Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Beredning av Gushukang (GSK) granulat för in vivo-och in vitro-experiment

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59171
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Denna artikel innehåller ett detaljerat protokoll för beredning av en fungerande lösning av Gushukang granulat för djurstudier och GSK granule som innehåller serum för in vitro-experiment. Detta protokoll kan tillämpas på farmakologiska undersökningar av växtbaserade läkemedel samt recept för både in vivo-och in vitro-experiment.

Abstract

Traditionell kinesisk örtmedicin spelar en roll som en alternativ metod vid behandling av många sjukdomar, såsom postmenopausala osteoporos (POP). Gushukang (GSK) granulat, ett marknadsfört recept i Kina, har ben skyddande effekter vid behandling av POP. Före administrering till kroppen, en standard beredning förfarande är vanligen krävs, som syftar till att främja frisättningen av aktiva beståndsdelar från råa örter och förbättra de farmakologiska effekterna samt terapeutiska resultat. I denna studie föreslås ett detaljerat protokoll för användning av GSK-granulat i experimentella analyser in vivo och in vitro. Författarna ger först ett detaljerat protokoll för att beräkna djur-lämpliga doser av granulat för in vivo undersökning: vägning, upplösning, lagring, och administration. För det andra beskriver den här artikeln protokoll för mikrodatortomografi och mätning av ben parametrar. Provberedning, protokoll för att köra mikro-CT-maskin och kvantifiering av ben parametrar utvärderades. Tredje, serum innehållande GSK granulat bereds, och läkemedelhaltiga serum extraheras för in vitro osteoclastogenes och osteoblastogenes. GSK granulat var intragastrically administreras två gånger per dag till råttor under tre dagar i följd. Blod samlades sedan in, centrifugeras, inaktiveras och filtreras. Slutligen, serum späddes och används för att utföra osteoclastogenes och osteoblastogenes. Det protokoll som beskrivs här kan betraktas som en referens för farmakologiska undersökningar av växtbaserade receptbelagda läkemedel, såsom granulat.

Introduction

Traditionell kinesisk medicin (TCM) är en av de viktiga komplementära och alternativa metoder för att behandla osteoporos1,2. Vatten dekokt är den grundläggande och mest använda formen av formel3. Men nackdelar finns också: dålig smak, olägenhet för transport, kort hållbarhetstid och inkonsekvent protokoll, begränsa användningsområden samt läkande effekter. För att undvika ovanstående nackdelar samt att fullfölja bättre effekter, granulat utvecklades och har använts i stor utsträckning4. Även om många studier har undersökt farmakologiska mekanismer för en eller flera effektiva komponenter från granulatet5,6,7, de exakta mekanismerna och underliggande farmakologiska processer är fortfarande svårt att identifiera. Detta beror på att alltför många effektiva komponenter från en granule kan samtidigt utöva liknande eller motsatta effekter4. Därför, utvecklingen av ett standardprotokoll för att förbereda granulerna innan de levereras till kroppen inte bara skulle ha en stor inverkan på de terapeutiska resultaten men krävs också för både in vivo och in vitro-analyser.

Dessutom är de läkande effekterna av granulat på kliniken svåra att bekräfta och exakt identifiera med hjälp av in vitro-eller ex vivo-studier, vilket skapar en utmaning eftersom de farmakologiska mekanismerna är för komplexa. För att lösa detta, beredning av läkemedel som innehåller serum föreslogs först av Tashino i 1980-talet8. Från och med då, många forskare tillämpade läkemedelhaltiga serum till örtmedicin, inklusive granulat9,10,11. För närvarande, valet av läkemedel som innehåller serum för in vitro-undersökningar betraktas som en strategi som nära härmar fysiologiska tillstånd.

Gushukang (GSK) granulat utvecklades för att behandla postmenopausala osteoporos (POP) baserat på klinisk praxis i ljuset av teorin om TCM. GSK granulat förhindra benförlust hos ovariectomized (OVX) möss in vivo, hämmar osteoklastisk benresorption, och stimulera osteoblastiska benbildning4. Följaktligen fann Li et al.12 att GSK granulat har ben skyddande effekter i OVX möss genom att öka verksamheten i kalcium receptor för att stimulera benbildning. För att bekräfta ben skyddande effekter samt de farmakologiska effekterna av GSK granulat, författarna här ger ett detaljerat förfarande för beredning av arbetslösningar och Drug (GSK granule)-innehållande serum. I denna artikel beskrivs dessutom tillämpningen av GSK-granulat i en OVX-inducerad modell av osteoporotisk mus och GSK-granule-innehållande serum för in vitro-osteoclastogenes/osteoblastogenes.

