Summary
Ziel ist es, ein Protokoll zu skizzieren, um die Mechanismen der Dysbiose bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen. In diesem Artikel wird erörtert, wie man aseptisch Stuhlproben von Mäusen sammelt und transplantiert, Darm isoliert und die "Swiss-Roll"-Methode anwendet, gefolgt von Immunfärbetechniken, um Veränderungen im Magen-Darm-Trakt zu untersuchen.
Abstract
Die Dysbiose der Darmmikrobiota spielt eine Rolle in der Pathophysiologie von Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen, aber die Mechanismen sind nicht gut verstanden. Die fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT) ist ein wertvoller Ansatz, um eine direkte Rolle der gesamten Mikrobiota oder isolierter Arten in der Pathophysiologie der Krankheit zu beschreiben. Es ist eine sichere Behandlungsoption für Patienten mit rezidivierender Clostridium difficile-Infektion . Präklinische Studien zeigen, dass die Manipulation der Darmmikrobiota ein nützliches Werkzeug ist, um den mechanistischen Zusammenhang zwischen Dysbiose und Krankheit zu untersuchen. Die Transplantation fäkaler Mikrobiota könnte dazu beitragen, neuartige Therapeutika für die Behandlung und Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu entwickeln, die auf die Darmmikrobiota ausgerichtet sind. Trotz einer hohen Erfolgsrate bei Nagetieren bleiben mit der Transplantation translationale Veränderungen verbunden. Ziel ist es, eine Orientierungshilfe bei der Untersuchung der Auswirkungen des Darmmikrobioms auf experimentelle Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu geben. In dieser Studie wird ein detailliertes Protokoll für die Sammlung, Handhabung, Verarbeitung und Transplantation von fäkalen Mikrobiota in murinen Studien beschrieben. Die Entnahme- und Verarbeitungsschritte werden sowohl für menschliche als auch für Nagetierspender beschrieben. Abschließend beschreiben wir die Verwendung einer Kombination aus Swiss-Rolling- und Immunfärbetechniken zur Beurteilung darmspezifischer Morphologie- und Integritätsveränderungen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen und damit verbundenen Mechanismen der Darmmikrobiota.
Introduction
Kardiometabolische Erkrankungen, einschließlich Herzerkrankungen und Schlaganfall, sind weltweit die häufigsten Todesursachen1. Körperliche Inaktivität, schlechte Ernährung, fortschreitendes Alter und Genetik modulieren die Pathophysiologie dieser Störungen. Es gibt immer mehr Beweise dafür, dass die Darmmikrobiota Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes2, Fettleibigkeit3 und Bluthochdruck4 beeinflusst, was ein Schlüssel zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für diese Krankheiten sein könnte.
Die genauen Mechanismen, durch die die Mikrobiota Krankheiten verursacht, sind noch unbekannt, und die aktuellen Studien sind sehr unterschiedlich, was zum Teil auf methodische Unterschiede zurückzuführen ist. Die fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT) ist ein wertvoller Ansatz, um eine direkte Rolle der gesamten Mikrobiota oder isolierter Arten in der Pathophysiologie der Krankheit zu beschreiben. FMT wird häufig in Tierversuchen eingesetzt, um einen Phänotyp zu induzieren oder zu unterdrücken. Zum Beispiel können die Kalorienaufnahme und der Glukosestoffwechsel moduliert werden, indem Fäkalien von einem kranken Spender auf einen gesunden Empfänger übertragen werden 5,6. Beim Menschen hat sich FMT als sichere Behandlungsoption für Patienten mit rezidivierender Clostridium difficile-Infektion erwiesen7. Es gibt Beweise für seine Verwendung bei der Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Zum Beispiel verbessert FMT von Patienten mit magerem bis metabolischem Syndrom die Insulinsensitivität8. Darmdysbiose wird sowohl in Human- als auch in Nagetierstudien auch mit Bluthochdruck in Verbindung gebracht 9,10,11. FMT von Mäusen, die mit einer salzreichen Diät in keimfreie Mäuse gefüttert wurden, prädisponiert die Empfänger für Entzündungen und Bluthochdruck12.
