Summary
Målet her er å skissere en protokoll for å undersøke mekanismene for dysbiose ved kardiovaskulær sykdom. Denne artikkelen diskuterer hvordan man aseptisk samler og transplanterer murine fekale prøver, isolerer tarmene og bruker "Swiss-roll" -metoden, etterfulgt av immunfargingsteknikker for å forhøre endringer i mage-tarmkanalen.
Abstract
Tarmmikrobiota dysbiose spiller en rolle i patofysiologien av kardiovaskulære og metabolske forstyrrelser, men mekanismene er ikke godt forstått. Fekal mikrobiotatransplantasjon (FMT) er en verdifull tilnærming til å avgrense en direkte rolle for den totale mikrobiota eller isolerte arter i sykdomspatofysiologi. Det er et trygt behandlingsalternativ for pasienter med tilbakevendende Clostridium difficile-infeksjon . Prekliniske studier viser at manipulering av tarmmikrobiota er et nyttig verktøy for å studere den mekanistiske koblingen mellom dysbiose og sykdom. Fekal mikrobiotatransplantasjon kan bidra til å belyse nye tarmmikrobiota-målrettede terapier for behandling og behandling av kardiometabolsk sykdom. Til tross for en høy suksessrate hos gnagere, er det fortsatt translasjonsendringer forbundet med transplantasjonen. Målet her er å gi veiledning i å studere effekten av tarmmikrobiom i eksperimentell kardiovaskulær sykdom. I denne studien er en detaljert protokoll for innsamling, håndtering, behandling og transplantasjon av fekal mikrobiota i murinstudier beskrevet. Innsamlings- og behandlingstrinnene er beskrevet for både menneskelige og gnagerdonorer. Til slutt beskriver vi ved hjelp av en kombinasjon av sveitsiske rullende og immunfargingsteknikker for å vurdere tarmspesifikk morfologi og integritetsendringer i kardiovaskulær sykdom og relaterte tarmmikrobiotamekanismer.
Introduction
Kardiometabolske forstyrrelser, inkludert hjertesykdom og hjerneslag, er de ledende globale dødsårsakene1. Fysisk inaktivitet, dårlig ernæring, fremskreden alder og genetikk modulerer patofysiologien til disse lidelsene. Akkumulerende bevis støtter konseptet om at tarmmikrobiota påvirker kardiovaskulære og metabolske forstyrrelser, inkludert type 2 diabetes2, fedme3 og hypertensjon4, som kan være nøkkelen til utviklingen av nye terapeutiske tilnærminger for disse sykdommene.
De eksakte mekanismene som mikrobiota forårsaker sykdommer er fortsatt ukjente, og nåværende studier er svært variable, delvis på grunn av metodologiske forskjeller. Fekal mikrobiotatransplantasjon (FMT) er en verdifull tilnærming til å avgrense en direkte rolle for den totale mikrobiota eller isolerte arter i sykdomspatofysiologi. FMT er mye brukt i dyreforsøk for å indusere eller undertrykke en fenotype. For eksempel kan kaloriinntak og glukosemetabolisme moduleres ved å overføre avføring fra en syk donor til en frisk mottaker 5,6. Hos mennesker har FMT vist seg å være et trygt behandlingsalternativ for pasienter med tilbakevendende Clostridium difficile-infeksjon 7. Bevis som støtter bruken i kardiovaskulær sykdomsbehandling kommer frem; for eksempel forbedrer FMT fra pasienter med magert til metabolsk syndrom insulinfølsomhet8. Tarmdysbiose er også forbundet med høyt blodtrykk i både humane og gnagerstudier 9,10,11. FMT fra mus matet et høyt salt diett i bakteriefrie mus predisponerer mottakerne for betennelse og hypertensjon12.
Til tross for den høye frekvensen av FMT-suksess hos gnagere, er det fortsatt translasjonsutfordringer. Kliniske studier ved bruk av FMT for å behandle fedme og metabolsk syndrom indikerer minimal eller ingen effekt på disse lidelsene13,14,15. Dermed er det behov for flere studier for å identifisere ytterligere terapeutiske veier rettet mot tarmmikrobiota for behandling av kardiometabolske forstyrrelser. Det meste av tilgjengelig bevis på tarmmikrobiota og kardiovaskulær sykdom er assosiativ. Den beskrevne protokollen diskuterer hvordan man bruker en kombinasjon av FMT og sveitsisk-rullende teknikk for å vise både en sammenheng mellom sykdom og tarmmikrobiota og direkte vurdere integriteten til alle deler av tarmtarmen16,17,18.
Det overordnede målet med denne metoden er å gi veiledning for å studere effekten av tarmmikrobiomet i eksperimentell kardiovaskulær sykdom. Denne protokollen gir flere detaljer og viktige hensyn i eksperimentell design for å fremme fysiologisk oversettelse og øke strengheten og reproduserbarheten av funnene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vanderbilt University's Institutional Animal Care and Use Committee godkjente alle prosedyrer beskrevet i dette manuskriptet. C57B1/6 hannmus ved 3 måneders alder, kjøpt fra The Jackson Laboratory, ble plassert og tatt vare på i samsvar med veiledningen for stell og bruk av forsøksdyr.
1. Innsamling, lagring og behandling av humane avføringsprøver
- Samle en avføringsprøve, ved hjelp av en steril beholder hvis motivet er i klinikken. Sett avføringsprøvene i kjøleskap ved 4 °C innen 36 timer etter oppsamling til de er klare for behandling. Alternativt kan du samle avføringsprøver ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig verktøy for enkel og utvidet DNA-stabilitet ved omgivelsestemperatur, spesielt for hjemmebruk.
- Desinfiser en avtrekkshette på biosikkerhetsnivå med en 10 % blekemiddelløsning eller annet desinfeksjonsmiddel godkjent av Environmental Protection Agency.
- Fjern avføringen fra kjølig oppbevaring og ta den inn i avtrekkshetten; bruk en engangsslikkepott til å lage ~1 g alikoter og oppbevar i en -80 °C fryser til den er helt klar til behandling.
- Kast alle engangsartikler i biohazard søppel. Desinfiser alle overflater (hette og overflater som berøres av prosessoren) og gjenstander som fjernes fra hetten.
2. Aseptisk innsamling av avføringsprøver fra mus
MERK: Bruk aseptiske teknikker, inkludert steriliserte instrumenter.
- Avlive musen ved CO2 kvelning. Spray brystet og sidene av musen med 70% etanol og åpne huden og bukhulen forsiktig for å eksponere mage-tarmkanalen.
- Isoler cecum og bruk steril kirurgisk saks for å kutte den i to. Eksponer kort cecum og kutt 0,5 cm proksimalt fra ileum og 0,5 cm distalt ved krysset med tykktarmen. Overfør det isolerte cecum til en steril petriskål.
- Bruk en steril slikkepott til å overføre cecalinnhold til sterile rør, og oppbevar alikoter i en fryser på -80 °C19.
MERK: Siden flertallet av bakterier i tarmen er anaerober, kan eksponering for oksygen skade eller drepe organismene under isolasjonsprosedyren i en romatmosfære. Dermed bør fekale prøver isoleres i anaerobe kamre for å opprettholde levedyktigheten til bakteriene.
3. Fekal materie transplantasjon
- Resuspender ferske eller tidligere frosne fekale pellets i sterilt saltvann i en 1:20 (b:v) andel og virvel til homogenisert.
- Før homogenatet gjennom et 30 μm pore nylonfilter for å fjerne store partikler. Sentrifuge ved 79 × g i 5 minutter og samle supernatanten til bruk for transplantasjon.
- Oral gavage 100 μL av slammet per bakteriefri mottakermus i 3 påfølgende dager, etterfulgt av gavage hver 3. dag i 2 uker. Bruk konvensjonelle mus til å studere mekanismer i tarmmikrobiota hvis de først har blitt behandlet med antibiotika for å eliminere mottakerens egen endemiske mikrobiota. For eksempel, administrer ceftriaxon (400 mg / kg) daglig til mottakermusene i 5 påfølgende dager med oral gavage før gavage av fekal oppslemming.
MERK: Studier tyder på at minst 2 uker av denne behandlingen er nødvendig for å fremkalle kardiovaskulære endringer, inkludert blodtrykk20. - Sørg for at bakteriefrie mottakermus er enkeltplassert i gnotobiotiske filmisolatorer og matet med steril mat og vann.
4. Systoliske blodtrykksmålinger
MERK: Gnotobiotiske mus som mottok FMT fra konvensjonelt plassert 3 måneder gamle C57Bl / 6-mus ble implantert med osmotiske minipumper (Alzet, modell 2002) for infusjon av lavdose angiotensin II (140 ng / kg / min) i 2 uker. Blodtrykket ble overvåket ukentlig via halemansjett. Protokollen for implantering av saltminipumper er tidligere rapportert21. Halemansjetten ble utført som kort oppsummert nedenfor. En ikke-invasiv metode for måling av blodtrykk, for eksempel halemansjett, er egnet for FMT-studier hos gnotobiotiske mus. De detaljerte trinnene for hvordan du utfører halemansjetten er beskrevet tidligere22.
- Kort sagt, hent musene fra gnotobiotiske isolatorer og forvarm halemansjettmaskinplattformen og museholderen.
- Plasser de bevisste musene i begrensninger på den oppvarmede plattformen og samle minst tre runder med systoliske trykkmålinger ved hjelp av halemansjettpletysmografi. Utfør følgende trinn nedenfor på 3 påfølgende dager før de riktige måledagene, for å trene mus til å være behersket for å redusere stress.
- Plasser musen forsiktig i den forvarmede holderen og la halen stå utenfor. Teip forsiktig ned toppen uten å klemme den, for ikke å stresse musen.
- La musen hvile i holderen; Plasser på plattformen i 3-5 min dekket av et ark for å akklimatisere seg.
- Gjennomsnittlig målingene fra alle rundene for et gjennomsnittlig systolisk trykk for hvert dyr.
5. Vurdering av FMT til kardiovaskulære endringer
- Etter blodtrykksmåling skal musene avlives og cecalinnholdet samles aseptisk, som beskrevet i avsnitt 2.
- Høst tarmene og annet vev, inkludert hjerte, aorta, lever, mesenteriske arterier og nyrer, for å undersøke tarmmikrobiotaens rolle i kardiometabolsk helse. For å høste vev, finn vevet i musen og bruk saks for å avgifte dem.
- Kjør en metagenomisk sekvenseringsanalyse på fekale prøver / cecalinnhold samlet fra donor- og mottakermus for å bekrefte engraftment av tarmmikrobiota etter FMT23. Det første beviset på vellykket kolonisering av mikrobiota er å bekrefte at giverens og mottakerens mikrobiota er like.
- Bruk Swiss-roll-teknikken (se avsnitt 6) på høstet tarmvev, kombinert med immunfarging og histologi for å undersøke morfologiske og cellulære uttrykksendringer24.
6. Å lage tarmtarm sveitserruller
- Dag 1
- I en riktig avlivet mus sprayet med 70% etanol, dissekere musens tarm fra analsiden (festet i retroperitoneum) til magesiden. Plasser hele den isolerte mage-tarmkanalen i en petriskål som inneholder fosfatbufret saltvann (PBS). Hold forsiktig den proksimale enden fra mageenden og fjern det omkringliggende fettet og bindevevet for hånd.
- Isoler tynntarmen (cephalad fra vedlegget) og lag en Z-type sikksakk med hver lengde. Deretter kuttes for å oppnå duodenum, jejunum og ileum suksessivt, som tidligere beskrevet25. Isoler tykktarmen ved å kutte delen av tarmen under cecum.
- Skjær tolvfingertarmen, jejunum, ileum og tykktarm.
- Skyll og vask tarmen innvendig med PBS med en sprøyte og en nål med en kulespiss, for ikke å rive tarmen.
- Legg tarmen på filterpapir. Merk papiret med navnet på seksjonen (f.eks. tolvfingertarm) og deretter 'P' øverst i høyre hjørne for proksimal eller 'D' for distal nederst i høyre hjørne.
- Klipp tarmen i lengderetningen med kulespisssaks. Åpne tarmen på filterpapiret. Vask med mer PBS etter behov.
- Sandwich tarmen mellom to filterpapir. Stift filterpapirene på fire punkter / hjørner nær tarmen.
- Bløtlegg i 10% formalinnøytral bufferløsning (4,0 g natriumfosfat, monobasisk, 6,5 g natriumfosfat, dibasisk, 100 ml 37% formaldehyd, 900 ml destillert vann). Rist med en plattformvipper ved 5 o / min ved romtemperatur over natten.
- Dag 2
- Forbered 2% agarose i destillert vann og varme med en rørestang i et beger dekket med aluminiumsfolie.
- Hent vevet; Strip det øvre filterpapiret. Rull tarmen fra den proksimale siden slik at den proksimale siden går inn først, og rull innover slik at lumen også er inne på lysbildet. Pin med en 30 G kanyle eller to, etter behov.
- Aspirer 1 ml agarose ved bruk av engangsoverføringspipetter, og hell agarose på et rullet tarmparti på en flat overflate mens du unngår luftbobler i vevet.
- La agarose avkjøles og stivne. Bruk et barberblad til å trimme den ekstra agarosen rundt vevsdelen.
- Sett tarmseksjonene i vevsbehandling / innebygging av kassetter (større enn de vanlige for å imøtekomme den økte høyden på grunn av agarose). Bløtlegg 70 % etanol ved 4 °C.
- Forbered parafin-innebygde vevsglass og fortsett til immunfarging, som beskrevet nedenfor.
7. Immunfarging av tarmens tarmkanal
- Deparaffinisering
- Pass gjennom følgende bad med lysbilder i et stativ: xylen i 3 minutter, fersk xylen igjen i 3 min, xylen med 100% etanol (1: 1) i 3 minutter, 95% etanol i 3 minutter, 70% etanol i 3 minutter og 50% etanol i 3 minutter.
- Skyll forsiktig med kaldt rennende vann fra springen. Oppbevares i et bad med vann fra springen.
- Uthenting av antigen
- Etter deparaffinering, kok lysbildene i et stativ i et bad med antigengjenfinningsbuffer (0,01M trinatriumcitratdihydrat ved pH 6 og 0,05% Tween-20) ved 100 °C i 20 minutter.
- Løp under kaldt vann fra springen.
- Flekker
- Fjern skliene fra badekaret og legg papirlommetørkleet med forsiden opp i en lysbildeboks med våtservietter/tørkepapir i bunnen. Tegn et omriss rundt vevet med en hydrofob markørpenn.
- Slipp Tris-bufret saltvann (TBS) + 0,025% Triton X-100 på vevet og inkuber i 5 minutter. Gjenta dette trinnet.
- Blokk med TBS + 10% føtal bovint serum (FBS) + 1% bovint serumalbumin (BSA) i 2 timer ved romtemperatur. Snu lysbildene på siden og fjern blokkeringsbufferen på en laboratorieserviett.
- Tilsett primær antistoffoppløsning og inkuber ved 4 °C i minst 2 timer eller over natten. Vask forsiktig med TBS + 0,025% Triton X-100 ved å pipettere ~200 μL forsiktig over seksjonen.
- Tilsett sekundær antistoffløsning og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Skyll lysbildene 3 x 5 min med TBS ved å skylle med en pipette, som i trinn 7.3.4.
- Monteres med monteringsmedium og deksel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trinnene beskrevet ovenfor er oppsummert i figur 1. Mus cecal innhold eller menneskelig avføring resuspenderes i steril saltoppløsning for å forberede en slurry for å gi til bakteriefrie mus (100 μL) ved gavage, først i 3 påfølgende dager, deretter en gang hver 3. På slutten av protokollen måles blodtrykket ved halemansjettmetoden, mus avlives, og vev høstes for vurdering av endringer i tarmmikrobiota og kardiovaskulære og metabolske forandringer.
Et viktig skritt i valg av mikrobiota er å sikre at sykdomsfenotypen av interesse er tilstede hos giveren og er forbundet med dysbiotiske forandringer. For eksempel er et høyt salt diett sterkt knyttet til dysbiose og kardiovaskulær dysfunksjon. Denne studien brukte en musedonor som ble matet med en 8% NaCl diett. Endringer i tarmmikrobiota som svar på det høye saltet inkluderte en reduksjon i bakteriell biodiversitet (figur 2A), som grupperte separat fra den normale saltmikrobiota (figur 2B). Firmicutes/Bacteroidetes-forholdet ble også økt (figur 2C), noe som tyder på høye saltinduserte mikrobiotaendringer (modifisert fra Ferguson et al.12).
For å bestemme rollen som høy saltindusert dysbiose i predisponering for hypertensjon, ble FMT fra høyt saltmatede mus til bakteriefrie mus utført og blodtrykksresponser på en lav subpressordose angiotensin II (Ang II) vurdert. C57BL/6 hannmus ved 3 måneders alder ble brukt i denne studien. Mottakermus ble implantert med osmotiske minipumper for å administrere en kontinuerlig lav dose Ang II (140 ng / kg /) i 2 uker hos mus. Mus som fikk FMT fra donorer med høyt saltinnhold, viste en signifikant økning i blodtrykket med Ang II-behandling sammenlignet med normale saltmikrobiotamottakere (figur 3). Dette funnet indikerer at FMT primet mottakermusene til å utvikle hypertensjon12. Detaljer om hale-mansjettprotokollen hos gnagere har blitt rapportert tidligere12,26.
Dysbiotisk tarmmikrobiota bidrar til sykdom delvis på grunn av en betent og lekk tarmvegg. Dermed kan undersøkelse av tarmveggen ved immunhistokjemi brukes til å forhøre endringer i spesifikke tarmområder i enhver sykdomstilstand selv utover FMT. Figur 4 viser at vi kan utføre immunhistokjemi på ileum ved hjelp av sveitserrulleteknikk og ulike flekkmarkører, som hematoksylin og eosin (H&E), Massons trikrom og immuncellemarkører som anti-CD3 og anti-CD68., som tidligere beskrevet 12, og apolipoprotein AI (AI), som hadde akkumulert i ileum hos proteinuriske mus (figur 4).
Figur 1: Diagram som oppsummerer protokollutformingen. Fekale prøver samlet fra et menneske eller konvensjonell mus brukes til transplantasjon i bakteriefrie mus. Forkortelser: FMT = fekal mikrobiotatransplantasjon; BP = blodtrykk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mus på saltrik diett viser tarmmikrobiotadysbiose. (A) Estimering av artens biologiske mangfold i cekalinnhold oppnådd fra mus på normale salt- (svarte) og saltrike (røde) dietter. (B) Ikke-metrisk flerdimensjonal skalering viser at bakteriene fra normalt salt og høyt salt diettmus danner separate klynger. (C) Høyt salt er assosiert med økt Firmicutes/Bacteroidetes-forhold. (***p < 0,0001, ved bruk av tosidige uparede Student t-tester). Denne figuren er tilpasset fra Ferguson et al.12. Forkortelser: NMDS = ikke-metrisk flerdimensjonal skalering; NS = normalt salt; HS = høyt salt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: FMT fra høysaltfôrede mus disponerer bakteriefrie mus for angiotensin II-indusert hypertensjon. Overføring av høy saltindusert dysbiotisk tarmmikrobiota var assosiert med signifikant økt systolisk trykk hos bakteriefrie mus sammenlignet med mus som fikk normal salttarmmikrobiota. Denne figuren er tilpasset fra Ferguson et al.12. Forkortelser: FMT = fekal mikrobiotatransplantasjon; BP = blodtrykk; Ang II = angiotensin II; NS = normalt salt; HS = høyt salt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Immunhistokjemibilde som illustrerer hvordan man kan vurdere sykdomsmarkørforandringer i tarmen. Representative bilder som viser apolipoprotein AI-flekk i ilea hentet fra mus som hadde hyperlipidemi uten (A) eller med (B) proteinuri. Forstørrelse: 5x ved en 200 μm skala (A, B, venstre); 10x i 100 μm skala (A,B, høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En verdifull tilnærming til å studere den kausale rollen som tarmmikrobiota i kardiovaskulær og metabolsk sykdom er å overføre den totale mikrobiota eller velge arter av interesse til bakteriefrie mus. Her beskriver vi protokoller for å samle fekale prøver fra mennesker og konvensjonelt plassert mus i bakteriefrie mus for å studere rollen som tarmmikrobiota i hypertensive lidelser.
Hos mus bruker vi aseptisk oppsamlet cecalinnhold behandlet i et aerobt kammer, og hos mennesker samler vi avføring. FMT kan utføres umiddelbart mens prøven fortsatt er fersk eller knipsefryst i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 °C til den er klar til bruk. Hvis prøven ikke kan fryses umiddelbart, for eksempel når det gjelder mennesker som samler prøvene hjemme, er det viktig å bruke et konserveringsmiddel for nukleinsyrer som etanol. De fleste bakterier i tarmen er anaerober; Ved klargjøring av fekale prøver for transplantasjon, må det gjøres raskt for å unngå å utsette bakterier for aerobe miljøer, da dette kan redusere effekten på grunn av redusert mengde anaerober i blandingen27. For en longitudinell studie bør metagenomisk sekvensering av prøvene utføres sammen for å unngå batcheffekter. Prøver for FMT kan komme fra en eller flere givere samlet sammen og deretter distribuert til flere mottakere på tvers av eksperimentelle grupper.
Det er ekstremt avgjørende at suksessen til FMT bekreftes eksperimentelt før man utforsker mekanistiske implikasjoner. Fekal eller cecal innhold kan analyseres ved metagenomikk og likheter vurderes mellom givere og mottakere. De forventede resultatene vil være lignende mikrobielt mangfold gjennom alfadiversitetsindekser, prinsipalkoordinatanalyse og funksjonelle profiler. Det er først da at konklusjonen om at tarmmikrobiota spiller en viktig rolle i sykdomsetiologi kan utledes. Dette trinnet er enda viktigere hvis studien benytter konvensjonelt innkvarterte mus som ble forbehandlet med antibiotika for å tømme deres endemiske mikrobiota. Dette skyldes at hvis dette trinnet ikke var vellykket, kan de overlevende mottakernes bakterier påvirke sykdomsutfallet. Vellykket FMT, spesielt i prekliniske studier, resulterer imidlertid ikke alltid i klinisk oversettelse. Dermed er ytterligere bekreftende skritt nødvendige for å implisere direkte tarmrelaterte mekanismer i sykdomspatofysiologi, inkludert endringer i tarmmorfologi ved hjelp av Swiss-roll-teknikken beskrevet her.