GSK granulat består av flera örter13,14 och kan helt lösas i saltlösning lätt. Därför är saltlösning fungerar som fordonet. Simulerad mus (Sham) och OVX-möss administrerades i samma volym av saltlösning som de granule-administrerade mössen. De ekvivalentdoserna av GSK-granulat för musen beräknades utifrån meeh-Rubner ekvation15. Denna ekvation har inte bara fördelen av att få säkra doser men också garantier farmakologiska effekter15. De tre doserna av GSK granulat genererades enligt följande: (1) GSKL: OVX + lågdos GSK granulat, 2 g/kg/dag. (2) GSKM: OVX + medelstora GSK granulat, 4 g/kg/dag. (3) GSKH: OVX + hög dos GSK granulat, 8 g/kg/dag. Möss i grupperna GSKL, GSKM och GSKH var intragastriskt administrerade GSK-granulat. Kalciumkarbonat (600 mg/tablett) med vitamin D3 (125 internationell enhet/tablett), till exempel, i en mogen och marknadsförs produkt (t. ex., Caltrate [CAL]) för behandling och förebyggande av osteoporos, användes som en positiv kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella förfaranden utfördes med godkännande av institutionella djuromsorg och användning kommitté för Shanghai University of TCM (SZY201604005).

1. beredning och administrering av GSK-arbetslösning

  1. Beräkna de ekvivalentdoserna av GSK granulat för mus.
    1. Beräkna kroppsyta baserat på meeh-Rubner ekvation15: kroppsyta = k x (kroppsvikt2/3)/1000, där K-värdena är 10,6 för människa och 9,1 för mus. Om man antar en mänsklig kroppsvikt på 70 kg, då människokroppen yta (m2) = 10,6 x (702/3)/1000 = 1,8 m2. Om man antar en mus kroppsvikt på 20 g (0,02 kg; t. ex. 1 månad gammal, hona, C57/BL6), sedan mus kroppens yta (m2) = 9,1 x (0,022/3)/1000 = 0,0067 m2.
    2. Baserat på den beräknade kroppsytan, beräkna kroppen omvandla förhållandet för människa och mus. Människa: 70 kg/1,8 m2 = 39. Mus: 0,02 kg/0.0067 m2 = 3. GSK-granule = 20 g/70 kg x 39/3 = 3,72 g/kg ≈ 4 g/kg.
    3. Baserat på en kroppsvikt på 20 g per mus, beräkna motsvarande dosering för mus: 4 g/kg x 0,02 kg = 0,08 g.
    4. Beräkna tre likvärdiga doser av GSK-granulat baserat på 20 möss per grupp och en intervention som varar i 3 månader (90 dagar): (1) GSKL (OVX + lågdos GSK granulat [2 g/kg/dag]): 0,04 g mus/dag x 20 möss x 90 dagar = 72 g. (2) GSKM (OVX + medelstora GSK granulat [4 g/kg/ dag]): 0,08 g mus/dag x 20 möss x 90 dagar = 144 g. (3) GSKH (OVX + hög dos GSK granulat [8 g/kg/dag]): 0,12 g mus/dag x 20 möss x 90 dagar = 216 g.
      Anmärkning: Bered ytterligare 20% av GSK-granulatet i praktiken för att kompensera för förlusten.
  2. Beräkna volymen av GSK-granule per mus baserat på kroppsvikten15: e.g., volym (V) = 0,24 ml/mus/dag.
    Obs: volymen för intragastrisk administration för mus är 0,12 mL/10 g.
  3. Väg 10-dagarsvärde av tre doser av GSK granulat. Väg upp 8 g, 16 g och 24 g GSK-granulat och servera GSKL, GSKM respektive GSKH.
  4. Beräkna ekvivalentdosen av kalciumkarbonat med vitamin D3 (CAL) för mus baserad på meeh-Rubner ekvation15 som i steg 1.1.1 och 1.1.2: CAL dosering = 2 tablett/70 kg x 39/3 = 0,372 tablett/kg ≈ 0,4 tablett/kg.
  5. Baserat på en kroppsvikt på 20 g per mus (t. ex. 1 månad gammal, Kvinna, C57/BL6), beräkna motsvarande dosering av CAL för mus: 0,4 tablett/kg x 0,02 kg = 0,008 tablett. Beräkna sedan ekvivalentdosen av CAL baserat på 20 möss per grupp och en intervention som varar i 3 månader (90 dagar): 0,008 tablett x 20 x 90 = 14,4 tabletter. Väg 10-dagarsevärde av CAL (1,6 tabletter).
  6. Upplösning
    1. Placera 8 g GSK-granulat i ett 50 mL-rör. Tillsätt 48 mL saltlösning och skaka röret för att helt lösa upp.