Trotz der hohen Erfolgsrate der FMT bei Nagetieren bleiben translationale Herausforderungen bestehen. Klinische Studien mit FMT zur Behandlung von Adipositas und metabolischem Syndrom zeigen minimale bis keine Auswirkungen auf diese Erkrankungen13,14,15. Daher sind weitere Studien erforderlich, um zusätzliche therapeutische Wege zu identifizieren, die auf die Darmmikrobiota zur Behandlung von kardiometabolischen Störungen abzielen. Die meisten verfügbaren Erkenntnisse über die Darmmikrobiota und Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind assoziativ. Das beschriebene Protokoll erörtert, wie eine Kombination aus FMT und der Swiss-Rolling-Technik verwendet werden kann, um sowohl einen Zusammenhang zwischen Krankheit und Darmmikrobiota aufzuzeigen als auch die Integrität aller Teile des Darms direkt zu beurteilen16,17,18.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, eine Anleitung für die Untersuchung der Auswirkungen des Darmmikrobioms bei experimentellen Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu geben. Dieses Protokoll enthält weitere Details und wichtige Überlegungen im Versuchsdesign, um die physiologische Translation zu fördern und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erhöhen.
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Protocol
Das Institutional Animal Care and Use Committee der Vanderbilt University genehmigte alle in diesem Manuskript beschriebenen Verfahren. C57B1/6 männliche Mäuse im Alter von 3 Monaten, die vom Jackson Laboratory gekauft wurden, wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren untergebracht und gepflegt.
1. Sammlung, Lagerung und Verarbeitung menschlicher Kotproben
- Entnehmen Sie eine Stuhlprobe in einem sterilen Behälter, wenn sich die Person in der Klinik befindet. Kühlen Sie die Stuhlproben innerhalb von 36 Stunden nach der Entnahme bei 4 °C, bis sie für die Verarbeitung bereit sind. Alternativ können Stuhlproben mit einem handelsüblichen Gerät entnommen werden, um eine einfache und erweiterte DNA-Stabilität bei Raumtemperatur zu gewährleisten, insbesondere für den Heimgebrauch.
- Desinfizieren Sie einen Abzug mit biologischer Sicherheit mit einer 10%igen Bleichlösung oder einem anderen von der Environmental Protection Agency zugelassenen Desinfektionsmittel.
- Nehmen Sie den Hocker aus der kühlen Lagerung und bringen Sie ihn in den Abzug. Verwenden Sie einen Einwegspatel, um ~1 g Aliquots herzustellen, und lagern Sie sie in einem Gefrierschrank von -80 °C, bis sie vollständig verarbeitet werden können.
- Entsorgen Sie alle Einwegartikel im Müll für biologische Gefahren. Desinfizieren Sie alle Oberflächen (Dunstabzugshaube und alle vom Prozessor berührten Oberflächen) und Gegenstände, die von der Haube entfernt werden.
2. Aseptische Entnahme von Stuhlproben von Mäusen
Anmerkungen: Verwenden Sie aseptische Techniken, einschließlich sterilisierter Instrumente.
- Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 - Erstickung. Besprühen Sie die Brust und die Seiten der Maus mit 70%igem Ethanol und öffnen Sie vorsichtig die Haut und die Bauchhöhle, um den Magen-Darm-Trakt freizulegen.
- Isolieren Sie den Blinddarm und schneiden Sie ihn mit einer sterilen chirurgischen Schere in zwei Hälften. Legen Sie den Blinddarm kurz frei und schneiden Sie 0,5 cm proximal vom Ileum und 0,5 cm distal an seinem Übergang zum Dickdarm ab. Übertragen Sie den isolierten Blinddarm in eine sterile Petrischale.
- Verwenden Sie einen sterilen Spatel, um den Blinddarminhalt in sterile Röhrchen umzufüllen, und lagern Sie Aliquote in einem Gefrierschrank bei -80 °C19.
Anmerkungen: Da die meisten Bakterien im Darm anaerob sind, kann die Einwirkung von Sauerstoff die Organismen während des Isolationsvorgangs in Raumatmosphäre schädigen oder abtöten. Daher sollten Kotproben in anaeroben Kammern isoliert werden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu erhalten.
3. Transplantation von Fäkalien
- Frische oder zuvor gefrorene Kotpellets in steriler Kochsalzlösung im Verhältnis 1:20 (w:v) resuspendieren und bis zur Homogenisierung vortexen.
