Abstract
insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas são as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. No entanto, o mecanismo de patogênese e mau funcionamento do miocárdio no coração doente continua a ser totalmente esclarecido. Provas convincentes recente demonstra que as mudanças na miofilamentos Ca 2+ sensibilidade afetam Ca 2+ intracelular atividades homeostase e canais iônicos em miócitos cardíacos, os mecanismos essenciais responsáveis pelo potencial de ação cardíaco e contração em corações saudáveis e doentes. De facto, as actividades dos canais de iões e transportadores subjacentes potenciais de acção cardíaca (por exemplo, Na +, Ca 2+ e os canais de K + e Na + -Ca 2+) e proteínas de permutador de Ca 2+ intracelular de manuseamento (por exemplo., Os receptores de rianodina e Ca 2 + -ATPase no retículo sarcoplasmático (SERCA2a) ou fosfolambam e a sua fosforilação) são convencionalmente medido para avacomeu os mecanismos fundamentais do acoplamento excitação-contração cardíaca (CE). Ambas as atividades elétricas na membrana e Ca 2+ alterações intracelulares são os sinais de disparo de acoplamento CE, enquanto miofilamentos é a unidade funcional de contração e relaxamento, e miofilamentos Ca 2+ sensibilidade é imperativo na implementação de desempenho miofibrila. No entanto, poucos estudos incorporar miofilamentos Ca 2+ sensibilidade para a análise funcional do miocárdio, a menos que é o foco do estudo. Aqui, descrevemos um protocolo que mede sarcomere encurtamento / re-alongamento eo nível de Ca2 + intracelular usando Fura-2 AM (detecção ratiometric) e avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca 2+ em miócitos cardíacos de corações de ratos. O principal objetivo é enfatizar que miofilamentos Ca 2+ sensibilidade deve ser levado em consideração no acoplamento CE para análise mecanicista. investigação detalhada do iem canais, transportadores iônicos, intracelular de manipulação de Ca2 +, e miofilamentos Ca 2+ sensibilidade que fundamentam a contratilidade dos miócitos em corações saudáveis e doentes irá fornecer informações valiosas para a concepção de estratégias mais eficazes de translação e valor terapêutico.
Introduction
Acoplamento de excitação-contracção cardíaca (CE) é o esquema fundamental para analisar as propriedades mecânicas do miocárdio, ou seja, a função contráctil do coração 1,2. CE de acoplamento é iniciado pela despolarização da membrana secundária para as actividades dos canais de iões de sarcolema (por exemplo, a voltagem-canal de Na +, que pode ser medido através de técnicas de patch-clamp). Activação subsequente do tipo L dependentes da voltagem canais de Ca2 + (LTCCs) e influxo de Ca2 + através LTCCs desencadear a grandes quantidades de libertação de Ca2 + através dos receptores de rianodina (RyRs), aumentando a concentração citosólica de Ca2 + a partir do nanomolar (nM ) a micromolar nível (^ M). Um tal aumento no Ca 2+ citosólica de Ca2 + promove a ligação à troponina C (TNC) em filamentos finos e induz alterações conformacionais do complexo filamento para facilitar a interacção actina-miosina e alcança myocardial contração 3. Por outro lado, o Ca2 + citosólico é re-captado volta para o retículo sarcoplasmático (RS) através da Ca2 + -ATPase em SR (SERCA2a) ou é extrudada para fora do miócito através do Na + / Ca2 + e o permutador de plasmalemmal Ca2 + ATPase 1,2. Consequentemente, o declínio no Ca 2+ citosólico instiga mudanças conformacionais de filamentos finos de volta ao estado original, resultando na dissociação da actina-miosina e miócitos relaxamento 1-3. Neste esquema, a actividade da SERCA2a é geralmente considerada para determinar a velocidade de relaxamento do miocárdio porque é responsável por 70 - 90% de remoção citosólica de Ca2 + na maioria das células de mamífero do coração 1. Como tal, anormal manipulação de Ca 2+ por LTCC, RyR e SERCA2a, etc. tem sido considerado os mecanismos principais para comprometimento da contratilidade e relaxamento no coração doente 1-4.