      Anmärkning: standarden för fullständig upplösning är frånvaron av sediment. Fullständig upplösning kan bekräftas ytterligare om en sondnål kan dra upp arbetslösningen och sedan utvisa den smidigt.
    2. Upprepa steg 1.5.1 med 16 g och 24 g GSK-granulat.
    3. Placera 1,6 tabletter (10-dagars värde) av CAL i en 50 mL tub. Tillsätt 48 mL saltlösning och skaka röret för att helt lösa upp.
      Obs: arbets lösningarna kan förvaras vid-4 ° c och förberedas var 10: de dag.
  7. Intragastrisk administration
    1. Ta tag i baksidan av musen (1 månad gammal, hona, C57/BL6) med musen riktad framåt och se till att den sitter stadigt i den positionen. Håll musen stilla i 2 − 3 minuter före administrering.
      Obs: se till att forskaren tydligt kan se framsidan av musen. Använd handskar för att förebygga musbett, särskilt för nya forskare.
    2. Placera sondmatning nålen (storlek: #12, 40 mm) i arbetslösningen av GSK granulat och dra 0,24 ml av arbetslösningen.
    3. Sätt sondmatning nålen i musen genom ena sidan av munnen tills sonder nålen når magen.
      Anmärkning: för att bekräfta att sondmatning nålen har nått magen: (1) sonkannålen stöter på känslan av motstånd. Samtidigt visar musen handlingen att svälja innan sondmatning nålen passerar den fysiska förträngning av matstrupen. (2) injicera cirka 0,5 mL av arbetslösningen i musen och vänta i 1 min. Om det inte finns någon lösning som kommer ut ur musen, betyder det att sondnålen har nått magen.
    4. Injicera den arbetande lösningen av GSK-granule (0,24 mL/mus) i magen och dra sedan ut sondnålen. Tillbaka musen i sin bur.
    5. Upprepa steg 1.6.4 med den CAL-lösningen och injicera 0,24 mL CAL-lösning per mus.
      Obs: volymen av CAL-lösningen beräknas som i steg 1,2.

2. Micro-CT-skanning

  1. T Ibia skörd och beredning
    1. Intraperitonealt söva mus med 300 ml/100 g 80 mg/kg ketamin dagen efter 90 dagens intervention. Använd en nål nypa tårna för att bekräfta om musen är helt sövda. Inget svar indikerar lyckad anestesi. Sedan döda musen med livmoderhalscancer dislokation.
    2. Fixera musen med både armar och ben på skum med Tacks.
    3. Klipp av huden med sax (storlek: 8,5 cm) och pincett (storlek: 10 cm) av benen från den proximala till distala änden och sedan skörda Tibias.
    4. Omedelbart sätta förbenade i 70% etylalkohol och tvätta i 3 gånger.
  2. Wrap vänster Tibia av musen med svamp skum och Lägg den i ett prov rör (35 mm diameter, 140 mm längd).
    Anmärkning: preparathets långa axel skall vara tillsammans med provröret. Se till den proximala änden av skenbenet pekar uppåt.
  3. Köra Micro-CT 80 Scan Machine
    1. Starta Micro-CT 80 Scan Machine i rumstemperatur.
    2. Ställ provet röret i Micro-CT 80 och starta tvärsnitt skanning med följande scanning parametrar: pixelstorlek 15,6 μm, rörspänning 55 kV, rör ström 72 μA, integrations tid 200 MS, rumslig upplösning 15,6 μm, Pixel upplösning 15,6 μm och bild mat ris 2048 x 2048.
      Anmärkning: det spongiösa benet skiljer sig från kortikala ben genom för skanning. Skanningsområdet för skenbenet definieras som det spongiösa ben området från 5 mm under tibial-platån till den distala änden.
  4. Kvantifiering av ben parameter
    1. Efter att ha avslutat tvärsnitt skanning, få bilder av den vänstra Tibias.
    2. Ställ in densitetströskeln på 245 − 1000. Använd Micro-CT-utvärderingsprogrammet V 6.6 för att mäta följande ben parametrar: benmineraldensiteter (BMD), ben volym över total volym (BV/TV), trabekulärt ben nummer (TB. N), trabekulärt ben tjocklek (Tb.Th), samt ben separation av bentrabekulär ben ( TB. sp).