- Führen Sie das Homogenat durch einen Nylonfilter mit 30 μm-Poren, um große Partikel zu entfernen. Bei 79 × g für 5 min zentrifugieren und den Überstand für die Transplantation auffangen.
- Orale Sonde 100 μl der Aufschlämmung pro keimfreier Empfängermaus an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, gefolgt von Sonde alle 3 Tage für 2 Wochen. Verwenden Sie herkömmliche Mäuse, um die Mechanismen der Darmmikrobiota zu untersuchen, wenn sie zuerst mit Antibiotika behandelt wurden, um die eigene endemische Mikrobiota des Empfängers zu eliminieren. Verabreichen Sie den Empfängermäusen beispielsweise Ceftriaxon (400 mg/kg) täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen über eine orale Sonde vor der Sonde der Stuhlaufschlämmung.
HINWEIS: Studien deuten darauf hin, dass mindestens 2 Wochen dieser Behandlung erforderlich sind, um kardiovaskuläre Veränderungen, einschließlich Blutdruck, hervorzurufen20. - Stellen Sie sicher, dass keimfreie Empfängermäuse in gnotobiotischen Filmisolatoren untergebracht und mit sterilem Futter und Wasser gefüttert werden.
4. Systolische Blutdruckmessungen
HINWEIS: Gnotobiotische Mäuse, die FMT von konventionell gehaltenen 3 Monate alten C57Bl/6-Mäusen erhielten, wurden mit osmotischen Minipumpen (Alzet, Modell 2002) zur Infusion von niedrig dosiertem Angiotensin II (140 ng/kg/min) für 2 Wochen implantiert. Der Blutdruck wurde wöchentlich über die Schwanzmanschette überwacht. Über das Protokoll für die Implantation osmotischer Minipumpen wurde bereits berichtet21. Die Schwanzmanschette wurde wie unten kurz zusammengefasst durchgeführt. Eine nicht-invasive Methode zur Blutdruckmessung, wie z. B. die Schwanzmanschette, eignet sich für FMT-Studien an gnotobiotischen Mäusen. Die detaillierten Schritte zur Durchführung der Schweifmanschette wurden bereitsbeschrieben 22.
- Holen Sie die Mäuse kurz aus den gnotobiotischen Isolatoren und heizen Sie die Plattform der Schwanzmanschette und den Maushalter vor.
- Legen Sie die bewussten Mäuse in Fesseln auf die beheizte Plattform und sammeln Sie mindestens drei Runden systolischer Druckmessungen mittels Schwanzmanschettenplethysmographie. Führen Sie die folgenden Schritte an 3 aufeinanderfolgenden Tagen vor den richtigen Messtagen durch, um Mäusen beizubringen, gefesselt zu werden, um Stress abzubauen.
- Legen Sie die Maus vorsichtig in die vorgeheizte Halterung und lassen Sie den Schwanz draußen. Kleben Sie die Oberseite vorsichtig ab, ohne sie zu drücken, um die Maus nicht zu belasten.
- Lassen Sie die Maus in der Halterung ruhen. 3-5 Minuten mit einem Laken bedeckt auf die Plattform legen, um sich zu akklimatisieren.
- Ermitteln Sie den Mittelwert der Messwerte aus allen Runden, um einen durchschnittlichen systolischen Druck für jedes Tier zu ermitteln.
5. Beurteilung der FMT auf kardiovaskuläre Veränderungen
- Nach der Blutdruckmessung werden die Mäuse eingeschläfert und der Blinddarminhalt aseptisch entnommen, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
- Entnahme des Darms und anderer Gewebe, einschließlich Herz, Aorta, Leber, Mesenterialarterien und Nieren, um die Rolle der Darmmikrobiota für die kardiometabolische Gesundheit zu untersuchen. Um Gewebe zu entnehmen, lokalisieren Sie das Gewebe in der Maus und entfernen Sie es mit einer Schere.
- Führen Sie eine metagenomische Sequenzierungsanalyse an Stuhlproben/Blinddarminhalten durch, die von den Spender- und Empfängermäusen entnommen wurden, um die Transplantation der Darmmikrobiota nach FMT23 zu bestätigen. Der erste Beweis für eine erfolgreiche Besiedlung der Mikrobiota ist die Bestätigung, dass die Mikrobiota des Spenders und des Empfängers ähnlich ist.
