Abstract
심부전 및 심장 부정맥은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 주요 원인입니다. 그러나, 병에 걸린 마음의 병인과 심근 고장의 메커니즘은 완전히 명확 일이다. 최근 강력한 증거가 myofilament 칼슘 2 + 감도의 변화가 심장 근육 세포에서 세포 내 칼슘 항상성 및 이온 채널 활동에 영향을 미칠 것으로 보여, 건강하고 병에 걸린 마음에 심장 활동 전위과 수축을 담당하는 핵심 메커니즘. 사실, (예를 들어, 나 +, 칼슘 2 +와 K + 채널과 나 + -ca 2+ 기) 및 세포 내 칼슘 2 + 처리 단백질 (예., ryanodine 수용체와 칼슘을 심장 활동 전위를 기본 이온 채널의 활동 및 운송 근질 세망 (SERCA2a) 또는 phospholamban과 인산화)에서 2 + -ATPase 종래 evalu 측정된다심장 자극 - 수축 (EC) 커플 링의 기본 메커니즘을 먹었다. myofilament이 수축과 이완의 기능 부이고, myofilament 칼슘 감도 근원 섬유 성능의 구현에 필수적인 반면, 멤브레인 및 세포 내 칼슘의 변화 모두 전기 활동은 EC 결합의 트리거 신호이다. 이 연구의 초점이 아닌 그럼에도 불구하고, 몇몇 연구는 심근의 기능 분석에 myofilament 칼슘 감도를 통합합니다. 여기, 우리는 근절 단축 / 재 연장과의 Fura-오전 2시 (비율 계량 감지)와 쥐 마음에서 심장 근육 세포에 myofilament 칼슘 감도의 변화를 평가를 사용하여 세포 내 칼슘 수준을 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 주요 목적은 칼슘 감도 역학적 분석 EC 결합에서 고려되어야한다는 myofilament을 강조하는 것이다. 난의 종합 조사번역 및 치료 가치보다 효과적인 전략을 설계에 대한 유용한 정보를 제공 할 것이다 건강하고 병에 걸린 마음에서 심근 수축력의 기초 채널, 이온 수송, 세포 내 칼슘 처리 및 myofilament 칼슘 감도에.
Introduction
여기 심장 수축 (EC) 결합 심근 즉, 심장의 수축 1,2- 함수의 기계적 특성을 분석하는 기본 방식이다. EC 커플 sarcolemmal이 이온 채널의 활성에 보조 막을 탈분극에 의해 개시된다 (예를 들어, 패치 클램프 기술을 통해 측정 할 수있는 전압 - 게이트 나 + 채널). (나노 몰에서 nm의 세포질 칼슘 농도를 증가 ryanodine 수용체 (RyRs)를 통해 전압 게이트 L 형의 후속 활성화 칼슘은 2 + 채널 LTCCs를 통해 2+ 유입이 칼슘의 대부분을 트리거 (LTCCs)과 칼슘 2 + 릴리스, )는 (μM) 수준을 마이크로합니다. 세포질 칼슘의 이러한 증가는 얇은 필라멘트에 트로포 닌 C (TNC)에 결합하는 2 + 칼슘을 촉진하고 이끌어 필라멘트 복합체의 구조적 변화를 액틴 - 미오신 상호 작용을 촉진하고 myocardi을 달성알은 3 수축. 반대로, 세포질 칼슘은 SR에서 칼슘 2 + -ATPase를 통해 근질 세망 (SR) (SERCA2a)로 다시 재 uptaken거나 나 + / 칼슘 교환기 및 plasmalemmal를 통해 심근에서 압출 칼슘 2 + ATPase의 1, 2. 따라서, 세포질 칼슘의 감소는 2 + 액틴 - 미오신과 심근 이완 1-3의 분리의 결과로, 다시 원래 상태로 얇은 필라멘트의 구조적인 변화를 선동. 대부분의 포유 동물의 심장 세포 1 세포질 칼슘 제거의 90 % - 이러한 방식에서, SERCA2a의 활성은 일반적으로 70를 차지하기 때문에 심근 완화의 속도를 결정하는데 고려된다. 등 LTCC, RyR 및 SERCA2a에 의해 같은 비정상적인 칼슘 처리로 병에 걸린 심장 1-4에서 장애인 수축과 이완의 기본 메커니즘을 고려하고있다.