3. beredning av blod serum för in vitro-experiment

  1. Beräkning
    1. Baserat på en råtta kroppsvikt på 0,2 kg (1 månad gammal, Kvinna, Sprague-Dawley), beräkna doseringen av GSK Granule: Human dosering/dag x kroppsvikt av humant x K/kroppsvikt av råtta = 20 g/70 kg/dag x 70 kg x K (K = 0,018)/0,2 kg = 2 g/kg/dag.
      Anmärkning: K är den farmakologiska omvandlingskoefficienten mellan människa och mus15 (K = 0,018).
    2. Upprepa steg 3.1.1 och beräkna följande doser.
      1. Beräkna dosering av GSKL: 10 g/70 kg/dygn x 70 kg x K/0,2 kg = 1 g/kg/dygn.
      2. Beräkna dosering av GSKM: 20 g/70 kg/dygn x 70 kg x K/0,2 kg = 2 g/kg/dygn.
      3. Beräkna dosering av GSKL: 40 g/70 kg/dag x 70 kg x K/0,2 kg = 4 g/kg/dygn.
      4. Beräkna dosering av CAL: 2 tablett/70 kg/dag x 70 kg x K/0,2 kg = 0,2 tablett/kg/dag.
    3. Beräkna den totala dosen av GSK-granule och CAL.
      1. Beräkna den totala dosen för GSKL: 1 g/kg/dag x 0,2 kg x 6 råttor x 3 dagar = 3,6 g.
      2. Beräkna den totala dosen för GSKM: 2 g/kg/dag x 0,2 kg x 6 råttor x 3 dagar = 7,2 g.
      3. Beräkna den totala dosen för GSKH: 4 g/kg/dag x 0,2 kg x 6 råttor x 3 dagar = 14,4 g.
      4. Beräkna den CAL doseringen = 0,2 tablett/kg/dag x 0,2 kg x 6 råttor x 3 dagar = 0,72 tablett.
        Anmärkning: totalt 10 mL av GSK-granule-innehållande serum behövs för beredning av 100 mL odlingssubstrat (20% GSK-granule-innehållande serum). Varje råtta (6 råtta/grupp) förväntas ge 1,5 − 2 mL av GSK-granule-innehållande serum efter centrifugering.
    4. Beräkna den volym av GSK-granulat som appliceras per råtta baserat på kroppsvikt15: t. ex. volym (V) = 2 ml/råtta/dag.
      Anmärkning: volymen för intragastrisk administration för råtta är 0,1 mL/10 g.
  2. Väg 3-dagarsvärde av tre doser av GSK granulat. Väg 3,6 g, 7,2 g och 14,4 g GSK-granulat och servera GSKL, GSKM respektive GSKH. Väg 0,72 tablett för CAL-gruppen.
  3. Placera 7,2 g GSK-granulat i ett 50 mL-rör. Tillsätt 36 mL saltlösning och skaka röret för att helt lösa upp. Upprepa detta med 3,6 g och 14,4 g GSK granulat.
  4. Upprepa avsnitt 1,6 för intragastrisk administrering med 2 mL av GSK-arbetslösning.
    Obs: administrera samma volym saltlösning (2 mL per råtta) för att bereda serum och fungerar som en tom kontrollgrupp för in vitro-analyser.
  5. Beredning av GSK-innehållande serum
    1. Intraperitonealt söva råttorna med 300 ml/100 g 80 mg/kg ketamin 1 h efter den sista administreringen av GSK granulat. Använd en nål nypa tårna för att bekräfta om råttan är helt sövda. Inget svar indikerar lyckad anestesi.
    2. Exponera buken till botten av bröstkorgen hos råttor med raka operativa saxar efter att ha anat huden och peritoneum.