- Verwenden Sie die Swiss-Roll-Technik (siehe Abschnitt 6) auf dem entnommenen Darmgewebe in Verbindung mit Immunfärbung und Histologie, um morphologische und zelluläre Expressionsveränderungen zu untersuchen24.
6. Darm-Darm-Brötchen herstellen
- Tag 1
- Bei einer ordnungsgemäß euthanasierten Maus, die mit 70%igem Ethanol besprüht wurde, präparieren Sie den Mäusedarm von der Analseite (fixiert im Retroperitoneum) bis zur Magenseite. Legen Sie den gesamten isolierten Magen-Darm-Trakt in eine Petrischale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Halten Sie das proximale Ende sanft vom Bauchende ab und entfernen Sie das umgebende Fett und Bindegewebe mit der Hand.
- Isolieren Sie den Dünndarm (Cephalad vom Blinddarm) und machen Sie mit jeder Länge ein Zickzack vom Typ Z. Schneiden Sie dann, um nacheinander den Zwölffingerdarm, das Jejunum und das Ileum zu erhalten, wie zuvor beschrieben25. Isolieren Sie den Dickdarm, indem Sie den Darmabschnitt unterhalb des Blinddarms durchtrennen.
- Schneiden Sie den Zwölffingerdarm, das Jejunum, das Ileum und den Dickdarm durch.
- Spülen und waschen Sie den Darm innen mit PBS mit einer Spritze und einer Nadel mit Kugelspitze, um den Darm nicht zu zerreißen.
- Legen Sie den Darm auf Filterpapier. Beschriften Sie das Papier mit dem Namen des Abschnitts (z. B. Zwölffingerdarm) und dann "P" in der rechten oberen Ecke für proximal oder "D" für distal in der rechten unteren Ecke.
- Schneiden Sie den Darm mit einer Kugelschere in Längsrichtung durch. Öffnen Sie den Darm auf dem Filterpapier. Nach Bedarf mit mehr PBS waschen.
- Klemme den Darm zwischen zwei Filterpapiere. Tackern Sie die Filterpapiere an vier Punkten/Ecken in der Nähe des Darms.
- In 10%iger formalinneutraler Pufferlösung (4,0 g einbasisches Natriumphosphat, 6,5 g Natriumphosphat, zweibasisch, 100 ml 37%iges Formaldehyd, 900 ml destilliertes Wasser) einweichen. Mit einer Plattformwippe bei 5 U/min bei Raumtemperatur über Nacht schütteln.
- Tag 2
- 2% Agarose in destilliertem Wasser zubereiten und mit einem Rührstab in einem mit Alufolie abgedeckten Becherglas erhitzen.
- Holen Sie die Taschentücher zurück; Ziehen Sie das obere Filterpapier ab. Rollen Sie den Darm von der proximalen Seite, so dass die proximale Seite zuerst nach innen geht, und rollen Sie ihn nach innen, so dass sich das Lumen auch auf dem Objektträger befindet. Je nach Bedarf mit einer oder zwei 30-G-Nadeln feststecken.
- Aspirieren Sie 1 ml Agarose mit Einweg-Transferpipetten und gießen Sie die Agarose auf einen gerollten Darmabschnitt auf einer ebenen Oberfläche, wobei Luftblasen im Gewebe vermieden werden.
- Lassen Sie die Agarose abkühlen und fest werden. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die überschüssige Agarose um den Gewebeabschnitt herum zu schneiden.
- Legen Sie die Darmabschnitte in Gewebeverarbeitungs-/Einbettungskassetten (größer als die normalen, um die erhöhte Höhe durch Agarose aufzunehmen). In 70%igem Ethanol bei 4 °C einweichen.
- Bereiten Sie in Paraffin eingebettete Gewebeobjektträger vor und fahren Sie mit der Immunfärbung fort, wie unten beschrieben.
7. Immunfärbung des Darm-Darm-Traktes
- Entparaffinierung
- Durchlaufen Sie die folgenden Bäder mit Objektträgern in einem Gestell: Xylol für 3 min, frisches Xylol erneut für 3 min, Xylol mit 100 % Ethanol (1:1) für 3 min, 95 % Ethanol für 3 min, 70 % Ethanol für 3 min und 50 % Ethanol für 3 min.