2 + 총 세포 내 칼슘의 약 1 %에 대한 EC 커플 링 계정의 메신저와 칼슘의 대부분 같은 기능은 세포 내 칼슘 2 + 버퍼 5,6에 바인딩 무료 세포질 칼슘. 이는 다양한 칼슘 버퍼의 SR에 예를 들어, 막 인지질, ATP, 크레아틴 인산, 칼 모듈 린, parvalbumin, 근원 섬유 TNC, 미오신, SERCA2a 및 calsequestrin 심장 근육 세포에 풍부 사실이다. 5,6,7. 그 중, SERCA2a 및 TNC가 지배적 인 칼슘 2 + 버퍼 5,6,7입니다. 또한, 칼슘 2 +의 버퍼 바인딩 트 동안 역동적 인 과정이며, 추가 원인을 결합 칼슘의 변화 2+ (예를 들어, 2 + 칼슘의 30 % ~ 50 %는 2 + 과도 7 TNC에 결합 칼슘 동안 그것에서 해리) 진한 2+ 세포 내 칼슘의 변화에, 세포질 무료 칼슘의 결과를 "해제"entration. 그 결과, 세포 내 칼슘 수준의 교란은 수축 기능 장애 및 부정맥 8,9의 전구체입니다 이상 myofilament의 움직임을 유도한다. (생리 및 병리 모두) 많은 요인 myofilament 칼슘 버퍼링 및 myofilament 칼슘 감도 8-10 영향을 myofilament 단백질의 전사 후 변형의 원천이 될 수 있습니다. 최근에는 칼슘 2 + 과도, 비정상적인 칼슘 2 + 릴리스 및 부정맥 8의 일시 정지에 의존 증강을 유발, myofilament 단백질의 돌연변이가 칼슘 결합 친화 및 세포 내 칼슘 처리를 늘리는 것이보고되었다. 이 개념에 맞춰, 우리는 또한 높은 이완기 및 수축기 칼슘 수준과 연관된 신경 세포의 산화 질소 합성 효소의 업 규제 이차 고혈압 쥐의 마음이 myofilament 칼슘 탈감작을 보여 주었다결과적으로, 칼슘 의존적 불 활성화 (12)에 LTCC의 취약성을 증가 11. 따라서, myofilament 칼슘 감도는 세포 내 칼슘 항상성 및 심근 수축 기능의 "활성"레귤레이터이다. 그것은 myofilament와 칼슘 사이의 상호 작용을 분석 할 필요가있다 2+ 심근 EC 커플 링 및 심장 기능의 철저한 조사를 위해 단백질을 처리.
여기, 우리는 고립 된 심장 근육 세포에 myofilament 칼슘 감도의 변화를 평가하는 프로토콜을 설명합니다. 세포 내 칼슘 2 + 프로필의 종합 분석, myofilament 칼슘 감도 및 수축 새로운 메커니즘을 기본 심근 역학을 발굴합니다.
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Protocol
프로토콜은 건강의 UN 국립 연구소에 의해 게시 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라입니다 (NIH 공개 번호 85-23, 1996 개정). 그것은 서울 대학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (IACUC 승인 번호 : SNU-101213-1)에 의해 승인되었다.
1. 버퍼 준비 (표 재료 및 장비)
- mm 단위 (실험 당일 신선한 분리 용액 300㎖를 준비 : 염화나트륨, 135의 KCl, 5.4;의 MgCl 2, 3.5, 글루코스, 5; HEPES, 5; 나 2 HPO 4, 0.4, 타우린 20] pH가 7.4 NaOH로).
- 밀리미터에 (실험의 날에 신선한 스토리지 솔루션 100 ml의 준비 : 염화나트륨 (120);의 KCl 5.4, 황산 5, CaCl2를 0.2, 나트륨 피루 베이트 (5); 5.5 포도당, 타우린 (20), HEPES (10), 만니톨 (29), pH 7.4의 ) NaOH로.