      Anmärkning: det kirurgiska instrumentet måste steriliseras vid höga temperaturer och höga tryck före användning. Det kirurgiska området måste steriliseras med 70% etanol under blod uppsamling.
    3. Ta bort bindväv i bukaorta med silkespapper för att exponera kärlet tydligt.
    4. Dra blod från bukaorta med en 10 mL, 22 G spruta. Ta sedan bort nålen och överför blodet till ett 15 mL sterilt rör. Vanligtvis kan 6 − 8 mL blod erhållas från en råtta.
      Anmärkning: varje råtta måste hållas levande när du ritar blod. En indikator är att bukaorta pulserar när råttan är vid liv. Råttan är död efter blod dragning.
    5. Håll röret upprätt i rumstemperatur i 30 − 60 min tills blodet är insvettat i röret. Centrifugera sedan röret vid 500 − 600 x g i 20 min. överför alla supernatanten (serum) från en grupp (6 råttor) till 1 50 ml sterilt rör och skaka för att blanda.
    6. Inaktivera serumet genom att inkuberas i ett vattenbad i 56 ° c i 30 min. filtrera serumet med hjälp av ett 0,22-μm-porstorlek hydrofila polyetersulfon spruta filter. Förvaras vid-80 ° c för långvarig användning (mindre än 1 år).
      Obs: det filtrerade serumet kan användas för in vitro-osteoclastogenes och osteoblastogenes.
  6. Program
    1. Osteoclastogenes in vitro
      1. Späd de tre doserna av GSK-innehållande serum (GSKL, GSKM, GSKH) vid förhållandet 1:4 med minsta Eagle ' s medium (α-MEM) som innehåller L-glutamin, ribonucleosides, och deoxyribonucleosides.
        Anmärkning: se till att den slutliga koncentrationen av GSK-innehållande serum för in vitro-osteoclastogenes och osteoblastogenes är 20%.
      2. Tillsätt det utspädda GSK-innehållande serumet (200 μL/brunn) från steg 3.6.1.1 till benmärgs makrofager (BMMs) från 4 − 6 veckor gamla C57BL/6 möss för osteoclastogenes och stimulera BMMs med makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF, 10 ng/mL) och receptor aktivator för nukleär faktor-κB ligand (RANKL, 100 ng/mL) som tidigare beskrivits2.
    2. In vitro osteoblastogenes
      1. Upprepa steg 3.6.1.1.
      2. Tillsätt det utspädda GSK-innehållande serumet (2 mL/brunn) till ben-mesenkymala stamceller (BMSCs) från 4 − 6 veckor gamla C57BL/6-möss för att generera osteoblast som tidigare beskrivits16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikrodatortomografi visade att OVX-möss uppvisade signifikant benförlust jämfört med saltbekämpnings möss (figur 1a). Den intervention (90 dagar) av GSK granulat ökade kraftigt BMD, särskilt i GSKM-gruppen (figur 1b). Benstruktur parametrarna, såsom BMD, BV/TV, TB. N och Tb.Th, kvantifierades. GSK granule behandlingar ledde till ökad BMD, BV/TV, TB. N och Tb.Th men minskade TB. SP (figur 1c).