- Vorsichtig mit kaltem, fließendem Leitungswasser abspülen. In einem Bad mit Leitungswasser aufbewahren.
- Antigen-Entnahme
- Nach der Entparaffinierung werden die Objektträger in einem Gestell in einem Bad mit Antigen-Retrieval-Puffer (0,01 M Trinatriumcitrat-Dihydrat bei pH 6 und 0,05 % Tween-20) bei 100 °C für 20 min gekocht.
- Unter kaltem Leitungswasser laufen lassen.
- Färbung
- Nehmen Sie die Objektträger aus dem Bad und legen Sie das Taschentuch mit der Vorderseite nach oben in einen Objektträgerkasten mit feuchten Labortüchern/Papiertüchern im Boden. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Markierungsstift einen Umriss um das Gewebe herum.
- Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) + 0,025 % Triton X-100 auf das Gewebe geben und 5 Minuten inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt.
- Blockieren Sie mit TBS + 10 % fetalem Kälberserum (FBS) + 1 % Rinderserumalbumin (BSA) für 2 h bei Raumtemperatur. Drehen Sie die Objektträger auf die Seite und entfernen Sie den Blockierpuffer auf einem Labortuch.
- Primäre Antikörperlösung zugeben und bei 4 °C für mindestens 2 h oder über Nacht inkubieren. Waschen Sie vorsichtig mit TBS + 0,025 % Triton X-100, indem Sie vorsichtig ~200 μl über den Abschnitt pipettieren.
- Sekundäre Antikörperlösung zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen Sie die Objektträger 3 x 5 Minuten mit TBS, indem Sie sie mit einer Pipette spülen, wie in Schritt 7.3.4 beschrieben.
- Befestigung mit Montagemedium und Deckglas.
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Representative Results
Die oben beschriebenen Schritte sind in Abbildung 1 zusammengefasst. Der Blinddarminhalt der Maus oder der menschliche Kot wird in steriler Kochsalzlösung resuspendiert, um eine Aufschlämmung herzustellen, die keimfreien Mäusen (100 μl) per Sonde verabreicht wird, zuerst an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, dann einmal alle 3 Tage. Am Ende des Protokolls wird der Blutdruck mit der Schwanzmanschettenmethode gemessen, Mäuse werden eingeschläfert und Gewebe entnommen, um Veränderungen der Darmmikrobiota sowie kardiovaskuläre und metabolische Veränderungen zu beurteilen.
Ein wichtiger Schritt bei der Auswahl der Mikrobiota besteht darin, sicherzustellen, dass der interessierende Krankheitsphänotyp beim Spender vorhanden ist und mit dysbiotischen Veränderungen verbunden ist. Zum Beispiel ist eine salzreiche Ernährung stark mit Dysbiose und Herz-Kreislauf-Dysfunktion verbunden. In dieser Studie wurde ein Mäusespender verwendet, der mit einer 8%igen NaCl-Diät gefüttert wurde. Zu den Veränderungen in der Darmmikrobiota als Reaktion auf den hohen Salzgehalt gehörte eine Abnahme der bakteriellen Artenvielfalt (Abbildung 2A), die sich getrennt von der normalen Salzmikrobiota (Abbildung 2B) häufte. Das Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes war ebenfalls erhöht (Abbildung 2C), was auf hohe salzinduzierte Mikrobiota-Veränderungen hindeutet (modifiziert von Ferguson et al.12).
Um die Rolle der durch hohes Salz induzierten Dysbiose bei der Prädisposition für Bluthochdruck zu bestimmen, wurde FMT von Mäusen mit hoher Salzfütterung zu keimfreien Mäusen durchgeführt und Blutdruckreaktionen auf eine niedrige Subpressordosis von Angiotensin II (Ang II) untersucht. In dieser Studie wurden männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 3 Monaten verwendet. Empfängermäusen wurden osmotische Minipumpen implantiert, um Mäusen 2 Wochen lang kontinuierlich eine niedrige Dosis Ang II (140 ng/kg/) zu verabreichen. Mäuse, die FMT von Spendern mit hohem Salzgehalt erhielten, zeigten unter Ang II-Behandlung einen signifikanten Anstieg des Blutdrucks im Vergleich zu normalen Empfängern der Salzmikrobiota (Abbildung 3). Dieser Befund deutet darauf hin, dass FMT die Empfängermäuse auf die Entwicklung von Bluthochdruck vorbereitete12. Details zum Schwanz-Manschetten-Protokoll bei Nagetieren wurden bereits berichtet 12,26.
Dysbiotische Darmmikrobiota tragen zu Krankheiten bei, die zum Teil auf eine entzündete und undichte Darmwand zurückzuführen sind. Daher kann die immunhistochemische Untersuchung der Darmwand verwendet werden, um Veränderungen in bestimmten Darmbereichen in jedem Krankheitsstadium auch außerhalb der FMT zu untersuchen. Abbildung 4 zeigt, dass wir Immunhistochemie am Ileum mit einer Swiss-Roll-Technik und verschiedenen Färbemarkern wie Hämatoxylin und Eosin (H&E), Massons Trichrom und Immunzellmarkern wie Anti-CD3 und Anti-CD68 durchführen können, wie zuvor beschrieben 12, und Apolipoprotein AI (AI), das sich im Ileum proteinurischer Mäuse angesammelt hatte (Abbildung 4).
Abbildung 1: Diagramm, das den Protokollentwurf zusammenfasst. Kotproben, die von einem Menschen oder einer konventionellen Maus entnommen werden, werden für die Transplantation in keimfreie Mäuse verwendet. Abkürzungen: FMT = fäkale Mikrobiota-Transplantation; Blutdruck = Blutdruck. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mäuse, die sich salzreich ernähren, weisen eine Dysbiose der Darmmikrobiota auf. (A) Abschätzung der Artenvielfalt im Blinddarmgehalt von Mäusen mit normaler salzhaltiger (schwarzer) und salzreicher (roter) Ernährung. (B) Nichtmetrische mehrdimensionale Skalierung zeigt, dass die Bakterien von Mäusen mit normalem Salz und salzreicher Diät separate Cluster bilden. (C) Ein hoher Salzgehalt ist mit einem erhöhten Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnis verbunden. (***p < 0,0001 unter Verwendung zweiseitiger, ungepaarter Student-t-Tests). Diese Abbildung wurde von Ferguson et al.12 übernommen. Abkürzungen: NMDS = nichtmetrische mehrdimensionale Skalierung; NS = normales Salz; HS = hoher Salzgehalt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: FMT von Mäusen, die mit hohem Salzgehalt gefüttert wurden, prädisponiert keimfreie Mäuse für Angiotensin II-induzierte Hypertonie. Die Übertragung einer hohen Salz-induzierten dysbiotischen Darmmikrobiota war bei keimfreien Mäusen mit einem signifikant erhöhten systolischen Druck im Vergleich zu Mäusen verbunden, die eine normale Salzdarmmikrobiota erhielten. Diese Abbildung wurde von Ferguson et al.12 übernommen. Abkürzungen: FMT = fäkale Mikrobiota-Transplantation; Blutdruck = Blutdruck; Ang II = angiotensin II; NS = normales Salz; HS = hoher Salzgehalt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Immunhistochemisches Bild, das veranschaulicht, wie Veränderungen von Krankheitsmarkern im Darm beurteilt werden können. Repräsentative Bilder, die eine Apolipoprotein-AI-Färbung in Ilea zeigen, die von Mäusen mit Hyperlipidämie ohne (A) oder mit (B) Proteinurie aufgenommen wurden. Vergrößerung: 5-fach auf einer Skala von 200 μm (A,B, links); 10x auf einer Skala von 100 μm (A,B, rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung der kausalen Rolle der Darmmikrobiota bei Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen besteht darin, die gesamte Mikrobiota oder ausgewählte Arten von Interesse auf keimfreie Mäuse zu übertragen. Hier beschreiben wir Protokolle zur Entnahme von Kotproben von Menschen und konventionell untergebrachten Mäusen in keimfreie Mäuse, um die Rolle der Darmmikrobiota bei Bluthochdruckerkrankungen zu untersuchen.