- 밀리미터의 관류 액 1L (준비 : 염화나트륨, 141.4을, KCl을, 4;의 NaH 2 PO 4, 0.33; MGC를L이 1; HEPES, 10; 포도당, 5.5; 염화칼슘 2, 1.8; 만니톨, 14.5; pH를 NaOH로 7.4).
- 절연 25 ㎖로 콜라게나 제 (1 ㎎ / ㎖), 프로테아제 (0.1 ㎎ / ㎖), 소 혈청 알부민 (BSA, 1.67mg / ㎖) 및 칼슘 (0.05 mm)를 첨가하여 콜라겐 용액 1 30 ㎖를 준비 해결책.
- 차단 용액을 16.7 ml의 (1 ㎎ / ㎖) BSA (1.67 ㎎ / ㎖), 및 칼슘 (0.05 ㎜) 콜라게나 제를 첨가하여 콜라겐 용액이 20 ㎖를 준비한다.
- 차단 용액을 40 ml의 BSA 0.4 g을 첨가하여 BSA 용액 40 ml를 준비. 10 mL 및 두 개의 비커에 30 ml의 분리. 칼슘을 BSA 용액 2+ 30 mL로 추가되도록 BSA 용액의 최종 칼슘 농도가 1 mm이다.
좌심실 (LV) 심근 세포의 분리 2. 준비
- 준비와 격리 방에 동물 시설에서 깨끗한 전송 케이지 8-12 주령, 수컷 스프 라그 - 돌리 (SD) 쥐를 전송합니다.
- H37 오 C. 두 개의 수조를 먹고
참고 : 물에 대해 하나의 수조를 사용 - 재킷 저수지와 랑겐 돌프 관류 시스템의 관류 관. 하나의 근육 세포를 분리하기 위해 심근 조직 트렁크를 선동하기 위해 다른 수조를 사용합니다. - 각각 30 mL 및 20 ㎖에 볼륨을 만들기 위해 5 ㎖의 콜라겐 액 (1) 및 16.7 ml의 콜라겐 액이 25 ml의에 (칼슘없이 2+) BSA 용액의 3.3 ML을 추가합니다.
- 랑겐 도르프 재관류에있어서, 각각 (도 1a)에서 분리 용액 (100 mL) 및 1 열 (골 1) 및 열 (2)에 콜라게나 제 용액 1 (30 ㎖) (골 2)를 추가한다.
- 랑겐 돌프 관류 시스템 (도 1A)의 산소 연결 튜브를 통해 골 1 Col.2의 분리 용액과 콜라겐 용액 1 네이트. 마찬가지로 네이트 콜라게나 제 용액과 두 비아 100 % O 2를 진탕 수욕에서 BSA 용액산소 접속 관.
LV 근육 세포 3. 분리
- 펜토 바르 비탈 나트륨 (30 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사를 통해 SD 쥐를 마취하고 곤란 발가락과 철수 반사의 부족으로 마취 상태를 확인합니다.
- 해부 트레이에 쥐를 이동합니다. 앙와위에서 테이프 본체의 측면에 4 개의 다리를 고정.
- 심장이 손상되지 않도록 보장, 가슴을 열고 수술 가위 흉부 중간 축 절개를 적용합니다. 연결 용기 (예를 들어, 우수하고 하대 정맥, 폐 혈관 및 대동맥) 및 심낭 막 (13)로부터 심장을 해부 깨끗한 가위의 또 다른 한 쌍을 사용합니다.
- 충분한 길이의 대동맥의 일부를 남기기 (5-8mm)를 미세 집게로 대동맥 클램프, 빠르게 1 분 (그림 1A) 내에서 랑겐 돌프 관류 시스템의 캐 뉼러를 탑재합니다. 대동맥을 통해 단단히 봉합 나사 4/0을 묶어.
- 대동맥을 절단하여 소화 마음을 분리하고 신선한 격리 솔루션 (그림 1Bi)를 포함하는 플라스크에 집게로 대동맥을 유지하여 전송할 수 있습니다. 작은 조각 (~ 22mm, 그림 1Bii)에 (격막 포함) LV 무료 벽의 대부분을 잘라 미세 가위와 집게를 사용합니다.
- 미리 예열 및 산소 신선한 콜라게나 제 용액 (2) (그림 1Biii)를 포함하는 플라스크에 조각을 전송합니다. 10 분 동안 흔들어. 심근 함유 콜라겐 용액 2에 산소를 전달하는 것.
