteten myocyte og lastestatus. Variasjon i lasting er uunngåelig. Derfor er det viktig å undersøke variasjonen i myocyte sammentrekning, spesielt hvorvidt antallet for å pådra myocytter i kammeret er lik før og enfter lasting. Analyse av hyper- eller hypo-kontraktørmuskelceller bør unngås fordi de ikke representerer den gjennomsnittlige statusen muskelceller og kan forårsake partisk resultater og evalueringer.
Det skal bemerkes at de målte endringer i forholdet Fura 2 er refleksjoner av den intracellulære Ca2 + nivå, snarere enn den faktiske kjemiske konsentrasjonen av Ca2 +. Derfor er metoden beskrevet her evaluerer kvalitative endringer av myofilament Ca 2+ følsomhet, snarere enn selve følsomheten myofilaments til Ca 2+. Kalibrering av Fura - 2-signal til den intracellulære Ca2 + konsentrasjonen er løsningen å skaffe pålitelige Ca 2 + konsentrasjoner i de enkelte muskelceller. Kalibreringsprosedyren krever lasting myocytter med forskjellige konsentrasjoner av Ca 2 + -konjugert Fura - 2 AM (Ca2 + konsentrasjon i området 0-39 uM), og den oppnådde Fura - 2-prosenter er beregnet med the følgende formel: [Ca2 +] i = Kd * (R - Rmin) / (Rmaks - R) * F380max / F380min 21. Det er mulig å utlede de samlede gjennomsnittlige verdier for Ca 2+ konsentrasjon gjennom en slik kalibreringsprosedyre. Men fordi lasting av Ca 2+ indikatorer er variabel blant muskelceller og kalibrering utføres ikke i en enkelt celle, Ca 2+ konsentrasjoner kan ikke bli kjøpt nøyaktig. Videre, hvis F360 / F380 blir målt i stedet for F340 / F380 (som i foreliggende studie), er forholdet Fura 2 mindre nøyaktig (fordi F360 er isobestic bølgelengden for Fura-2 fluorescens 22). Likevel er det fortsatt en gyldig metode for å vurdere kvalitative endringer i myofilament Ca 2+ følsomhet i fysiologiske eksperimenter, spesielt i syke menneskers hjerter, hvor myofilaments kan samtidig endres etter endringer i den intracellulære miljø. Det anbefales at denne metoden er kombinert med alternative metoder (som debeskrevet tidligere i diskusjonen avsnitt) til nettopp analysere den sanne følsomheten myofilaments til Ca 2+.
Den annen begrensning av fremgangsmåten i studiet av myocyte sammentrekning er ubelastet tilstand. Det kan undervurdere eller overvurdere endringene i myofilament Ca 2+ følsomhet. Derfor, for å nøyaktig evaluere myofilament Ca2 + følsomhet, bør analysen utføres med alternative målinger for både kvalitativ og kvantitativ vurdering.
Teknikken er aktuelt for å vurdere myokardfunksjon hos friske og syke hjerter, inkludert humane kardiale prøver, hvor den cellulære redoks miljø og post-transkripsjon modifikasjoner er endret, noe som resulterer i samtidige endringer i myofilament funksjoner. Spesielt ionekanaler, intracellulære ion homeostase og regulatoriske proteiner i myofilaments er interaktive; Derfor er alle disse komponentene virker i concert for å bestemme hjerteytelse in vivo (for eksempel målt i ekkokardiografi).
I konklusjonen, beskriver vi en metode for å vurdere endringer av myofilament Ca 2+ følsomhet og understreker viktigheten av å analysere denne parameteren i forbindelse med hjerteelektrofysiologi, intracellulær Ca 2+ håndtering, og myocyte sammentrekning for å få en full profil myocyte funksjon. Myofilament Ca 2+ følsomhet bør måles rutinemessig i mekanistiske studier med sykt hjerte-modeller, der endringer i disse parametrene samt ulike intracellulære signalveier henger sammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2013068067); av Brain Korea 21 Studentbedrift av den koreanske Ministry of Education, Science and Technology, Seoul National University Hospital, den koreanske Society of Hypertension (2013), SK Telecom Research Fund (nr. 3420130290) og fra Foundation of China National Natural Science (NSFC 31460265; NSFC 81260035).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
References
- Bers, D. M., et al.
- Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
- Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
- Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
- Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
- Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
- Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
- Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
- Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
- Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336 (2013).
- Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
- Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
- Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
- Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
- Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
- Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
- Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
- Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
- Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