de Ca2 +, que funciona como o mensageiro em contas de acoplamento CE para cerca de 1% do total de Ca 2+ e a maioria dos Ca 2+ é obrigado a intracelulares de Ca2 + buffers 5,6. Isto é devido ao facto de vários tampões Ca 2+ são abundantes em miócitos cardíacos, por exemplo, fosfolípidos de membrana, ATP, fosfocreatina, a calmodulina, a parvalbumina, miofibrila TnC, miosina, SERCA2a, e calsequestrin no SR. 5,6,7. Entre eles, SERCA2a e TnC são as predominantes Ca 2+ buffers 5,6,7. Além disso, o Ca 2+ ligação aos seus tampões é um processo dinâmico durante tique (por exemplo, 30-50% de Ca 2+ se liga a TnC e dissociam-se que durante os transientes de Ca2 + 7) e a alteração no Ca 2+ causa adicional de ligação "libertação" de Ca2 + livre para o citosol, os resultados nas alterações do Ca2 + intracelular concentration. Consequentemente, a perturbação do nível intracelular de Ca 2+ induz movimentos miofilamentos anormais, que são os precursores da disfunção contráctil e arritmias 8,9. Muitos factores (tanto fisiológicos e patológicos) podem ser as fontes de modificações pós-transcricionais de proteínas miofilamentos, que influenciam miofilamentos Ca 2+ e de tamponamento miofilamentos Ca 2+ sensibilidade 8-10. Recentemente, foi relatado que mutações em proteínas miofilamentos aumentar o Ca2 + intracelular e a afinidade de ligação a manipulação de Ca2 +, desencadeando a potenciação dependente de pausa de transientes de Ca2 +, Ca2 +, libertação anormal e arritmias 8. De acordo com este conceito, mostrámos também que miofilamentos Ca 2+ dessensibilização em corações de ratos hipertensos secundárias à sobre-regulação da sintase do óxido nítrico neuronal está associada com elevada diastólica e sistólica Ca 2+ níveis11, que por sua vez, aumenta a vulnerabilidade do LTCC ao Ca2 + inactivação dependente 12. Assim, miofilamentos Ca 2+ sensibilidade é um regulador "ativo" da função contrátil intracelular de Ca2 + homeostase e miócitos. Tornou-se necessário analisar as interacções entre miofilamentos e Ca 2+ manipulação proteínas para investigação aprofundada sobre miócitos acoplamento CE e função cardíaca.
Aqui, descrevemos um protocolo que avalia as mudanças de miofilamentos Ca 2+ sensibilidade em miócitos cardíacos isolados. Análise abrangente do intracelular perfil Ca 2+, miofilamentos Ca 2+ sensibilidade e contração vai descobrir novos mecanismos mecânicos do miocárdio subjacentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo está de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicados pelos Institutos Nacionais da ONU de Saúde (NIH Publication No. 85-23, revista em 1996). Foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional de Seul (aprovação IACUC no .: SNU-101213-1).
1. Tampão de Preparação (Materiais de mesa e equipamentos)
- Preparar 300 ml de solução de isolamento de fresco no dia da experiência (em mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl2, 3,5; glicose, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4; taurina, 20; pH 7,4 com NaOH).
- Preparação de 100 ml de solução de armazenamento de fresco no dia da experiência (em mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO4 5; CaCl2 0,2; de sódio e piruvato 5; glucose 5,5; taurina 20; HEPES 10; manitol 29; pH 7,4 com NaOH).
- Prepare 1 litro de solução de perfusão (em mM: NaCl, 141,4; KCI, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MGCL 2, 1; HEPES, 10; glicose, 5,5; CaCl2, 1,8; manitol, 14,5; pH 7,4 com NaOH).
