O objetivo aqui é delinear um protocolo para investigar os mecanismos de disbiose na doença cardiovascular. Este artigo discute como coletar e transplantar amostras fecais murinas assepticamente, isolar intestinos e usar o método "Swiss-roll", seguido por técnicas de imunomarcação para interrogar alterações no trato gastrointestinal.
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Artigo de método
Isolamento Fecal Murino e Transplante de Microbiota
Neste artigo
Resumo
Resumo
A disbiose da microbiota intestinal desempenha um papel na fisiopatologia de distúrbios cardiovasculares e metabólicos, mas os mecanismos não são bem compreendidos. O transplante de microbiota fecal (FMT) é uma abordagem valiosa para delinear um papel direto da microbiota total ou de espécies isoladas na fisiopatologia da doença. É uma opção de tratamento segura para pacientes com infecção recorrente por Clostridium difficile . Estudos pré-clínicos demonstram que a manipulação da microbiota intestinal é uma ferramenta útil para estudar a ligação mecanicista entre disbiose e doença. O transplante de microbiota fecal pode ajudar a elucidar novas terapêuticas direcionadas à microbiota intestinal para o manejo e tratamento de doenças cardiometabólicas. Apesar de uma alta taxa de sucesso em roedores, ainda existem alterações translacionais associadas ao transplante. O objetivo aqui é fornecer orientação no estudo dos efeitos do microbioma intestinal em doenças cardiovasculares experimentais. Neste estudo, um protocolo detalhado para coleta, manuseio, processamento e transplante da microbiota fecal em estudos murinos é descrito. As etapas de coleta e processamento são descritas para doadores humanos e roedores. Finalmente, descrevemos o uso de uma combinação das técnicas de rolagem suíça e imunomarcação para avaliar alterações de morfologia e integridade específicas do intestino em doenças cardiovasculares e mecanismos relacionados da microbiota intestinal.
Introdução
Os distúrbios cardiometabólicos, incluindo doenças cardíacas e acidentes vasculares cerebrais, são as principais causas globais de morte1. Inatividade física, má nutrição, avanço da idade e genética modulam a fisiopatologia desses distúrbios. Evidências acumuladas apoiam o conceito de que a microbiota intestinal afeta distúrbios cardiovasculares e metabólicos,incluindo diabetes tipo 2 2, obesidade3 e hipertensão4, o que pode ser uma chave para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para essas doenças.
Os mecanismos exatos pelos quais ....
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Protocolo
O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Vanderbilt aprovou todos os procedimentos descritos neste manuscrito. Camundongos machos C57B1/6 aos 3 meses de idade, adquiridos do The Jackson Laboratory, foram alojados e cuidados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Coleta, armazenamento e processamento de amostras fecais humanas
- Coletar uma amostra de fezes, usando um recipiente estéril se o sujeito estiver na clínica. Refrigerar as amostras de fezes a 4 °C no prazo de 36 h após a colheita até estarem prontas para o processamento. Alternativamente, colete amost....
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Resultados
As etapas descritas acima estão resumidas na Figura 1. O conteúdo cecal de camundongos ou fezes humanas são ressuspensos em soro fisiológico estéril para preparar uma pasta para dar a camundongos livres de germes (100 μL) por gavagem, primeiro por 3 dias consecutivos, depois uma vez a cada 3 dias. Ao final do protocolo, a pressão arterial é medida pelo método do manguito de cauda, camundongos são eutanasiados e tecidos são colhidos para avaliação de mudanças na microbiota intestinal e altera.......
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Discussão
Uma abordagem valiosa para estudar o papel causal da microbiota intestinal em doenças cardiovasculares e metabólicas é transferir a microbiota total ou selecionar espécies de interesse para camundongos livres de germes. Aqui, descrevemos protocolos para coletar amostras fecais de humanos e camundongos convencionalmente alojados em camundongos livres de germes para estudar o papel da microbiota intestinal em doenças hipertensivas.
Em camundongos, usamos conteúdo cecal coletado assepticamente pr.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse, financeiros ou não, declarados pelos autores.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (para A.K.) do National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (para J.A.I.); e National Heart, Lung, and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (para A.K.) e NIH grant 1P01HL116263 (para V.K.). A Figura 1 foi criada usando Biorender.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Câmara anaeróbica | COY | 7150220 | |
| Apolipoproteína AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Tesoura de Artéria - Ponta de Bola | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Solução de alvejante | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Albumina de Soro | Bovino Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 anticorpo | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 anticorpo monoclonal | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrífuga | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| Monitor de alto rendimento CODA | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Frascos criogênicos | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Pipetas descartáveis de transferência de pós-graduação | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Seringas descartáveis | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Etanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Agulha de alimentação | de ciências finas | 18061-38 | |
| Folha de papel de filtro | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalina (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| Dieta rica em sal | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Mini-bombas osmóticas | Alzet | MODELO 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Placa de Petri | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pontas de pipeta | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipetas | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered salina Fisher | Scientific | AAJ61196AP | |
| Espátula inteligente | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Dispositivo de coleta de fezes | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 | |
| Varimix plataforma rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Misturador de vórtice | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xileno | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
Referências
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254(2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes:....
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Reimpressões e permissões