- (BSA 용액을 함유 - 2+ 흡입 전구 적기를 사용하여 10 mL의 원심 분리 튜브에 현탁 및 CA 추가 - 심근 이동1 : 볼륨 1). 2 분 30 g에서 원심 분리하고 상층 액을 버린다. BSA 용액 5 ㎖에 심근 세포 펠렛을 다시 일시. 원심 분리기 뜨는을 버리고.
- 심근 세포 펠렛을 분산 및 RT (그림 1Biv-VI)에서 미리 산소 저장 용액 10 ml의 근육 세포를 유지.
- 플라스크에 남아있는 LV 조직으로 - 절차를 (3.9 3.7 단계) 반복합니다.
좌심실 조직의 대부분이 근육 세포의 좋은 수율을 얻을 사라질 때까지 다시 - (3.9 3.7 단계)의 절차를 반복하십시오 :합니다. - 실험이 끝날 때까지 실온에서 6-8 시간 동안 스토리지 솔루션의 근육 세포를 유지합니다.
세포 내 칼슘 과도과 심근 수축 4. 동시 측정
- 아세 톡시 메틸 에스테르의 Fura-오전 2시 (2 μM)와로드 LV의 근육 세포.
참고 : 어두운 튜브 (그림 1Bvii)에로드 된 근육 세포로 모든 로딩 절차와 실험을 수행합니다.- 하기 Centr10 초 동안 2,000 XG에서 심근 서스펜션 (1 ml)에 ifuge. 뜨는을 취소하고 낮은 칼슘 농도 (250 μM, 표 재료 및 장비)와 타이로드 용액 1 ㎖의 심근 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 부드럽게 심근 세포 현탁액을 분산,은 Fura - 오전 2시 및 폴록 사머 407 (2 μL)를 추가하고, 실온에서 혼합물을 유지 - 15 분 (20 ~ 24 O를 C) (그림 1Bvii).
- 원심 혼합물을 5 초 동안, 상층 액을 제거하고 500 μM 칼슘을 함유하는 관류 액 1ml에 심근 세포 펠렛을 분산. 10 분 후, 5 초 동안 혼합물을 원심 분리하고 상층 액을 버린다.
- 신선한 관류 용액 (500 μM 칼슘, 1 ml)에 추가하고의 Fura - 오전 2시 유지 - 녹음이 솔루션에로드 된 심근 세포 펠렛을.
- 좌심실 심근의 수축과 세포 내 칼슘의 측정 2 +
- 기록하기 전에 통해 실행 관류 관을 채우기인 타이로드 용액, 물 재킷 (36) 오 C.에 미리은 예열
- 8 분 - 5 거꾸로 형광 현미경의 챔버에로드 좌심실 심근 서스펜션 - 상기의 Fura 오전 2시의 몇 방울을 배치합니다. 천천히 타이로드 용액 (2.2 ㎖ / 분)를 관류.
- 필드 자극 (2 Hz에서) 시작하는 디지털 자극의 전면 패널에있는 "시작"버튼을 누릅니다.
주 : 출력 전압 (10 V는 5 밀리 초 지속 기간)는 상기 챔버의 양측에 위치하는 백금 와이어를 통해 챔버에서 심근 세포에 적용된다.- 안정적으로 그 계약을 선택 심근 세포 기록 (하이퍼 또는 저자 극성 수축을 표시하지 않는 것).
- 비디오 기반 근절 검출 시스템의 수평 위치에서의 선택의 근세포를 조정 근섬유 분절 최적의 이미지를 획득하기 위해 상기 현미경의 초점을 조절한다. 분명 근섬유 분절는 누가 뭐라고해도 평균 때까지 관찰되는 영역에 보라색 사각형 상자를 배치근절 길이 (적색 피크)의 단수 날카로운 피크 (그림 2A, 낮은 이미지)를 표시합니다.
- 필드 자극 (도 2A와 B)에 응답하여 근절 길이의 변화를 기록한다.