Bei Mäusen verwenden wir aseptisch gesammelte Blinddarminhalte, die in einer aeroben Kammer verarbeitet werden, und beim Menschen sammeln wir Kot. Die FMT kann sofort durchgeführt werden, während die Probe noch frisch ist, oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei -80 °C aufbewahrt werden. Wenn die Probe nicht sofort eingefroren werden kann, wie z. B. bei Menschen, die ihre Proben zu Hause sammeln, ist es wichtig, ein Konservierungsmittel für Nukleinsäuren wie Ethanol zu verwenden. Die meisten Bakterien im Darm sind anaerobier; Bei der Vorbereitung der Kotproben für die Transplantation muss dies schnell erfolgen, um zu vermeiden, dass Bakterien aeroben Umgebungen ausgesetzt werden, da dies die Wirksamkeit aufgrund einer verringerten Menge an anaeroben Stoffen in der Mischungverringern kann 27. Für eine Längsschnittstudie sollte die metagenomische Sequenzierung der Proben gemeinsam durchgeführt werden, um Batch-Effekte zu vermeiden. Proben für FMT können von einem oder mehreren Spendern stammen, die gepoolt und dann an mehrere Empfänger in den Versuchsgruppen verteilt werden.
Es ist äußerst wichtig, dass der Erfolg der FMT experimentell bestätigt wird, bevor mechanistische Implikationen untersucht werden. Der Gehalt an Fäkalien oder Blinddarm kann durch Metagenomik analysiert und Ähnlichkeiten zwischen Spendern und Empfängern bewertet werden. Die erwarteten Ergebnisse wären eine ähnliche mikrobielle Diversität durch Alpha-Diversitätsindizes, Hauptkoordinatenanalysen und funktionelle Profile. Erst dann lässt sich der Schluss ziehen, dass die Darmmikrobiota eine wichtige Rolle bei der Ätiologie der Krankheit spielt. Dieser Schritt ist umso wichtiger, wenn in der Studie Mäuse in konventioneller Haltung verwendet werden, die mit Antibiotika vorbehandelt wurden, um ihre endemische Mikrobiota zu dezimieren. Denn wenn dieser Schritt nicht erfolgreich war, können die Bakterien der überlebenden Empfänger den Krankheitsverlauf beeinflussen. Eine erfolgreiche FMT, insbesondere in präklinischen Studien, führt jedoch nicht immer zu einer aussagekräftigen klinischen Translation. Daher sind zusätzliche Bestätigungsschritte erforderlich, um direkte darmbezogene Mechanismen in die Pathophysiologie der Krankheit einzubeziehen, einschließlich Veränderungen in der Darmmorphologie unter Verwendung der hier beschriebenen Swiss-Roll-Technik.
Es gibt eine nachgewiesene direkte Rolle der Immunzellaktivierung bei der Entwicklung von Bluthochdruck, die durch adoptive Transferstudien nachgewiesen wurde28,29,30. Obwohl keimfreie Mäuse der Goldstandard bei der Bestimmung einer kausalen Rolle der Mikrobiota bei Krankheiten sind, kann das Modell bei der Untersuchung von Entzündungsmechanismen kardiometabolischer Erkrankungen eingeschränkt sein. Keimfreie Mäuse haben ein unentwickeltes Immunsystem, was ihre translationale Relevanz bei der Untersuchung des Zusammenspiels zwischen Darmmikrobiota und Entzündung dämpft. Alternativ kann dieses Protokoll modifiziert werden, um Kotproben in herkömmliche Mäuse zu transplantieren, nachdem ihre Mikrobiota mit Antibiotika oder einer Darmreinigung mit Polyethylenglykol erschöpft wurde31,32. FMT in konventionell gehaltenen Mäusen, die mit Antibiotika vorbehandelt wurden, macht die streng kontrollierte und teure Umgebung überflüssig, die erforderlich ist, um keimfreie Mäuse zu erhalten. Die aktuelle Evidenz zeigt, dass die Wahl der Antibiotika, ob eines oder eine Kombination, und das Behandlungsprotokoll zwischen den Studien variieren33,34,35. Die Wahl der Antibiotika bestimmt die Arten von Bakterien, die aufgrund unterschiedlicher Wirkmechanismen dezimiert werden, und beeinflusst folglich den Phänotyp. Daher sollte das Versuchsdesign die Arten von Bakterien berücksichtigen, von denen bekannt ist, dass sie den Phänotyp vermitteln, und die Breitbandantibiotika, die Art der Verabreichung und das Schema sollten entsprechend ausgewählt werden.