- Preparar 30 ml de uma solução de colagenase, adicionando colagenase (1 mg / ml), a protease (0,1 mg / ml), albumina de soro bovino (BSA, 1.67mg / ml), e Ca2 + (0,05 mM) a 25 ml de isolamento solução.
- Preparar 20 ml de solução de colagenase 2 por adição de colagenase (1 mg / mL), BSA (1,67 mg / ml), e Ca2 + (0,05 mM) a 16,7 ml de solução de isolamento.
- Preparar 40 ml de solução de BSA através da adição de 0,4 g de BSA a 40 ml de solução de isolamento. Separado 10 ml e 30 ml em duas provetas. Adicionar Ca 2+ a 30 ml de solução de BSA de modo que a concentração final de Ca2 + em solução de BSA a 1 mm.
2. Preparação para o isolamento de Left ventricular (LV) miócitos
- Transferir 8-12, ratos semanas de idade do sexo masculino Sprague-Dawley (SD) em gaiolas de transporte não poluentes do biotério para a sala de preparação e isolamento.
- Hcomer dois banhos de água a 37 o C.
Nota: Utilize banho de uma água para a água - reservatório encamisado e os tubos de perfusão do sistema de perfusão Langendorff. Use outro banho de água para agitar troncos de tecido do miocárdio, a fim de separar os miócitos individuais. - Adicionar 5 ml e 3,3 ml de solução de BSA (sem Ca2 +) para 25 ml de solução de colagenase 1 e 16,7 ml de solução de colagenase 2 para perfazer o volume para 30 ml e 20 ml, respectivamente.
- Adicionar solução de isolamento (100 ml) e solução de colagenase 1 (30 ml) a uma coluna (Cl 1) e a coluna 2 (Cl 2) no sistema de perfusão de Langendorff, respectivamente (Figura 1A).
- Oxigenar a solução de isolamento e uma solução de colagenase em Cl 1 e Cl 2 através do tubo de ligação de oxigénio no sistema de perfusão de Langendorff (Figura 1A). Da mesma forma, a solução de colagenase oxigenado 2 e a solução de BSA no banho de água com agitação, com 100% de O2 através datubo de ligação de oxigênio.
3. Isolamento de LV miócitos
- Anestesiar uma ratazana SD por meio de injecção intraperitoneal de pentobarbital sódico (30 mg / kg) e confirmar o estado anestésico por dedo do pé que comprime e falta de retirada reflexão.
- Mova o rato para uma bandeja de dissecação. Na posição supina, fixe as quatro pernas para os lados do corpo com fita.
- Aplicar incisões mid-axiais com tesouras cirúrgicas torácicas para abrir a caixa, garantindo a não danificar o coração. Use um outro par de tesouras limpas para dissecar o coração dos vasos comunicantes (por exemplo, superior e inferior da veia cava, vasos pulmonares e aorta) e membrana de pericárdio 13.
- Deixar uma porção da aorta de um comprimento suficiente (5-8 mm), prender a aorta, com uma pinça fina e montar rapidamente a cânula do sistema de perfusão de Langendorff dentro de 1 min (Figura 1A). Amarre fio de sutura 4/0 firmemente sobre a aorta.
- Desmontar o coração digerido por corte da aorta e transferi-lo, mantendo a aorta com uma pinça para o balão contendo uma solução de isolamento fresco (Figura 1bi). Use uma tesoura fina e pinças para cortar a maior parte de parede livre do VE (incluindo o septo) em pedaços menores (~ 22 mm, Figura 1Bii).
- Transferir os pedaços para um frasco contendo uma solução de colagenase fresco pré-aquecido e oxigenado 2 (Figura 1Biii). Agitar durante 10 min. Manter a entrega de oxigênio para a solução de colagenase contendo miócitos 2.
