إعداد حبيبات غوشوكانغ (GSK) للتجارب في الجسم الحي وفي المختبر
Summary
توفر هذه المقالة بروتوكول مفصل لإعداد حل عمل من حبيبات Gushukang للدراسات الحيوانية وحبيبات GSK التي تحتوي على المصل للتجارب في المختبر. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على التحقيقات الدوائية للأدوية العشبية، فضلا عن الوصفات الطبية لكل من التجارب الحية والمختبرية.
Abstract
يلعب الطب العشبي الصيني التقليدي دورًا كطريقة بديلة في علاج العديد من الأمراض، مثل هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث (POP). الحبيبات Gushukang (GSK)، وصفة طبية تسويقها في الصين، لها آثار واقية من العظام في علاج POP. قبل الإدارة إلى الجسم، هناك حاجة عادة إلى إجراء إعداد معيار واحد، والذي يهدف إلى تعزيز الإفراج عن المكونات النشطة من الأعشاب الخام وتعزيز الآثار الدوائية، فضلا عن النتائج العلاجية. تقترح هذه الدراسة بروتوكولمفصل لاستخدام حبيبات GSK في الاختبارات التجريبية في الجسم الحي وفي المختبر. يقدم المؤلفون أولاً بروتوكولاً مفصلاً لحساب الجرعات المناسبة للحيوانية من حبيبات في التحقيق في الجسم الحي: وزنها، حل، تخزين، والإدارة. ثانياً، تصف هذه المقالة بروتوكولات المسح المقطعي الدقيق وقياس معلمات العظام. وتم تقييم إعداد العينات، وبروتوكولات لتشغيل آلة التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة، والتحديد الكمي لبارامترات العظام. ثالثا، يتم إعداد حبيبات GSK التي تحتوي على المصل، ويتم استخراج المصل الذي يحتوي على المخدرات لنشأة العظام في المختبر وأوستيولاستوجينيسيس. كانت حبيبات GSK داخل المعدة تدار مرتين في اليوم للفئران لمدة ثلاثة أيام متتالية. ثم تم جمع الدم، والطرد المركزي، وتعطيل، وتصفيتها. وأخيرا، تم تخفيف المصل واستخدامها لإجراء تكوين العظام وosteoblastogenes. يمكن اعتبار البروتوكول الموضح هنا مرجعًا للتحقيقات الدوائية للأدوية العشبية الموصوفة، مثل حبيبات.
Introduction
الطب الصيني التقليدي (TCM) هو واحد من النهج التكميلية والبديلة الهامة لعلاج هشاشة العظام1،2. ديكوتيون المياه هو الشكل الأساسي والأكثر استخداما من الصيغة3. ومع ذلك، توجد عيوب أيضا: سوء الذوق، وإزعاج النقل، وقصر مدة الصلاحية والبروتوكولات غير المتسقة، والحد من الاستخدامات، فضلا عن الآثار العلاجية. لتجنب العيوب المذكورة أعلاه، فضلا عن متابعة آثار أفضل، تم تطوير حبيبات واستخدمت على نطاق واسع4. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد استكشفت الآليات الدوائية لواحد أو أكثر من المكونات الفعالة من حبيبات5و6و7، والآليات الدقيقة والعمليات الدوائية الكامنة لا تزال من الصعب تحديدها. وذلك لأن الكثير من المكونات الفعالة من حبيبات واحدة قد تمارس في وقت واحد آثار مماثلة أو معارضة4. ولذلك، فإن وضع بروتوكول قياسي واحد لإعداد حبيبات قبل تسليمها إلى الجسم ليس فقط سيكون لها تأثير كبير على النتائج العلاجية ولكن مطلوب أيضا لكل من الاختبارات في الجسم الحي وفي المختبر.
وعلاوة على ذلك، فإن الآثار العلاجية للحبيبات في العيادة من الصعب تأكيد وتحديد بالضبط باستخدام في المختبر أو الدراسات الخارجية، مما يخلق تحديا لأن الآليات الدوائية معقدة للغاية. لحل هذه المشكلة، تم اقتراح إعداد المصل الذي يحتوي على المخدرات لأول مرة من قبل Tashino في الثمانينات8. ومنذ ذلك الحين، طبق العديد من الباحثين المصل المحتوي على الأدوية على الأدوية العشبية، بما في ذلك حبيبات9و10و11 . وفي الوقت الراهن، يعتبر اختيار المصل المحتوي على المخدرات للتحقيقات في المختبر استراتيجية واحدة تحاكي الظروف الفسيولوجية عن كثب.
تم تطوير حبيبات Gushukang (GSK) لعلاج هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث (POP) على أساس الممارسة السريرية في ضوء نظرية TCM. حبيبات GSK منع فقدان العظام في الفئران المبيض (OVX) في الجسم الحي، وتمنع ارتشاف العظامالعظمية، وتحفيز تشكيل العظام osteoblastic 4. وبالتالي، وجد لي وآخرون12 أن حبيبات GSK لها آثار وقائية على العظام في الفئران OVX عن طريق تعزيز أنشطة مستقبلات الكالسيوم لتحفيز تشكيل العظام. لتأكيد آثار حماية العظام، فضلا عن الآثار الدوائية من حبيبات GSK، والمؤلفين هنا توفير إجراء مفصل لإعداد حلول العمل والمخدرات (GSK الحبيبية) التي تحتوي على المصل. وعلاوة على ذلك، تصف هذه المقالة تطبيق حبيبات GSK في نموذج الماوس العظمي المستحث OVX والمصل الذي يحتوي على حبيبات GSK في المختبر osteoclastogenes/ osteoblastogenes.
وتتكون حبيبات GSK من العديد من الأعشاب13،14 ويمكن حلها تماما في المالحة بسهولة. لذلك، المالحة بمثابة السيارة. وكانت الفئران التي تديرها الشام (الشام) وفئران OVX تدار بنفس حجم الفئران المالحة التي تديرها الفئران الحبيبية. تم حساب الجرعات المكافئة من حبيبات GSK للماوس على أساس معادلة Meeh-Rubner15. هذه المعادلة ليس فقط لديه ميزة الحصول على جرعات آمنة ولكن أيضا يضمن الآثار الدوائية15. تم إنشاء الجرعات الثلاث من حبيبات GSK على النحو التالي: (1) GSKL: OVX + حبيبات GSK جرعة منخفضة، 2 غرام / كغ / يوم. (2) GSKM: OVX + جرعة متوسطة حبيبات GSK، 4 غرام / كغ / يوم. (3) GSKH: OVX + جرعة عالية من حبيبات GSK، 8 غرام / كغ / يوم. وكانت الفئران في مجموعات GSKL وGSKM و GSKH حبيبات GSK تدار داخل المعدة. كربونات الكالسيوم (600 ملغ / قرص) مع فيتامين D3 (125 وحدة دولية / قرص)، على سبيل المثال، في منتج ناضجة وتسويقها (على سبيل المثال، Caltrate [CAL]) لعلاج والوقاية من هشاشة العظام، واستخدمت كسيطرة إيجابية.
Protocol
Representative Results
Discussion
حبيبات وكلاء TCM أصبحت واحدة من الخيارات المشتركة للتركيبات أو الوصفات الطبية. وتتكون حبيبات GSK من العديد من الأدوية العشبية على أساس التجارب السريرية أو نظرية TCM, وأنها تمارس آثار علاجية أفضل مع آثار جانبية أقل4. بالمقارنة مع ديكوتيون المياه، وحبيبات لديها هذه المزايا: الذوق ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المنح المقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81804116، 81673991، 81770107، 81603643، و 81330085)، وبرنامج الفريق المبتكر، وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (2015RA4002 إلى WYJ)، وبرنامج فريق مبتكر، وزارة التعليم في الصين (IRT1270 إلى WYJ)، مركز شنغهاي الطبي للأمراض المزمنة (2017ZZ01010 إلى WYJ)، عمل ثلاث سنوات لتسريع تطوير خطة الطب الصيني التقليدي (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 إلى WYJ)، و المشاريع الوطنية الرئيسية لتطوير البحوث (2018YFC1704302).
Materials
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
References
- Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
- Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
- Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
- Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
- Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
- Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
- Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
- Tashino, S. “Serum pharmacology” and “serum pharmaceutical chemistry”: from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
- Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
- Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
- Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
- Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
- Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
- Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
- Zhang, Y. P. . Pharmacology Experiment. , (1996).
- Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
- Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
- Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
- Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors’ expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
- Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
- Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
- Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
- Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
- Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
- Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
- Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).