Färgning av tartrat resistenta surt fosfatas (TRAP) visade en ökning av antalet osteoklaster hos OVX-möss jämfört med kontroll möss (figur 2A). GSK-granule behandlingar minskade TRAP-positiva osteoklaster jämfört med OVX-gruppen. Dessa fynd bekräftades genom beräkning av förhållandet mellan TRAP-positivt område och trabekulär benyta (OCs/BS%) och förhållandet mellan osteoklast nummer och ben område (OCs/mm2). Dessa kvantitativa resultat visade en signifikant minskning av antalet osteoklaster i GSK-grupper jämfört med OVX-gruppen (figur 2b, C).

GSK-granule-innehållande serum administrerades till benmärgs makrofager (Bmms) från 4 − 6 veckor gamla C57BL/6-möss för att generera osteoklasterna och antalet osteoklaster analyserades genom missfärgning av fällan. Resultaten visade att GSK-granule-innehållande serum minskade antalet TRAP-positiva osteoklaster i GSK-grupper jämfört med kontrollgruppen (figur 3a, B).

Alkaliskt fosfatas (ALP) färgning visade att GSK granule-medicinerade serum utövade stimulerande effekter på osteoblastogenes med MSCs från C57BL/6 möss. ALP färgning visade att alla tre grupperna av GSK granule-läkemedelmedicinerat serum hade ökat aktiviteten av ALP (figur 4a, B) jämfört med kontrollgruppen.

Figure 1
Figur 1: GSK granule förebygger benförlust hos OVX-inducerade möss. (A) möss behandlades med GSK granulat i 3 månader och vänster förbenade skördades för att utföra mikro-CT-analys. Representativa tredimensionella (3D) återuppbyggnads bilder av trabekulärt ben av vänstertibias visades. Skalbar = 0,5 mm.B) bentäthet (BMD) mättes och kvantifierades. C) ben parametrar för vänstertibias, såsom trabekulärt ben antal (TB. N), ben volym över total volym (BV/TV), trabekulärt ben tjocklek (TB.th) och trabekulärt ben separation (TB. sp), relaterat till trabekulär benstomme i alla grupper visades. GSKL-, GSKM-och GSKH-grupperna jämfördes med kontroll (CON; Sham + Saline) och OVX-gruppen (n = 6, *p < 0,05, jämfört med kontroll; *p < 0,05, jämfört med OVX). CAL: kalciumkarbonat med vitamin D3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: GSK-granulat hämmar antalet osteoklaster i OVX-möss. (A) trap-färgning utfördes på ländkotan 3 (L3) efter att de GSK-behandlade mössen skördats. TRAP resultat från kontroll (Sham + Saline), OVX (OVX + Saline), CAL (OVX + Caltrate), GSKL (OVX + lågdos GSK, 2 g/kg/dag), GSKM (OVX + medelstor dos GSK, 4 g/kg/dag), och GSKH (OVX + hög dos GSK, 8 g/kg/dag) mättes och analyserades. Scale bar = 100 μm (topp bilder) eller 50 μm (botten bilder). Bkvantifiering av osteoklast-täckt yta över benytan. C) osteoklast nummer. Värden uttrycks som medelvärdet ± standardfel av medelvärdet (SEM). *P < 0,05, OVX kontra kontroll (CON); *P < 0,05, grupperna av CAL eller GSKL/GSKM/gskh kontra OVX gruppen. Alla analyser upprepades med minst 3 möss. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: GSK granule läkemedelmedicinerat serum minskar osteoclastogenes från benmärgs makrofager (BMMs). (A) Bmms från C57BL/6 möss (4 − 6 veckor gamla) skördades och odlade med M-CSF (10 ng/ml) och rankl (100 ng/ml) (kontroll), M-CSF och RANKL plus GSK, eller Cal medicinerade serum. Osteoclastogenes bedömdes vid dag 4 − 6 med missfärgning av FÄLLAN. Skalstapel = 100 μm. (B) antalet osteoklaster kvantifierades. *P < 0,05, grupperna av GSKL/GSKM/GSKH kontra kontroll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: GSK granule-läkemedelmedicinerat serum främjar osteoblastogenes. (A) ben-mesenkymala stamceller (MSCS) från C57BL/6-möss (4 − 6 veckor gamla) isolerades och BEHANDLADES med GSK eller Cal-läkemedelmedicinerat serum. ALP färgning utfördes vid dag 7 för att bedöma osteoblastogenes. Skalstapel = 100 μm. (B) antalet osteoblaster kvantifierades. *P < 0,05, grupperna av CAL eller GSKL/GSKM/gskh kontra kontroll. Alla analyser upprepades med minst 3 möss eller 3 gånger. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Granulat av TCM-medel har blivit ett av de vanligaste valen för formuleringar eller recept. GSK granulat består av flera växtbaserade läkemedel baserade på kliniska erfarenheter eller TCM teorin, och de utövar bättre läkande effekter med färre biverkningar4. Jämfört med vatten dekokt, granulatet har dessa fördelar: god smak, bekvämlighet för leverans, långsiktig lagring, standardprotokoll och konsekventa läkande effekter, samt högre produktivitet. För närvarande granulat är en av de mest använda apotek formationer i TCM. De bakomliggande mekanismerna för farmakologiska effekter studeras dock fortfarande sällan. Det är nödvändigt att fastställa de kritiska stegen i beredningen av granulat för att undersöka de underliggande farmakologiska mekanismerna.