- Mova o miócitos - suspensão para um tubo de 10 ml de centrífuga usando conta-gotas com um bulbo de sucção e adicionar Ca 2+ - contendo solução de BSA (1: 1 em volume). Centrifugar a 30 g durante 2 min e desprezar o sobrenadante. Re-suspender o sedimento de miócitos em 5 ml de solução de BSA. Centrífuga e descartar o sobrenadante.
- Dispersar os peletes de miócitos e manter miócitos em 10 ml de solução de armazenamento de pré-oxigenado à TA (Figura 1Biv-VI).
- Repita os passos processuais (3,7-3,9) com o tecido do LV restante no frasco.
Nota: Manter repetindo os procedimentos (passos 3,7-3,9) novamente até que a maior parte do tecido do LV desaparece para se obter um bom rendimento de miócitos. - Manter os miócitos em solução de armazenamento para 6-8 horas a temperatura ambiente, até ao fim das experiências.
4. As medições simultâneas de Ca2 + intracelular Transitórios e miócitos Contração
- miócitos carga LV com o éster de acetoximetilo de Fura-2 AM (2 | iM).
Nota: Execute todos os procedimentos de carga e experiências com miócitos carregados em um tubo escuro (Figura 1Bvii).- Centrifuge a suspensão de miócitos (1 ml) a 2000 xg durante 10 seg. Descartar o sobrenadante e re-suspender o pellet de miócitos em 1 ml de solução de Tyrode com uma baixa concentração de Ca2 + (250? M, Materiais de mesa e equipamentos).
- Adicionar Fura-02:00 e poloxamer 407 (2 mL), suavemente dispersar a suspensão de miócitos, e manter a mistura temperatura ambiente (20-24 ° C) durante 15 minutos (Figura 1Bvii).
- Centrífuga-se a mistura durante 5 seg, descartar o sobrenadante e dispersar o sedimento de miócitos em 1 ml de solução de perfusão contendo 500 uM de Ca 2+. Depois de 10 minutos, centrifugar a mistura durante 5 seg e desprezar o sobrenadante.
- Adicionar solução de perfusão fresco (500 | iM de Ca2 +, 1 ml) e manter o Fura-02:00 - sedimento miócito carregado nesta solução de gravação.
- A medição da contracção dos miócitos e Ca2 + intracelular
- Antes de gravar, encher o tubo de perfusão que é executado através de umacamisa de água com a solução de Tyrode, que é pré-aquecido a 36 o C.
- Coloque algumas gotas do Fura 02:00 - carregado suspensão de miócitos LV na câmara de um microscópio de fluorescência invertido para 5-8 min. Lentamente perfundir a solução de Tyrode (2,2 ml / min).
- Pressione o botão "start" no painel frontal do estimulador digital para iniciar a estimulação de campo (2 Hz).
Nota: A tensão de saída (10 V, 5 mseg de duração) é aplicado aos miócitos na câmara por meio de fios de platina posicionados em ambos os lados da câmara.- Seleccione miócitos que se contraem de forma estável (não aqueles que apresentam hiper ou hipo-contração) para a gravação.
- Ajuste do miócito de escolha na posição horizontal do sistema de detecção à base de sarcómero vídeo e ajustar a focagem do microscópio, para obter imagens óptimas de sarcómeros. Posicionar a caixa retangular roxo na área em que sarcômeros claras são claramente observados até a médiade comprimentos de sarcômero (pico vermelho) mostra um pico singular afiada (Figura 2A, imagem inferior).
- Gravar as mudanças de comprimento do sarcómero em resposta à estimulação do campo (Figura 2A e B).
Nota: Use os miócitos carregados dentro de 1 - 2 horas. - Ajustar a abertura da câmara de modo a que o campo no sistema de detecção à base de sarcómero vídeo é o tamanho do miócito (Figura 2A). Estimular a miócitos com excitação a 360 nm / 380 nm e emissão a 510 nm (freqüência de aquisição de 1.000 Hz). Encurtamento do sarcômero Record e a relação Fura2 AM com estimulação de campo (Figura 2B).