주 : 1 내에서로드 된 근육 세포를 사용 - 2 시간. - 비디오 기반 근절 검출 시스템의 필드가 근세포 (도 2A)의 크기가되도록 카메라의 조리개를 조정한다. 510 nm의 (인수 주파수 1000 Hz에서)에서 360 나노 미터 / 380 nm에서 여기 및 방출과 심근을 자극한다. 기록 근절 단축 및 현장 자극 (그림 2B)로 Fura2 AM 비율.
Myofilament 칼슘 감도 5. 평가
- 측정 값이 모두 (- (20 추적 10)과 같은 심근의 근절 길이 대의 Fura-2 비율의 위상면 루프를 플롯 근절 길이 및 정상 상태에서 2 + 과도 칼슘 평균s와 델타의 변화도 2C).
- 각각의 플롯에서 50 % 완화에서의 Fura -2 비율 (EC 50, 그림 2C)을 정의합니다. 루프 각 개입의 EC (50) 양을 비교합니다.
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Representative Results
LV의 근육 세포는 정상 및 고혈압 쥐의 마음에서 격리됩니다. 필드 자극에 응답 분명 줄무늬 (근섬유 분절을 대표하는) 안정 수축과 막대 모양의 근육 세포가 최적의 근육 세포로 간주하고 녹음 (그림 2A) 선택됩니다. F의 igure 2a에 도시 된 예에서의 Fura 오전 2시 좌심실 심근 수평 위치와 근세포는 기록 필드 최소 배경 영역의 대부분이 포함되어 차지하도록 카메라의 조리개 조정 -loaded. 기록 필드 (녹화 프로그램을 통해)를 클릭하고 컴퓨터 화면이 상자를 드래그하여 보라색 상자의 크기를 조정합니다. 평균 근절 길이가 하나의 선명한 빨간색 피크를 표시되면 (그림 2A, 낮은 이미지)를 기록 시작합니다.
근절 길이 및 세포 내 칼슘 2 + transie 모두 국세청 (의 Fura-2 비율) 같은 근육 세포 (그림 3A)에서 동시에 기록됩니다. 근절 길이 및 칼슘 과도 평균 흔적은도 3b에 도시되어있다. 개별적으로, 이완기 / 수축기 근절 길이는, 시간 (PT) 피크하고, 근절 단축은 진폭과 심근 수축력의 역학을 조사하기 위해 측정된다. 50 %의 이완 (TR 50)에 시간은 심근의 이완을 평가하기 위해 분석된다. 마찬가지로, 이완기 및 수축기의 Fura-2 비율 (칼슘 2 + 과도), 시간이 칼슘 2 + 과도 및 칼슘의 시정 2 + 과도 붕괴 (타우)의 심근의 수축과 이완 (표을 평가하기 위해 분석 (PT) 피크 1). 이 예에서, 칼슘 2 + 과도의 진폭은 적당히 고혈압 쥐에서 LV의 근육 세포에서 증가하고 수축은 적당히 (그림 3b 및 표 1) 감소한다.
콘텐츠 "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "> 또한,의 Fura 사이의 관계 - 2 비율과 근절 길이 (LV의 근육 세포의 myofilament 칼슘 감도를 나타내는)는 모두 가짜 및 고혈압 쥐에서 플롯 ( . -도 3c)는의 Fura 2 근세포의 이완 단계에서 근절 길이 궤도 세포질 칼슘, myofilament 칼슘 결합하고 근절 길이 (14)의 준 평형 상태를 정의하며, 따라서, 이완 단계 둘 사이 비교 그룹. 고혈압 군에서 심근 세포의 궤도의 우측 시프트 칼슘 (그림 3C)로 감소 myofilament 응답을 나타냅니다. 따라서, 세포 내 칼슘 농도가 증가 절반 휴식 (EC 50)에 필요한 (그림 3C) 고혈압에 myofilament 칼슘 -desensitization 참조.쥐의 심장에서 좌심실 근육 세포를 분리 1. 절차를 그림. (A) 대동맥을 통해 캐 뉼러를 중심으로 분리 용액 관류하는 데 사용 랑겐 돌프 관류 시스템 (삽입을 관류 시스템에 탑재 된 심장의 확대 된 영상) (B) I - III :. 콜라겐 용액 1 소화 후의 심장 그리고 요리와 플라스크에 LV 조직을 해부 (B) IV - VI :.. 