Under de senaste decennierna, en eller flera representativa effektiva komponenter från örtmedicin har vanligtvis använts för att utföra molekylära analyser och farmakologiska resultat på grund av deras strukturella klarhet. Många undersökningar har utförts för att förstå botande effekter med effektiva komponenter från TCM örter5,6,7. Emellertid, det är fortfarande svårt att efterlikna vad som kommer att hända i en patient på grund av den komplexa miljön, med många effektiva komponenter som arbetar tillsammans. För att lösa detta problem kan utredningar med granulat utforska farmakologiska processer och är ett val i att utföra molekylära studier jämfört med undersökningar med effektiva komponenter.

Beredning av arbetslösningar för granulat innehåller fyra grundläggande steg. Det första steget är upplösning. Granulat blandas vanligen i saltlösning efter omrörning för att slutföra upplösa innan ytterligare undersökningar. Granulatet påverkar tiden och stabiliteten hos granulat under upplösnings processen. Variationen i Upplösningstiden och stabiliteten beror på örterna, på grund av deras fysikaliska, kemiska och farmakologiska egenskaper17. Ordentlig skakning och högre temperatur brukar främja och säkerställa fullständig upplösning av granulat. Nästa steg är koncentration. Korrekt volym av sondadministration för djur beaktas noggrant och bestäms av volymen av arbetslösningen. Orala sondar vid höga koncentrationer, såsom 10 mL/kg eller mer, kan leda till flera absorptionsrelaterade problem. Snabb växling av den arbetande lösningen av granulat i tolvfingertarmen är ett vanligt problem. Andra problem, såsom aspirationspneumoni, på grund av passiv reflux av arbetslösning av granulat i matstrupen, observeras också18. Filtrering är det tredje steget, som hjälper sondmatning nålen att minska i volym och hindrar den från att bli igensatta med växtbaserade granulat, samt aids nedbrytning av granulat. Det fjärde steget är lagring. Lagringen av arbetslösningar av granulat vid låg temperatur (-20 ° c) garanterar bättre resultat.

Metoden för att beräkna den animaliska bioekvivalent dosen är viktig för att bestämma effekterna av granulat i bruket av TCM. Kroppsvikten (mg/kg) och arten är allmänt ansedd. Kroppsytan (mg/m2) används ofta för att utföra beräkningen19 eftersom metabolismgraden är relaterad till storleken på det enskilda djuret. Det är sunt förnuft att betrakta både kroppsyta och kroppsvikt, och därför användes meeh-Rubner-ekvationen, vilket är vanligt i in vivo-undersökningar i farmakologiska studier19,20.

Flera typer av djur väljs för läkemedel som innehåller serum beredning, såsom kaniner, marsvin, råttor och möss. För in vivo-undersökningar föredras samma art. Råttor valdes eftersom de inte bara ger mer serum än möss, men är också närmare möss i termer av evolution än andra djur. Dosekvivalenten i vivo (råtta: 7 gånger motsvarande dos) och klinisk användning för patienter rekommenderas också. Tio gånger den ekvivalent dos av serum-förutsatt djur är inte allmänt tillämpas för in vivo undersökningar eftersom behandlade celler eller organ kan leda till potentiella toxiska reaktioner21. Metoder som injektion, hud administration, och inandning är de vanligaste administrerings förfaranden i enlighet med in vivo administrationer. Oral administrering av sonkannålar valdes i den aktuella studien. Granule administreringsfrekvens varierar från en gång till två gånger per dag, och interventionsperioden är 3 − 14 dagar. Den slutliga insamlingen av blod utförs vanligtvis inom 2 h efter den sista administrationen22,23, när koncentrationen av granulat i blodet är relativt stabil och på toppnivå enligt en tidigare studie24.