Dieses Protokoll hat seine Grenzen. Keimfreie Mäuse werden in gnotobiotischen Einrichtungen gehalten, was experimentelle Verfahren zur Untersuchung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen schwierig macht. Zum Beispiel ist die Radiotelemetrie die Goldstandardmethode zur Messung des Blutdrucks, erfordert jedoch sehr invasive chirurgische Eingriffe. Für immune, naive keimfreie Mäuse ist das nicht praktikabel. Daher wird zu diesem Zweck eine nichtinvasive Schwanzmanschette verwendet, um eine mikrobielle Kontaminationzu vermeiden 12. Um relativ genaue Messungen mittels Schwanzmanschettenplethysmographie zu erhalten, werden die Tiere in der Regel vor systolischen Druckmessungen trainiert und an die Plattform gewöhnt. Bei keimfreien FMT-Studien sollten Forscher in Betracht ziehen, mehrere Messungen zu sammeln und zumitteln36.
Diese Herausforderungen können auch bei anderen Endpunkten auftreten, die über den Blutdruck hinausgehen. Zum Beispiel erfordern Studien, die Verhaltensaspekte von Herz-Kreislauf-Erkrankungen untersuchen, oft eine häufige Handhabung und externe Exposition. Eine Studie, die die Auswirkungen einer ballaststoffreichen Ernährung bei mütterlicher, durch Fettleibigkeit verursachter kognitiver und sozialer Dysfunktion untersuchte, zeigte eine erfolgreiche FMT bei konventionellen Mäusen, die mit Antibiotika vorbehandelt wurden37. Studien, die longitudinale kardiovaskuläre Reaktionen untersuchen, können FMT bei konventionell gehaltenen Mäusen in Betracht ziehen.
Neben der Messung des Blutdrucks können die Tiere eingeschläfert und Gewebe für weitere Untersuchungen entnommen werden. Insbesondere muss der Blinddarminhalt gesammelt werden, um eine erfolgreiche Transplantation der transplantierten Mikrobiota zu beurteilen. Dieses detaillierte Protokoll wird die Forscher bei der Untersuchung des Mechanismus des Darmmikrobioms von der FMT bis zur Gewebeebene leiten und ist auf funktionelle Studien anwendbar. Dies ist bedeutsam, da es eine enorme Menge an methodischer und derzeit verfügbarer Literatur gibt. Für mechanistische Zwecke können Plasma, Darm, Nieren, Herzen und andere Gewebe entnommen werden, um die beteiligten Signalwege zu untersuchen. Die kausalen Auswirkungen der Darmmikrobiota bei Krankheiten hängen mit den von ihnen produzierten Metaboliten und ihrer Freisetzung in das System aufgrund eines undichten Darms zusammen. Die Gesundheit des gesamten Darms kann durch histologische und immunfärbende Ansätze beurteilt werden. Die Swiss-Roll-Technik wurde verwendet, um die Wirkung der FMT-Krankheit bei Mäusen zu demonstrieren12,24.
Der Beitrag der Darmmikrobiota bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Bluthochdruck bleibt assoziativ. Hier stellten wir methodische Ansätze vor, um Fäkalien von menschlichen Probanden oder konventionellen Mäusen zu sammeln, zu verarbeiten und in keimfreie Mäuse zu transplantieren. Das Protokoll fasst zusätzliche experimentelle Praktiken und Parameter zusammen, die untersucht werden sollen, um eine Ursache und/oder Wirkung der Darmmikrobiota auf die kardiometabolische Gesundheit zu beschreiben. Studien sollten wiederholt werden, um die Reproduzierbarkeit und Strenge des gewünschten Phänotyps zu gewährleisten.
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Disclosures
Es werden keine Interessenkonflikte, weder finanzieller noch sonstiger, von den Autoren erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch den Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (an A.K.) des National Center for Advancing Translational Sciences; Zuschuss der American Heart Association POST903428 (an J.A.I.); und National Heart, Lung, and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (an A.K.) und NIH-Grant 1P01HL116263 (an V.K.). Abbildung 1 wurde mit Biorender erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
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