심근 서스펜션 스토리지 솔루션에 콜라겐 용액 2, 원심 분리 후 심근 펠렛, 다시 중단 심근 펠릿을 첨가 한 후 (B) VII : 보육, LV를 품다 의 Fura 2AM의 근육 세포 - 포함 격리 솔루션 (2 μM의 Fura 2 AM, 250 μM 칼슘 2 + 2 μL의 폴록 사머 407)와; 세척, 500 μM 칼슘과 격리 솔루션과 좌심실 근육 세포를 씻어; 스토리지의 Fura-2 오전 유지 -로드 LV의 근육 세포를에500 μM 칼슘을 2 + 함유 신선한 격리 솔루션입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
근절 단축과의 Fura-2 비율 (세포 내 칼슘 수준을 나타내는) 그림 2. 측정. (A) 근절의 다이어그램하는의 Fura-2 -loaded 좌심실 심근의 이미지와 평균 근절 길이 (적색 피크)가 컴퓨터에 표시됩니다. 하판에 검은 선은 관심의 보라색 영역 내의 각 수평 라인의 화소의 평균이다. 파란색 선은 양쪽 끝에서 제로 동일한 데이터입니다. 적색 선은 FFT 계산했다 신호의 개수를 나타내는 고속 푸리에 변환 (FFT) 파워 스펙트럼이다. 하나의 날카로운 체육AK 깨끗한 근절 기록을 의미한다. (B) 근절 길이 및 현장 자극 (2Hz의)에 대한 응답으로의 Fura -2 비율의 동시 녹음. 같은 LV의 근절 길이 대의 Fura 2 비율 (C) 단계면 플롯을 심근 (이러한 매개 변수의 실제 길이 모두 /의 Fura 2 비율과 델타의 변화를 분석한다). EC 50 (50 % 완화에서의 Fura 2 비율, 화살표 원) 그룹 사이의 myofilament 칼슘 감도의 질적 비교입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 가짜 및 고혈압 쥐에서 LV의 심근 수축의 분석 3. 대표 결과. (A) 근절 (S)의 원시 흔적hortening과의 Fura - 가짜 및 고혈압 쥐에서 LV의 근육 세포에서이 비율 측정 (B) 근절 길이의 Fura의 평균 추적 -.이 신호. 두 그룹 - 2 근절 길이 대 잡음비 (이러한 파라미터 2 비 델타 변화 모두 실제 길이와의 Fura -) 평균 미량 분석 매개 변수는 테이블에서의 Fura 1. (C) 상 평면 플롯을 나타낸다 . 궤도 루프는 오른쪽으로 이동하고, EC (50)는 myofilament 칼슘 탈감작 제안 고혈압 높은 경향이있다. PT는 시간 (초) 피크; 50 %의 이완 (초) 시간 : .TR 50 - 타우, 칼슘 2 + 과도 부패 (초)의 시간 상수 (지수 함수와 2 비율의 Fura의 쇠퇴 단계 피팅에 의해 얻어진). 
더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의.
| 매개 변수 | 가짜 | 고혈압 | |
| 세포 내 칼슘 2 + | 이완기 칼슘 2 + | 1.189 | 1.124 |
| 수축기 칼슘 2 + | 1.71 | 1.691 | |
| 진폭 (Δ 비) | 0.521 | 0.567 | |
| 피크 시간 (PT,들) | 0.021 | 0.031 | |
| 타우 (들) | 0.079 | 0.076 | |
| 근절 | 이완기 | 1.758 | 1.78 |
| 근절 길이 (μm의) | |||
| 근절 | 0.122 | 0.115 | |
| 쇼트닝 ((16); 길이, mm) | |||
| 피크 시간 (PT,들) | 0.064 | 0.055 | |
| 50 % 시간 | 0.032 | 0.03 | |
| 휴식 (TR 50, S) | |||
| EC50 | [칼슘 2 + 50 %의 근절의 relengthening에 대한 전 (의 Fura-2 비율) | 0.2382 | 0.3224 |
의 Fura 표 1. 분석 - 2 비율 (세포 내 칼슘 2 +) 및 근절 길이 측정.