Läkemedel innehållande serum för in vitro-analyser före användning är fortfarande kontroversiellt. Vissa forskare håller att det kan resultera i oväntade reaktioner eller biverkningar, som påverkar resultaten på grund av närvaron av många aktiva komponenter i serum, inklusive enzymer, hormoner, antikroppar, och kompletterar25. Men vissa forskare håller motsatt åsikt att aktiva komponenter kan också tas bort av inaktiveringsprocessen26. För att nå en medelväg, var serumet i denna studie inaktiverat innan inkubering i ett vattenbad vid 56 ° c i 30 min. Dessutom inkluderades en tom serum grupp, där serum från saltlösning-behandlade djur används, för att utesluta eventuella biverkningar. Därför kan läkemedel som innehåller serum fungera som en potentiell metod för att undersöka farmakologiska mekanismer eller terapeutiska resultat.

Jämfört med liknande metoder har protokollet här följande fördelar: (1) fullständighet. Både in vitro-och in vivo-metoder används samtidigt och kan ömsesidigt stödja varandra i farmakologiska effekter. (2) lämplighet. Endast möss och råttor ingår eftersom de är nära besläktade. (3) repeterbarhet. Både möss och råttor köps enkelt till låg kostnad, och metoderna kan enkelt upprepas. (4) låg kostnad. Den OVX-inducerad osteoporotisk musmodell används ofta och tillförlitlig27,28 och kan lätt göras eller köpas. Därför är protokollen här mer lämpade jämfört med andra metoder för att studera de farmakologiska effekterna av örtmedicin, såsom granulat.

Det finns dock flera begränsningar i protokollen med GSK-granulat. Först, tre doser administrerades, även om granulatet visade ingen signifikant dos-beroende tendens för in vivo utredningar. Anledningen kan vara att doser för djurstudier inte är känsliga och interventions tiden är inte tillräckligt lång, vilket kräver ytterligare testning. Därefter behövs en längre interventions period för parallella undersökningar. Det läkemedelhaltiga serumet, även om det är inaktiverat, kan orsaka biverkningar efter långvarig intervention. För det tredje används endast en volym arbetslösning för djur förvaltning, som kan ändras i framtida studier. Slutligen, djurarter som valts för beredning av läkemedel som innehåller serum och administrations rutiner kan ändras och kommer att testas i ytterligare studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 och 81330085), programmet för innovativa team, ministeriet för vetenskap och teknik i Kina (2015RA4002 till WYJ), programmet för Innovativt team, Undervisningsministeriet i Kina (IRT1270 till WYJ), Shanghai TCM Medical Center of kronisk sjukdom (2017ZZ01010 till WYJ), tre år åtgärder för att påskynda utvecklingen av traditionell kinesisk medicin plan (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 till WYJ), och nationella centrala forsknings utvecklings projekt (2018YFC1704302).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM Hyclone
laboratories		 SH30265.018 For cell culture
β-Glycerophosphate Sigma G5422 Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL) Wyeth L96625 Animal interventation
C57BL/6 mice SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Ainimal preparation
Dexamethsome Sigma D4902
Dimethyl sulfoxide Sigma D2438 Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Sangon Biotech 60-00-4 Samples treatmnet
Fetal bovine serum Gibco FL-24562 For cell culture
Gushukang granules kangcheng companyin china Z20003255 Herbal prescription
Light microscope Olympus BX50 Olympus BX50 Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate Sigma A8960-5G Osteoblastogenesis
Microscope Leica DMI300B Osteocast and osteoblast imagine
M-CSF Peprotech AF-300-25-10 Osteoclastogenesis
Μicro-CT Scanco
Medical AG		 μCT80 radiograph microtomograph Bone Structural analsysis
RANKL Peprotech 11682-HNCHF Osteoclastogenesis
Sprague Dawley SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Blood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT TRAP staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
  2. Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
  3. Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
  4. Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
  5. Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
  6. Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
  7. Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
  8. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
  9. Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
  10. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
  11. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
  12. Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
  13. Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
  14. Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
  15. Zhang, Y. P. Pharmacology Experiment. , 2nd edition, People’s medical publishing house. Beijing, China. (1996).
  16. Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
  17. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  18. Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
  19. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  20. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  21. Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
  22. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  23. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  24. Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  25. Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  26. Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
  27. Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
  28. Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).

Tags

Medicin traditionell kinesisk medicin Gushukang-granule läkemedels innehållande serum serum farmakologi osteoclastogenes ovariectomiserade möss osteoblastogenes in vivo in vitro
Beredning av Gushukang (GSK) granulat för in vivo-och in vitro-experiment
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang,… More

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang, Y., Shu, B., Zhao, D. Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (147), e59171, doi:10.3791/59171 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter