Summary
L’objectif ici est de définir un protocole pour étudier les mécanismes de la dysbiose dans les maladies cardiovasculaires. Cet article explique comment collecter et transplanter de manière aseptique des échantillons fécaux murins, isoler les intestins et utiliser la méthode « Swiss-roll », suivie de techniques d’immunomarquage pour interroger les changements dans le tractus gastro-intestinal.
Abstract
La dysbiose du microbiote intestinal joue un rôle dans la physiopathologie des troubles cardiovasculaires et métaboliques, mais les mécanismes ne sont pas bien compris. La transplantation de microbiote fécal (TMF) est une approche précieuse pour délimiter un rôle direct du microbiote total ou des espèces isolées dans la physiopathologie de la maladie. C’est une option de traitement sûre pour les patients atteints d’une infection récurrente à Clostridium difficile . Des études précliniques démontrent que la manipulation du microbiote intestinal est un outil utile pour étudier le lien mécaniste entre dysbiose et maladie. La transplantation de microbiote fécal peut aider à élucider de nouvelles thérapies ciblant le microbiote intestinal pour la gestion et le traitement des maladies cardiométaboliques. Malgré un taux de réussite élevé chez les rongeurs, il reste des changements translationnels associés à la transplantation. L’objectif ici est de fournir des conseils pour étudier les effets du microbiome intestinal dans les maladies cardiovasculaires expérimentales. Dans cette étude, un protocole détaillé pour la collecte, la manipulation, le traitement et la transplantation du microbiote fécal dans les études sur les murins est décrit. Les étapes de collecte et de traitement sont décrites pour les donneurs humains et les rongeurs. Enfin, nous décrivons l’utilisation d’une combinaison des techniques de roulage suisse et d’immunomarquage pour évaluer la morphologie spécifique de l’intestin et les changements d’intégrité dans les maladies cardiovasculaires et les mécanismes connexes du microbiote intestinal.
Introduction
Les troubles cardiométaboliques, y compris les maladies cardiaques et les accidents vasculaires cérébraux, sont les principales causes mondiales de décès1. L’inactivité physique, une mauvaise alimentation, l’âge avancé et la génétique modulent la physiopathologie de ces troubles. L’accumulation de preuves soutient le concept selon lequel le microbiote intestinal affecte les troubles cardiovasculaires et métaboliques, y comprisle diabète de type 2, l’obésité3 et l’hypertension4, qui pourraient être essentiels au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ces maladies.
Les mécanismes exacts par lesquels le microbiote cause les maladies sont encore inconnus, et les études actuelles sont très variables, en partie en raison de différences méthodologiques. La transplantation de microbiote fécal (TMF) est une approche précieuse pour délimiter un rôle direct du microbiote total ou des espèces isolées dans la physiopathologie de la maladie. La FMT est largement utilisée dans les études animales pour induire ou supprimer un phénotype. Par exemple, l’apport calorique et le métabolisme du glucose peuvent être modulés en transférant des matières fécales d’un donneur malade à un receveur sain 5,6. Chez l’homme, la FMT s’est avérée être une option de traitement sûre pour les patients atteints d’une infection récurrente à Clostridium difficile 7. Des preuves à l’appui de son utilisation dans la gestion des maladies cardiovasculaires émergent; par exemple, la TMF des patients atteints du syndrome maigre au syndrome métabolique améliore la sensibilité à l’insuline8. La dysbiose intestinale est également associée à l’hypertension artérielle dans les études sur les humains et les rongeurs 9,10,11. La TMF de souris nourries avec un régime riche en sel dans des souris exemptes de germes prédispose les receveurs à l’inflammation et à l’hypertension12.
Malgré le taux élevé de réussite de la FMT chez les rongeurs, des défis de traduction demeurent. Les essais cliniques utilisant la TMF pour traiter l’obésité et le syndrome métabolique indiquent des effets minimes ou nuls sur ces troubles13,14,15. Ainsi, d’autres études sont nécessaires pour identifier des pistes thérapeutiques supplémentaires ciblant le microbiote intestinal pour le traitement des troubles cardiométaboliques. La plupart des preuves disponibles sur le microbiote intestinal et les maladies cardiovasculaires sont associatives. Le protocole décrit explique comment utiliser une combinaison de FMT et de la technique Swiss-rolling pour montrer à la fois une association entre la maladie et le microbiote intestinal et évaluer directement l’intégrité de toutes les parties de l’intestinintestinal 16,17,18.
L’objectif global de cette méthode est de fournir des conseils pour étudier les effets du microbiome intestinal dans les maladies cardiovasculaires expérimentales. Ce protocole fournit plus de détails et de considérations clés dans la conception expérimentale pour promouvoir la traduction physiologique et augmenter la rigueur et la reproductibilité des résultats.
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Protocol
Le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Vanderbilt a approuvé toutes les procédures décrites dans ce manuscrit. Les souris mâles C57B1/6 âgées de 3 mois, achetées au Jackson Laboratory, ont été hébergées et soignées conformément au Guide de soin et d’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Collecte, entreposage et traitement d’échantillons fécaux humains
- Prélever un échantillon de selles à l’aide d’un contenant stérile si le sujet est à la clinique. Réfrigérer les échantillons de selles à 4 °C dans les 36 heures suivant le prélèvement jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour le traitement. Vous pouvez également prélever des échantillons de selles à l’aide d’un outil disponible dans le commerce pour une stabilité facile et prolongée de l’ADN à température ambiante, en particulier pour une utilisation à domicile.
- Désinfectez une hotte de niveau de biosécurité avec une solution d’eau de Javel à 10% ou un autre désinfectant approuvé par l’Environmental Protection Agency.
- Retirer les selles du stockage au frais et les introduire dans la hotte; utiliser une spatule jetable pour faire ~1 g d’aliquotes et conserver dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit complètement prêt pour le traitement.
- Jetez tous les articles jetables dans les ordures biologiques dangereuses. Désinfectez toutes les surfaces (hotte et toutes les surfaces touchées par le processeur) et les objets retirés de la hotte.
2. Prélèvement aseptique d’échantillons fécaux de souris
REMARQUE : Utilisez des techniques aseptiques, y compris des instruments stérilisés.
- Euthanasier la souris par asphyxie au CO2 . Vaporisez la poitrine et les côtés de la souris avec de l’éthanol à 70% et ouvrez soigneusement la peau et la cavité péritonéale pour exposer le tractus gastro-intestinal.
- Isolez le caecum et utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour le couper en deux. Brièvement, exposez le caecum et coupez 0,5 cm à proximité de l’iléon et 0,5 cm distalement à sa jonction avec le côlon. Transférer le caecum isolé sur une boîte de Petri stérile.
- Utiliser une spatule stérile pour transférer le contenu des cæcaux dans des tubes stériles et conserver les aliquotes dans un congélateur à -80 °C19.
REMARQUE: Étant donné que la majorité des bactéries dans l’intestin sont anaérobies, l’exposition à l’oxygène peut endommager ou tuer les organismes pendant la procédure d’isolement dans une atmosphère ambiante. Ainsi, les échantillons fécaux doivent être isolés dans des chambres anaérobies pour maintenir la viabilité de la bactérie.
3. Transplantation de matières fécales
- Resuspendre les granulés fécaux frais ou préalablement congelés dans une solution saline stérile dans une proportion de 1:20 (p:v) et vortex jusqu’à homogénéisation.
- Passez l’homogénat à travers un filtre en nylon poreux de 30 μm pour éliminer les grosses particules. Centrifuger à 79 × g pendant 5 min et recueillir le surnageant pour l’utiliser pour la transplantation.
- Gavage oral 100 μL de lisier par souris receveuse exempte de germes pendant 3 jours consécutifs, suivi d’un gavage tous les 3 jours pendant 2 semaines. Utilisez des souris conventionnelles pour étudier les mécanismes du microbiote intestinal si elles ont d’abord été traitées avec des antibiotiques pour éliminer le microbiote endémique du receveur. Par exemple, administrer quotidiennement de la ceftriaxone (400 mg/kg) aux souris receveuses pendant 5 jours consécutifs par gavage oral avant le gavage du lisier fécal.