5. Avaliação de miofilamentos Ca2 + Sensibilidade
- Calcular a média dos comprimentos de sarcômero e Ca 2 + transientes no estado estacionário (10 - 20 traços) e traçar o ciclo do plano de fase da relação de Fura-2 vs. comprimento do sarcômero do mesmo miócitos (ambos com valor medidos e delta mudanças; Figura 2c).
- Em cada parcela, definir rácio Fura -2 a 50% de relaxamento (EC50, Figura 2C). Compare tanto o loop e EC 50 de cada intervenção.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
miócitos do VE são isolados de corações normais e hipertensos ratos. Miócitos em forma de haste com estrias claras (representando sarcómeros) e contracções estáveis em resposta à estimulação do campo são considerados os miócitos óptimos e são seleccionados para gravações (Figura 2A). No exemplo mostrado na F igura 2A, uma Fura 02:00 -loaded miócitos está posicionado horizontalmente e a abertura da câmara é ajustado de modo que o miócito ocupa a maior parte do campo de gravação mínima e área de fundo está incluído. No campo da gravação, ajuste as dimensões da caixa roxa, clicando e arrastando esta caixa na tela do computador (através do programa de gravação). Quando o comprimento médio sarcomere mostra um pico vermelha afiada, iniciar a gravação (Figura 2A, imagem inferior).
Ambos comprimento do sarcômero e intracelular de Ca2 + transie NTS (fura-2) relações são gravados simultaneamente a partir dos mesmos miócitos (Figura 3A). Os traços de comprimento médio sarcómero e Ca 2+ transientes são mostrados na Figura 3B. Individualmente, comprimentos diastólica / sistólica sarcômero, tempo de pico (PT), e encurtamento do sarcômero são medidos para investigar a amplitude e dinâmica da contratilidade dos miócitos. Tempo para 50% de relaxamento (TR 50) é analisada para avaliar o relaxamento do miócito. Da mesma forma, a pressão sistólica e diastólica Fura-2 relações de (Ca 2 + transientes), o tempo até ao pico (PT) de transientes de Ca 2+ e constante de tempo de decaimento transiente de Ca 2+ (tau) são analisados para avaliar a contracção e relaxamento do miócito (Tabela 1). Neste exemplo, as amplitudes dos transientes de Ca2 + são moderadamente aumentado em miócitos do LV a partir de uma ratazana hipertensa e contracção é moderadamente reduzido (Figura 3B e Quadro 1).
conteúdo "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Além disso, as relações entre o Fura - 2 proporção e comprimento do sarcômero (indicando a miofilamentos Ca 2+ sensibilidade dos miócitos do VE) são representados em ambos os ratos sham e hipertensos ( . Figura 3C) o Fura 2 - sarcómero trajectória comprimento durante a fase de relaxamento do miócito define um quasi-equilíbrio de citosol de Ca2 +, Ca2 + miofilamentos de ligação, e o comprimento sarcómero 14 e, portanto, a fase de relaxamento é comparada entre os dois grupos. o desvio para a direita da trajectória em miócitos do grupo que indica uma resposta hipertensiva miofilamentos reduzida a Ca 2+ (Figura 3C). Assim, a concentração intracelular de Ca2 + necessário para que metade de relaxamento (EC50) é aumentada (Figura 3C) , referindo-se a Ca2 + miofilamentos -desensitization na hipertensão.Figura 1. Procedimentos para isolar miócitos do VE de coração de rato. (A) O sistema de perfusão de Langendorff utilizada para perfundir a solução de isolamento para o coração canulados através da aorta (inserção, a imagem ampliada do coração montado no sistema de perfusão) (B) I - III:. O coração após a digestão com uma solução de colagenase 1 e dissecados de tecido do LV em um prato e frasco (B) IV - VI:.. suspensão de miócitos, após a adição de solução de colagenase 2, sedimento de miócitos após centrifugação e re-suspensas sedimento de miócitos em solução de armazenamento (B) VII: incubação, incubar LV miócitos em Fura 02:00 - solução contendo o isolamento (2 | iM de Fura 2:00, 250 uM de Ca2 + e com 2 ul de poloxâmero 407); lavagem, lavagem com solução de miócitos LV isolamento com 500 uM de Ca2 +; armazenamento, manter Fura-2 AM - miócitos do VE carregados nosolução de isolamento fresco contendo 500 mM de Ca2 +. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Medição de encurtamento sarcómero e o rácio de Fura-2 (indicativo do nível intracelular de Ca2 +). (A) Um diagrama de sarcómero, uma imagem de um Fura-2 miócito -loaded LV e o comprimento sarcómero média (o pico vermelha) são apresentados no computador. Na parte inferior do painel, a linha preta representa a média de cada linha horizontal de pixels na região púrpura de interesse. A linha azul são os mesmos dados repostos a zero em cada extremidade. A linha vermelha representa a transformada de Fourier rápida espectro de potência (FFT), o qual representa o número de sinais a FFT foi calculado. Uma pe afiadaak significa uma gravação sarcómero limpo. (B) gravações simultâneas de comprimento sarcómero e o rácio de Fura -2 em resposta à estimulação do campo (2 Hz). trama (C) do plano de fase do rácio Fura 2 vs comprimento sarcómero do mesmo LV miócitos (note que tanto o comprimento real / Fura 2 ratio e delta alterações destes parâmetros são analisados). CE 50 (Fura 2 relação a 50% de relaxamento, círculo indicado pela seta) é a comparação qualitativa dos miofilamentos Ca 2+ sensibilidade entre os grupos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Os resultados representativos das análises de contração dos miócitos do VE em sham e ratos hipertensos. (A) vestígios-primas de sarcomere shortening e Fura - 2 de medição da relação em miócitos do VE de farsa e ratos hipertensos (B) traços médios do comprimento do sarcômero e Fura -. 2 sinais. Os parâmetros analisados nos traços médios estão apresentados na Tabela 1. (C) parcelas do plano de fase do Fura 2 - relação vs comprimento sarcómero (tanto o comprimento real e Fura - 2 Relação de delta e as alterações destes parâmetros) nos dois grupos . O loop trajetória é deslocado para a direita e EC 50 tende a ser maior na hipertensão, sugerindo miofilamentos Ca 2+ dessensibilização. PT, tempo até ao pico (s); Tau, constante de tempo de decaimento transiente de Ca 2+ (seg) (obtida ajustando a fase de declínio da Fura - 2 relação com uma função exponencial) .tr 50: Tempo para 50% de relaxamento (seg). 
Por favor clique aqui para ver uma versão maiordesta figura.
| parâmetros | fraude | Hipertensão | |
| Ca2 + intracelular | Diastólica Ca 2+ | 1.189 | 1.124 |
| Sistólica Ca 2+ | 1,71 | 1.691 | |
| Amplitude (Δ rácio) | 0,521 | 0,567 | |
| Tempo até ao pico (PT, s) | 0,021 | 0,031 | |
| Tau (s) | 0,079 | 0,076 | |
| sarcômero | diastólica | 1.758 | 1,78 |
| comprimento do sarcômero (mm) | |||
| sarcômero | 0,122 | 0,115 | |
| Encurtando (16; comprimento, mm) | |||
| Tempo até ao pico (PT, s) | 0,064 | 0,055 | |
| Tempo para 50% | 0,032 | 0,03 | |
| Relaxamento (TR 50, s) | |||
| EC50 | [Ca 2+] i (Fura-2 ratio) para 50% relengthening sarcomere | 0,2382 | 0,3224 |
Tabela 1. Análise da Fura - 2 Ratio (intracelular de Ca2 +) e sarcômero medições de comprimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca 2+ em um único miócitos cardíacos isolados e enfatizar a importância de se medir este parâmetro juntamente com propriedades eletrofisiológicas, intracelulares de Ca2 + transientes, ea dinâmica dos miofilamentos. Isto é porque as gravações de um ou dois dos parâmetros não podem explicar os mecanismos subjacentes a contracção cardíaca e relaxamento. Ao contrário dos métodos convencionais que medem a contração dos miócitos e o Ca2 + intracelular perfil individual 1, o presente método examina ambos os parâmetros simultaneamente na mesma miócitos cardíacos.
Um número de métodos são geralmente utilizados para avaliar a sensibilidade dos miofilamentos de Ca2 + de miócitos músculos ou 15,16,17, por exemplo, análise das interacções entre o Ca 2+ e exógeno sarcómero / comprimento células / tensão em miócitos pele(Tratados com detergentes, tais como saponina ou β-esin para permeabilizar a membrana). Comprimentos são medidos com foto-diodo e técnicas de difração de raios laser e tensão com transdutores de força ou fibras de carbono). Estas técnicas são largamente utilizadas em estudos musculares porque permitem avaliações quantitativas de miofilamentos Ca 2+ sensibilidade. No entanto, as actividades do canal de iões endógenos na membrana de plasma e intracelular de Ca2 + manuseamento, aqueles são necessários para iniciar a mecânica de miofilamentos, são negligenciadas nestas técnicas. Além disso, as tiras de músculo ou de miócitos em estudo são pré-esticado até um determinado comprimento diastólica, e sob estas condições, o comprimento do sarcómero inicial pode ser diferente do comprimento diastólica real dos miócitos (especialmente em condições de doença e com intervenções). Isto evidencia a vantagem de a medição de corrente, onde organelos celulares permanecem relativamente não perturbada, desse modo, permitindo que o ava abrangenteção da função dos miócitos contrátil.
Compreensivelmente, a qualidade dos miócitos (Ca 2+ -tolerating) e a carga ideal de Fura - 2AM são dois elementos-chave para a avaliação positiva dos miofilamentos Ca 2+ sensibilidade. Assim, várias modificações são aplicados para o protocolo, a fim de obter os miócitos em forma de bastonete viáveis (60-80% do total de células, como descrito anteriormente 18,19,20). Em primeiro lugar, uma dose baixa de Ca2 + é adicionada às soluções durante os processos de digestão (por exemplo, a concentração de Ca2 + é de 50 uM nas soluções de colagenase e 200 ^ M em solução de armazenamento). Em segundo lugar, durante o processo de digestão, BSA é adicionada às soluções de colagenase para melhorar a estabilidade da membrana. Em terceiro lugar, a maioria das soluções são oxigenada durante o isolamento, o que aumenta a percentagem de miócitos funcionais e a duração das experiências (6-8 h). Em quarto lugar, miócitos isolados são mantidos em armazenamento solução containing 200 uM de Ca 2+.
Para obter o carregamento optimizado com Fura 02:00, dois diferentes concentrações de Ca2 + (250 e 500 um) são usadas e poloxamer 407 (2 uL, a 20% preparada em sulfóxido de dimetilo) é adicionado para aumentar a permeabilidade de Fura-02:00 através da membrana e a sua estabilidade em miócitos. Deve notar-se que a totalidade de Ca 2+ corantes indicadores são tampões Ca2 + 21. Por conseguinte, os investigadores devem evitar o uso de uma concentração elevada de Fura-2 AM ou uma incubação mais longo para evitar excessiva de tamponamento e contractilidade reduzida do miócito. Recomenda-se que a contracção dos miócitos sem Fura - 2 carregamento é rotineiramente verificados, o que é um passo essencial para estimar a qualidade do miócito e o estado de carga. A variabilidade na carga é inevitável. Portanto, é importante para verificar a variabilidade de contracção dos miócitos, especificamente, se o número de contrair miócitos na câmara é semelhante antes e umepois de carregamento. Análise de miócitos hiper ou hipo-contratante devem ser evitados porque eles não representam o estado média de miócitos e pode causar resultados tendenciosos e avaliações.
Deve notar-se que as alterações medidos em relação a Fura 2 são reflexos do nível intracelular de Ca 2+, em vez da concentração química real de Ca 2+. Portanto, o método descrito aqui avalia mudanças qualitativas de miofilamentos Ca 2+, em vez de sensibilidade, a sensibilidade real de miofilamentos ao Ca2 +. Calibração de Fura - 2 sinal para a concentração intracelular de Ca2 + é a solução para adquirir fiáveis Ca 2+ em miócitos individuais. O procedimento de calibração exige que os miócitos do carregamento com várias concentrações de Ca2 + -conjugated Fura - 02:00 (Ca 2+ concentração variando 0-39 uM), e o Fura obtido - 2 proporções são calculadas com the seguinte fórmula: [Ca2 +] i = Kd * (R - Rmin) / (Rmax - R) * F380max / F380min 21. É possível derivar os valores médios reunidos de concentrações de Ca2 + através de um procedimento tal calibração. No entanto, porque a carga de Ca 2+ indicadores é variável entre miócitos e calibragem não é executada em uma célula individual, Ca 2+ não pode ser adquirida com precisão. Além disso, se F360 / F380 é medido em vez de F340 / F380 (como no presente estudo), o rácio de Fura 2 é menos precisa (F360 porque é o comprimento de onda isobestic de Fura-2 fluorescência 22). No entanto, ainda é um método válido para avaliar mudanças qualitativas na sensibilidade dos miofilamentos Ca 2+ em experimentos fisiológicos, especialmente nos corações humanos doentes, onde miofilamentos podem ser concomitantemente alterados após mudanças no ambiente intracelular. Recomenda-se que este método é combinado com métodos alternativos (tal comodescrito anteriormente na seção de Discussão) para analisar com precisão a verdadeira sensibilidade dos miofilamentos ao Ca2 +.
A outra limitação do método no estudo da contracção do miócito é a condição sem carga. Ele pode subestimar ou superestimar as mudanças na miofilamentos Ca 2+ sensibilidade. Portanto, para avaliar com precisão miofilamentos Ca 2+ sensibilidade, análise deve ser realizada com medidas alternativas para a avaliação qualitativa e quantitativa.
A técnica é aplicável para a avaliação da função miocárdica em corações saudáveis e doentes, incluindo amostras cardíacas humanas, onde o ambiente redox celular e modificações pós-transcricional são alterados, resultando em alterações concomitantes nas funções dos miofilamentos. Em particular, canais iônicos, homeostase iônica intracelular e proteínas reguladoras em miofilamentos são interativos; portanto, todos esses componentes funcionam em concert para determinar o desempenho do coração in vivo (por exemplo, tal como medido no ecocardiografia).
Em conclusão, nós descrevemos um método para avaliar as mudanças de miofilamentos Ca 2+ sensibilidade e enfatizar a importância de analisar este parâmetro em conjunto com eletrofisiologia cardíaca, intracelular manipulação de Ca 2+, e contração dos miócitos para obter um perfil completo da função dos miócitos. Miofilamentos Ca 2+ sensibilidade deve ser rotineiramente medido em estudos utilizando modelos mecanísticos coração doente, em que as alterações nestes parâmetros, bem como diversas vias de sinalização intracelulares estão inter-relacionados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2013068067); pelo Programa de Pós-Graduação Cérebro Korea 21 do Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia, Hospital da Universidade Nacional de Seul, a sociedade coreana de Hipertensão (2013), SK Fund Research Telecom coreano (no. 3420130290) e da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC 31460265; 81260035 NSFC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
References
- Bers, D. M., et al.
- Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
- Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
- Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
- Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
- Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
- Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
- Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
- Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
- Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336 (2013).
- Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
- Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
- Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
- Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
- Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
- Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
- Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
- Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
- Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