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Discussion
여기서 우리는 하나의 고립 된 심장 근세포에 myofilament 칼슘 감도의 변화를 평가하기 위해 프로토콜을 설명하고이 전기 생리 특성과 함께 매개 변수, 세포 내 칼슘 2 + 과도 및 myofilament 역학 측정의 중요성을 강조한다. 하나 또는 두 개의 매개 변수의 녹음은 심장의 수축과 이완을 기본 메커니즘을 해명하지 않을 수 있기 때문입니다. 심근의 수축과 세포 내 칼슘 2 + 프로필 개별적으로 1을 측정하는 기존의 방법과는 달리, 본 발명의 방법은 동시에 같은 심장 근육 세포에서 두 매개 변수를 검사합니다.
다수의 방법은 일반적으로 근육 세포질 15, 16, 17, 예를 들어, 피부가 근육 세포에서 외인성 카 사이의 상호 작용의 시험 2+ 및 근절 / 셀 길이 / 장력 myofilament 칼슘 민감성을 평가하기 위해 사용(예를 막을 Permeabilize 하시려면하는 사포닌 또는 β-esin 같은 세제로 처리). 길이는 힘 센서 또는 탄소 섬유)와 포토 다이오드 레이저 회절 기술 및 장력을 측정한다. 그들은 myofilament 칼슘 민감성의 정량적 평가를 가능하게하기 때문에이 기술은 널리 근육 연구에 사용된다. 그러나, 세포막 및 세포 내 칼슘 처리 내인성 이온 채널 활동이 해당가 myofilament의 메커니즘을 개시해야, 이들 기술에 무시된다. 또한, 연구중인 근육 스트립 또는 근세포 미리 연신 특정 이완기 길이로하고, 이러한 조건에서 초기 근절 길이 (특히 질병 상태 및 간섭)와 근세포의 실제 이완기 길이가 다를 수있다. 이것은 포괄적 evalu있게 세포 소기관함으로써 상대적으로 섭동 유지 전류 측정의 장점을 강조심근의 수축 기능의 ATION.
이해할 수는 근육 세포 (칼슘 2 + -tolerating)과의 Fura의 최적의로드의 품질 - 오전 2시는 myofilament 칼슘 감도의 성공적인 평가를위한 두 가지 핵심 요소이다. (이전 18,19,20 바와 같이 총 세포를 60 ~ 80 %) 때문에, 여러 가지 변형이 가능한 막대 형상 근세포를 얻기 위해 프로토콜에 적용된다. 우선, 칼슘 저용량는 소화 공정 (예는 칼슘 농도의 콜라게나 제 용액에서 50 μM 및 저장 용액 200 μM 임) 중 용액에 첨가한다. 둘째, 분해 과정 중 BSA는 막의 안정성을 향상시키기 위해 콜라게나 제 용액을 첨가한다. 셋째로, 해결책은 대부분 기능성 심근 세포의 비율 및 실험 시간 (6-8 시간)을 향상시켜 분리 중에 산소된다. 넷째, 고립 된 근육 세포는 스토리지 솔루션 (C)에 보관ontaining 200 μM 칼슘.
의 Fura 오전 2시 최적 로딩을 얻기 위해 서로 다른 칼슘 농도 (250, 500 μM)가 사용되며, 폴록 사머 407 (2 μL가 20 % 디메틸 술폭 시드 제조)가 막을 통과의 Fura-오전 2시의 투과성을 향상시키기 위해 첨가되며 근육 세포의 안정성. 모든 칼슘 인디케이터 염료 칼슘 버퍼 (21)가 있음을 주목해야한다. 따라서, 연구진은 과도한 버퍼링 및 감소 심근의 수축력을 피하기 위해의 Fura-2 오전 고농도 또는 장기간 배양을 사용하지 않아야합니다. 2로드 정기적으로 심근의 품질과로드 상태를 추정하기 위해 필수적인 단계 인 체크 -의 Fura없이 심근 수축하는 것이 좋습니다. 부하의 변동은 불가피하다. 그러므로, 챔버에서 심근 세포를 수축의 수는 이전과 유사한 여부, 구체적으로는, 심근 수축의 변화를 확인하는 것이 중요따고로드. 그들은 근육 세포의 평균 상태를 표시하지 않고 편향된 결과와 평가를 일으킬 수 있기 때문에 하이퍼 또는 저자 극성 계약 근육 세포의 분석은 피해야한다.