NOTE: Des études suggèrent qu’un minimum de 2 semaines de ce traitement est nécessaire pour provoquer des changements cardiovasculaires, y compris la pression artérielle20. - S’assurer que les souris receveuses exemptes de germes sont logées seules dans des isolateurs de film gnotobiotique et nourries avec de la nourriture et de l’eau stériles.
4. Mesures de la pression artérielle systolique
REMARQUE: Des souris gnotobiotiques qui ont reçu la FMT de souris C57Bl/6 âgées de 3 mois logées de manière conventionnelle ont été implantées avec des minipompes osmotiques (Alzet, modèle 2002) pour perfusion d’angiotensine II à faible dose (140 ng / kg / min) pendant 2 semaines. La pression artérielle était surveillée chaque semaine par un brassard de queue. Le protocole d’implantation de minipompes osmotiques a déjà été rapporté21. Le brassard de queue a été effectué comme brièvement résumé ci-dessous. Une méthode non invasive de mesure de la pression artérielle, telle que le brassard de queue, convient aux études FMT chez les souris gnotobiotiques. Les étapes détaillées sur la façon d’effectuer le brassard de queue ont été décrites précédemment22.
- Brièvement, récupérez les souris des isolateurs gnotobiotiques et préchauffez la plate-forme de la machine à manchettes de queue et le porte-souris.
- Placez les souris conscientes dans des dispositifs de contention sur la plate-forme chauffée et recueillez au moins trois séries de mesures de pression systolique en utilisant la pléthysmographie du brassard de queue. Effectuez les étapes suivantes ci-dessous 3 jours consécutifs avant les jours de mesure appropriés, pour entraîner les souris à être retenues afin de réduire le stress.
- Placez doucement la souris dans le support préchauffé et laissez la queue à l’extérieur. Collez soigneusement le dessus sans le pincer, afin de ne pas stresser la souris.
- Laissez la souris reposer dans le support; Placer sur la plate-forme pendant 3-5 minutes recouvert d’un drap pour acclimater.
- Faire la moyenne des mesures de toutes les rondes pour une pression systolique moyenne pour chaque animal.
5. Évaluation de la TMF aux changements cardiovasculaires
- Après la mesure de la pression artérielle, euthanasier les souris et recueillir de manière aseptique le contenu cæcal, comme décrit à la rubrique 2.
- Récolter les intestins et d’autres tissus, y compris le cœur, l’aorte, le foie, les artères mésentériques et les reins, pour examiner le rôle du microbiote intestinal dans la santé cardiométabolique. Pour prélever des tissus, localisez le tissu dans la souris et utilisez des ciseaux pour les exciser.
- Effectuer une analyse de séquençage métagénomique sur des échantillons fécaux/contenus cæcaux prélevés sur les souris donneuses et receveuses afin de confirmer la greffe du microbiote intestinal après la FMT23. La première preuve de la colonisation réussie du microbiote est de confirmer que le microbiote du donneur et du receveur sont similaires.
- Utiliser la technique Swiss-roll (voir rubrique 6) sur le tissu intestinal récolté, associée à l’immunomarquage et à l’histologie pour examiner les changements morphologiques et d’expression cellulaire24.
6. Faire des Swiss-rolls intestinaux intestinaux
- Jour 1
- Dans une souris correctement euthanasiée pulvérisée avec de l’éthanol à 70%, disséquer l’intestin de la souris du côté anal (fixé dans le rétropéritoine) au côté de l’estomac. Placer la totalité du tractus gastro-intestinal isolé dans une boîte de Petri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Tenez doucement l’extrémité proximale de l’extrémité de l’estomac et retirez la graisse environnante et le tissu conjonctif à la main.
- Isolez l’intestin grêle (céphalade de l’appendice) et faites un zigzag de type Z à chaque longueur. Ensuite, couper pour obtenir le duodénum, le jéjunum et l’iléon successivement, comme décrit précédemment25. Isolez le côlon en coupant la section de l’intestin sous le caecum.
- Couper le duodénum, le jéjunum, l’iléon et le côlon.
- Rincer et laver l’intestin à l’intérieur à l’aide de PBS avec une seringue et une aiguille avec un bout de bille, afin de ne pas déchirer l’intestin.
- Mettez l’intestin sur du papier filtre. Étiquetez le papier avec le nom de la section (p. ex., duodénum), puis « P » dans le coin supérieur droit pour le proximal ou « D » pour le coin inférieur droit.
- Couper l’intestin longitudinalement avec des ciseaux à bout de bille. Ouvrez l’intestin sur le papier filtre. Lavez avec plus de PBS au besoin.
- Sandwich l’intestin entre deux papiers filtres. Agrafez les papiers filtres en quatre points/coins près de l’intestin.
- Faire tremper dans une solution tampon neutre à 10 % de formol (4,0 g de phosphate de sodium monobasique, 6,5 g de phosphate de sodium, dibasique, 100 mL de formaldéhyde à 37 %, 900 mL d’eau distillée). Secouer à l’aide d’une bascule à plate-forme à 5 tr/min à température ambiante pendant la nuit.
- Jour 2
- Préparer l’agarose à 2% dans de l’eau distillée et chauffer avec une barre d’agitation dans un bécher recouvert de papier d’aluminium.
- Récupérer les tissus; Dénuder le papier filtre supérieur. Roulez l’intestin du côté proximal de sorte que le côté proximal pénètre d’abord à l’intérieur, et roulez vers l’intérieur pour que la lumière soit également à l’intérieur sur la lame. Épinglez avec une aiguille de 30 G ou deux, au besoin.
- Aspirer 1 mL d’agarose à l’aide de pipettes de transfert graduées jetables et verser l’agarose sur une section d’intestin roulé sur une surface plane tout en évitant les bulles d’air dans les tissus.
- Laisser l’agarose refroidir et solidifier. Utilisez une lame de rasoir pour couper l’agarose supplémentaire autour de la section de tissu.
- Placez les sections intestinales dans des cassettes de traitement / intégration de tissus (plus grandes que les cassettes régulières pour s’adapter à l’augmentation de la hauteur due à l’agarose). Faire tremper dans de l’éthanol à 70 % à 4 °C.
- Préparez des lames de tissus incrustés de paraffine et procédez à l’immunomarquage, comme indiqué ci-dessous.
7. Immunomarquage du tractus intestinal intestinal
- Désaffinisation
- Passez par les bains suivants avec des diapositives dans une grille: xylène pendant 3 min, xylène frais à nouveau pendant 3 min, xylène avec 100% éthanol (1:1) pendant 3 min, éthanol à 95% pendant 3 min, 70% éthanol pendant 3 min et 50% éthanol pendant 3 min.
- Rincer doucement à l’eau courante froide du robinet. Conserver dans un bain d’eau du robinet.
- Récupération d’antigènes
- Après la déparaffinisation, faire bouillir les lames dans une grille dans un bain de tampon de récupération d’antigène (citrate trisodique 0,01M dihydraté à pH 6 et 0,05% Tween-20) à 100 °C pendant 20 min.
- Courir sous l’eau froide du robinet.
- Coloration
- Retirez les lames du bain et placez le mouchoir face vers le haut dans une boîte à coulissants avec des lingettes de laboratoire humides / serviettes en papier dans le fond. Dessinez un contour autour du tissu avec un marqueur hydrophobe.
- Déposer la solution saline tamponnée Tris (TBS) + 0,025% Triton X-100 sur le tissu et incuber pendant 5 min. Répétez cette étape.
- Bloquer avec TBS + 10% de sérum fœtal bovin (FBS) + 1% d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 2 h à température ambiante. Tournez les lames sur le côté et retirez la mémoire tampon de blocage sur une lingette de laboratoire.
- Ajouter la solution d’anticorps primaires et incuber à 4 °C pendant au moins 2 h ou toute la nuit. Laver doucement avec TBS + 0,025% Triton X-100 en pipetant doucement ~200 μL sur la section.
- Ajouter la solution d’anticorps secondaires et incuber pendant 1 h à température ambiante. Rincer les lames 3 x 5 min avec TBS en les rinçant à la pipette, comme à l’étape 7.3.4.
- Montage avec support de montage et couvercle.
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Representative Results
Les étapes décrites ci-dessus sont résumées à la figure 1. Le contenu des cæcaux de souris ou les excréments humains sont remis en suspension dans une solution saline stérile pour préparer une suspension à donner à des souris exemptes de germes (100 μL) par gavage, d’abord pendant 3 jours consécutifs, puis une fois tous les 3 jours. À la fin du protocole, la pression artérielle est mesurée par la méthode du brassard de queue, les souris sont euthanasiées et les tissus sont prélevés pour évaluer les changements dans le microbiote intestinal et les changements cardiovasculaires et métaboliques.
Une étape clé dans le choix du microbiote est de s’assurer que le phénotype de la maladie d’intérêt est présent chez le donneur et est associé à des changements dysbiotiques. Par exemple, un régime riche en sel est fortement lié à la dysbiose et au dysfonctionnement cardiovasculaire. Cette étude a utilisé un donneur de souris nourri avec un régime NaCl à 8%. Les changements dans le microbiote intestinal en réponse à la teneur élevée en sel comprenaient une diminution de la biodiversité bactérienne (Figure 2A), qui s’est regroupée séparément du microbiote de sel normal (Figure 2B). Le rapport Firmicutes/Bacteroidetes a également augmenté (Figure 2C), suggérant des changements élevés du microbiote induits par le sel (modifiés d’après Ferguson et al.12).
Pour déterminer le rôle de la dysbiose induite par le sel élevé dans la prédisposition à l’hypertension, la TMF de souris nourries à haute teneur en sel à des souris exemptes de germes a été réalisée et des réponses de pression artérielle à une faible dose sous-pressive d’angiotensine II (Ang II) ont été évaluées. Des souris mâles C57BL/6 âgées de 3 mois ont été utilisées dans cette étude. Des souris receveuses ont été implantées avec des minipompes osmotiques pour administrer une faible dose continue d’Ang II (140 ng / kg /) pendant 2 semaines chez la souris. Les souris ayant reçu la FMT de donneurs nourris au sel ont présenté une augmentation significative de la pression artérielle avec le traitement par Ang II par rapport aux receveurs normaux de microbiote salin (Figure 3). Cette découverte indique que la FMT a amorcé les souris receveuses à développer une hypertension12. Des détails sur le protocole de brassard de queue chez les rongeurs ont déjà été rapportés12,26.
Le microbiote intestinal dysbiotique contribue à la maladie en partie à cause d’une paroi intestinale enflammée et perméable. Ainsi, l’examen de la paroi intestinale par immunohistochimie peut être utilisé pour interroger les changements dans des zones intestinales spécifiques dans n’importe quel état pathologique, même au-delà de la FMT. La figure 4 démontre que nous pouvons effectuer une immunohistochimie sur l’iléon en utilisant une technique Swiss-roll et divers marqueurs de coloration, tels que l’hématoxyline et l’éosine (H&E), le trichrome de Masson, et les marqueurs des cellules immunitaires tels que l’anti-CD3 et l’anti-CD68., comme décrit précédemment 12, et l’apolipoprotéine AI (AI), qui s’était accumulée dans l’iléon des souris protéinuriques (Figure 4).
Figure 1 : Diagramme résumant la conception du protocole. Les échantillons fécaux prélevés sur un sujet humain ou une souris conventionnelle sont utilisés pour la transplantation chez des souris exemptes de germes. Abréviations : FMT = transplantation de microbiote fécal ; PA = pression artérielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les souris suivant un régime riche en sel présentent une dysbiose du microbiote intestinal. (A) Estimation de la biodiversité des espèces dans la teneur en cæcales obtenue à partir de souris suivant un régime normal en sel (noir) et riche en sel (rouge). (B) La mise à l’échelle multidimensionnelle non métrique montre que les bactéries des souris normales de régime salé et riche en sel forment des grappes séparées. (C) Un taux élevé de sel est associé à une augmentation du rapport Firmicutes/Bacteroidetes. (***p < 0,0001, en utilisant les tests t de Student bilatéraux). Cette figure est adaptée de Ferguson et al.12. Abréviations : NMDS = mise à l’échelle multidimensionnelle non métrique; NS = sel normal; HS = teneur élevée en sel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La TMF de souris nourries à haute teneur en sel prédispose les souris exemptes de germes à l’hypertension induite par l’angiotensine II. Le transfert du microbiote intestinal dysbiotique induit par le sel a été associé à une augmentation significative de la pression systolique chez les souris exemptes de germes par rapport aux souris ayant reçu un microbiote intestinal salé normal. Cette figure est adaptée de Ferguson et al.12. Abréviations : FMT = transplantation de microbiote fécal ; PA = pression artérielle; Ang II = angiotensine II; NS = sel normal; HS = teneur élevée en sel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Image immunohistochimique illustrant comment évaluer les changements de marqueurs de la maladie dans l’intestin. Images représentatives montrant une coloration de l’apolipoprotéine AI dans l’ilée obtenue à partir de souris présentant une hyperlipidémie sans (A) ou avec (B) protéinurie. Grossissement: 5x à une échelle de 200 μm (A, B, à gauche); 10x à une échelle de 100 μm (A,B, droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Une approche utile pour étudier le rôle causal du microbiote intestinal dans les maladies cardiovasculaires et métaboliques consiste à transférer le microbiote total ou certaines espèces d’intérêt chez des souris exemptes de germes. Ici, nous décrivons des protocoles pour collecter des échantillons fécaux chez l’homme et des souris logées de manière conventionnelle dans des souris exemptes de germes afin d’étudier le rôle du microbiote intestinal dans les troubles hypertensifs.
Chez la souris, nous utilisons le contenu cæcal collecté de manière aseptique traité dans une chambre aérobie et, chez l’homme, nous prélevons les matières fécales. La FMT peut être effectuée immédiatement pendant que l’échantillon est encore frais ou surgelé dans de l’azote liquide et maintenu à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé. Si l’échantillon ne peut pas être congelé immédiatement, comme dans le cas des humains qui prélèvent leurs échantillons à la maison, il est important d’utiliser un agent de conservation pour les acides nucléiques tels que l’éthanol. La plupart des bactéries dans l’intestin sont anaérobies; Lors de la préparation des échantillons fécaux pour la transplantation, cela doit être fait rapidement pour éviter d’exposer les bactéries aux environnements aérobies, car cela peut réduire l’efficacité en raison d’une diminution de la quantité d’anaérobies dans le mélange27. Dans le cas d’une étude longitudinale, le séquençage métagénomique des échantillons doit être effectué ensemble pour éviter les effets de lot. Les échantillons de TMF peuvent provenir d’un ou de plusieurs donneurs regroupés et ensuite distribués à plusieurs receveurs dans les groupes expérimentaux.
Il est extrêmement crucial que le succès de la FMT soit confirmé expérimentalement avant d’explorer les implications mécanistes. Le contenu fécal ou cæcal peut être analysé par métagénomique et les similitudes évaluées entre donneurs et receveurs. Les résultats attendus seraient une diversité microbienne similaire grâce à des indices de diversité alpha, à l’analyse des coordonnées principales et à des profils fonctionnels. Ce n’est qu’alors que l’on peut en déduire la conclusion que le microbiote intestinal joue un rôle important dans l’étiologie de la maladie. Cette étape est encore plus importante si l’étude utilise des souris logées de manière conventionnelle qui ont été prétraitées avec des antibiotiques pour épuiser leur microbiote endémique. En effet, si cette étape n’a pas réussi, les bactéries des receveurs survivants peuvent influencer les résultats de la maladie. Cependant, une FMT réussie, en particulier dans les études précliniques, n’entraîne pas toujours une traduction clinique. Ainsi, des étapes de confirmation supplémentaires sont nécessaires pour impliquer les mécanismes directs liés à l’intestin dans la physiopathologie de la maladie, y compris les changements dans la morphologie intestinale en utilisant la technique Swiss-roll décrite ici.
Il existe un rôle direct établi de l’activation des cellules immunitaires dans le développement de l’hypertension, démontré par des études de transfert adoptif28,29,30. Bien que les souris exemptes de germes soient l’étalon-or pour déterminer un rôle causal du microbiote dans la maladie, le modèle peut être limité dans l’étude des mécanismes inflammatoires des maladies cardiométaboliques. Les souris exemptes de germes ont un système immunitaire non développé, ce qui atténue leur pertinence translationnelle dans l’étude de l’interaction entre le microbiote intestinal et l’inflammation. Alternativement, ce protocole peut être modifié pour transplanter des échantillons fécaux chez des souris conventionnelles, suite à l’épuisement de leur microbiote à l’aide d’antibiotiques ou au nettoyage des intestins avec du polyéthylèneglycol31,32. La FMT chez des souris logées de manière conventionnelle prétraitées avec des antibiotiques élimine le besoin de l’environnement strictement contrôlé et coûteux nécessaire au maintien de souris exemptes de germes. Les preuves actuelles démontrent que le choix des antibiotiques, qu’ils soient un ou une combinaison, et le protocole de traitement varient selon les études33,34,35. Le choix des antibiotiques déterminera les types de bactéries qui seront épuisées, en raison des variations des mécanismes d’action, et par conséquent affecteront le phénotype. Ainsi, la conception expérimentale devrait tenir compte des types de bactéries connues pour arbitrer le phénotype, et les antibiotiques à large spectre, le mode d’administration et le régime devraient être choisis en conséquence.
Ce protocole a ses limites. Les souris exemptes de germes sont gardées dans des installations gnotobiotiques, ce qui rend difficiles les procédures expérimentales liées à l’étude des maladies cardiovasculaires. Par exemple, la radiotélémétrie est la méthode de référence pour mesurer la pression artérielle, mais implique des procédures chirurgicales très invasives. Ce n’est pas pratique pour les souris immunes, naïves et exemptes de germes. Ainsi, un brassard de queue non invasif est utilisé à cette fin, pour éviter la contamination microbienne12. En règle générale, pour obtenir des mesures relativement précises à l’aide de la pléthysmographie du brassard de queue, les animaux sont entraînés et acclimatés à la plate-forme avant les mesures de pression systolique. Dans les études sur la TMF exempte de germes, les chercheurs devraient envisager de recueillir et de faire la moyenne de plusieurs mesures36.
Ces défis peuvent se présenter dans d’autres paramètres au-delà de la pression artérielle. Par exemple, les études explorant les aspects comportementaux des maladies cardiovasculaires nécessitent souvent des manipulations fréquentes et une exposition externe. Une étude explorant les effets d’un régime riche en fibres dans le dysfonctionnement cognitif et social induit par l’obésité maternelle a démontré le succès de la FMT chez des souris conventionnelles prétraitées avec des antibiotiques37. Les études explorant les réponses cardiovasculaires longitudinales peuvent envisager la TMF chez les souris logées de manière conventionnelle.
En plus de mesurer la pression artérielle, les animaux peuvent être euthanasiés et les tissus prélevés pour un examen plus approfondi. Notamment, le contenu cécal doit être collecté pour être évalué pour une greffe réussie du microbiote transplanté. Ce protocole détaillé guidera les chercheurs dans l’étude du mécanisme du microbiome intestinal de la TMF aux niveaux tissulaires, et est applicable aux études fonctionnelles. C’est important parce qu’il existe une énorme quantité de documentation méthodologique et actuellement disponible. À des fins mécanistes, le plasma, les intestins, les reins, les cœurs et d’autres tissus peuvent être récoltés pour étudier les voies impliquées. Les effets causals du microbiote intestinal dans la maladie sont liés aux métabolites qu’ils produisent et à leur libération dans le système en raison d’un intestin qui fuit. La santé de l’intestin entier peut être évaluée par des approches histologiques et immunodéformées. La technique Swiss-roll a été utilisée pour démontrer l’effet de la maladie FMT chez la souris12,24.
La contribution du microbiote intestinal dans les maladies cardiovasculaires telles que l’hypertension reste associative. Ici, nous avons présenté des approches méthodologiques pour collecter, traiter et transplanter des matières fécales de sujets humains ou de souris conventionnelles à des souris exemptes de germes. Le protocole résume les pratiques expérimentales et les paramètres supplémentaires à étudier pour déterminer une cause et/ou un effet du microbiote intestinal dans la santé cardiométabolique. Les études doivent être reproduites pour assurer la reproductibilité et la rigueur du phénotype souhaité.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts, financier ou autre, n’est déclaré par les auteurs.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par la subvention UL1TR002243 (à A.K.) du National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (à J.A.I.); et les subventions K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 du National Heart, Lung, and Blood Institute (à A.K.) et la subvention 1P01HL116263 des NIH (à V.K.). La figure 1 a été créée à l’aide de Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
References
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