의 Fura 2 비의 측정 된 변화는 세포 내 Ca2 + 수준의 반사보다는 칼슘의 실제의 화학적 농도가 있음에 유의해야한다. 따라서, 여기에 기재된 방법은 myofilament 칼슘 민감성 질적 변화보다는 칼슘에 myofilaments 실제 감도를 평가한다. 의 Fura의 교정 - 세포 내 칼슘 이온 농도 2 신호는 각각의 근육 세포에서 안정적인 칼슘 농도를 취득 할 수있는 솔루션입니다. 오전 2시 (칼슘 0에서 39 μM까지 2+ 농도), 얻어진은 Fura - - 교정 절차는 칼슘의 다양한 농도로로드 근육 세포가 필요 2+의 Fura을 π 공역이 비는 번째로 계산된다전자 다음 수식 : [칼슘 2 +] I = Kd를 * (R - Rmin을) / (Rmax로 - R) * F380max / F380min 21. 그러한 교정 절차를 칼슘 농도로 풀링 된 평균값을 도출 할 수있다. 칼슘 지표 로딩 개별 셀에서 수행되지 않습니다 근육 세포 및 교정 중 변수이기 때문에, 칼슘 농도를 정확하게 획득 할 수 없습니다. F360 / F380은 (본 연구에서와 같이) F340 / F380보다는 측정되는 경우 (F360이의 Fura-2 형광 (22)의 isobestic 파장이기 때문에) 또한, 상기의 Fura 2 비율은 덜 정확하다. 그럼에도 불구하고, 여전히 특히 myofilaments이 병용 세포 내 환경 변화 이후에 변경 될 수 있습니다 병에 걸린 인간의 마음에 생리 학적 실험에서 myofilament 칼슘 감도 질적 변화를 평가하는 유효한 방법이다. (이 방법은 다른 방법과 결합하는 것이 좋습니다로 드정확하게 칼슘에 myofilaments의 진정한 민감도를 분석하기 위해) 토론 섹션에서 이전에 스크라이브.
심근 수축 연구 방법의 다른 제한은 무부하 상태이다. 이 과소 평가 또는 myofilament 칼슘 감도의 변화를 과대 평가 할 수 있습니다. 따라서, 정확하게 myofilament 칼슘 민감도를 평가, 분석은 질적, 양적 평가를위한 대안 측정을 수행해야합니다.
이 기술은 인간의 심장 세포의 산화 환원 환경과 전사 후 변형이 변경 샘플, myofilament 기능에 수반하는 변화의 결과를 포함하여 건강하고 병에 걸린 마음에 심근 기능을 평가하기위한 적용 할 수있다. 특히, 이온 채널, 세포 내 이온 항상성의 조절 단백질 myofilaments 대화식이고; 따라서, 이러한 모든 구성 요소는 concer에서 작동합니다 (심 초음파로 측정, 예를 들어) t는 생체 내 마음의 성능을 확인합니다.
결론적 myofilament 칼슘 감도의 변화를 평가하는 방법을 설명하고 심근 기능의 전체 프로파일을 얻기 위해 심장 전기 생리학과 관련하여 세포 내 칼슘 처리, 심근 수축이 매개 변수 분석의 중요성을 강조한다. Myofilament 칼슘 감도는 병에 걸린 심장 모델, 이러한 매개 변수의 변화뿐만 아니라 다양한 세포 내 신호 전달 경로가 상호 연관되어 사용 역학적 연구에서 정기적으로 측정해야한다.
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Acknowledgments
이 연구는 교육 과학 기술부 (2013068067)에 의해 투자 한국 연구 재단 (NRF)를 통해 기초 과학 연구 프로그램에 의해 지원되었다; 교육 과학 기술부, 서울 대학교 병원, 고혈압 학회 (2013), SK 텔레콤 연구 기금의 한국 교육부의 두뇌 한국 (21) 대학원 프로그램에 의해 (NO. 3420130290)를 중국의 국립 자연 과학 재단 (NSFC 31460265; NSFC 81260035).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
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