Det er en etablert direkte rolle immuncelleaktivering i utviklingen av hypertensjon, demonstrert gjennom adoptivoverføringsstudier28,29,30. Selv om bakteriefrie mus er gullstandarden for å bestemme mikrobiotaens årsaksrolle i sykdom, kan modellen være begrenset til å studere inflammatoriske mekanismer for kardiometabolske sykdommer. Bakteriefrie mus har et uutviklet immunsystem, noe som demper deres translasjonsrelevans for å studere samspillet mellom tarmmikrobiota og betennelse. Alternativt kan denne protokollen modifiseres for å transplantere fekale prøver til konvensjonelle mus, etter uttømming av mikrobiota ved bruk av antibiotika eller tarmrensing med polyetylenglykol31,32. FMT i konvensjonelt plassert mus forbehandlet med antibiotika eliminerer behovet for det strengt kontrollerte og dyre miljøet som kreves for å opprettholde bakteriefrie mus. Nåværende bevis viser at valg av antibiotika, enten en eller en kombinasjon, og behandlingsprotokoll varierer mellom studier33,34,35. Valget av antibiotika vil avgjøre hvilke typer bakterier som vil bli utarmet, på grunn av variasjoner i virkningsmekanismer, og dermed påvirke fenotypen. Den eksperimentelle utformingen bør derfor ta hensyn til bakterietypene som er kjent for å formidle fenotypen, og bredspektret antibiotika, administrasjonsmåte og diett bør velges tilsvarende.
Denne protokollen har sine begrensninger. Bakteriefrie mus holdes i gnotobiotiske fasiliteter, noe som gjør eksperimentelle prosedyrer knyttet til å studere kardiovaskulære sykdommer utfordrende. For eksempel er radiotelemetri gullstandardmetoden for å måle blodtrykk, men innebærer svært invasive kirurgiske prosedyrer. Dette er ikke praktisk for immune, naive bakteriefrie mus. Dermed brukes en ikke-invasiv halemansjett til dette formålet, for å unngå mikrobiell forurensning12. Vanligvis, for å oppnå relativt nøyaktige målinger ved hjelp av hale-mansjett pletysmografi, blir dyr trent og akklimatisert til plattformen før systoliske trykkmålinger. I bakteriefrie FMT-studier bør forskere vurdere å samle inn og gjennomsnitt flere målinger36.
Disse utfordringene kan forekomme i andre endepunkter utover blodtrykket. For eksempel krever studier som undersøker atferdsmessige aspekter ved kardiovaskulære sykdommer ofte hyppig håndtering og ekstern eksponering. En studie som undersøkte effekten av et fiberrikt kosthold i mors fedme-indusert kognitiv og sosial dysfunksjon viste vellykket FMT hos konvensjonelle mus som ble forbehandlet med antibiotika37. Studier som undersøker langsgående kardiovaskulære responser kan vurdere FMT i konvensjonelt plasserte mus.
I tillegg til å måle blodtrykk, kan dyr avlives og vev høstes for videre undersøkelser. Spesielt må cecalinnholdet samles inn for å bli evaluert for vellykket engraftment av den transplanterte mikrobiotaen. Denne detaljerte protokollen vil veilede forskere i å studere mekanismen til tarmmikrobiomet fra FMT til vevsnivå, og gjelder for funksjonelle studier. Dette er viktig fordi det er en enorm mengde metodologisk og tilgjengelig litteratur. For mekanistiske formål kan plasma, tarm, nyrer, hjerter og annet vev høstes for å undersøke de involverte veiene. De kausale effektene av tarmmikrobiota i sykdom er forbundet med metabolittene de produserer og deres frigjøring i systemet på grunn av en lekkende tarm. Helsen til hele tarmen kan vurderes gjennom histologiske og immunfargingsmetoder. Swiss-roll-teknikken har blitt brukt til å demonstrere effekten av sykdom FMT hos mus 12,24.
Bidraget fra tarmmikrobiota i kardiovaskulære sykdommer som hypertensjon forblir assosiativt. Her presenterte vi metodiske tilnærminger for å samle, behandle og transplantere avføring fra mennesker eller konvensjonelle mus til bakteriefrie mus. Protokollen oppsummerer ytterligere eksperimentell praksis og parametere for å undersøke å avgrense en årsak og / eller virkning av tarmmikrobiota i kardiometabolsk helse. Studier bør replikeres for å sikre reproduserbarhet og strenghet av ønsket fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter, økonomiske eller på annen måte, er erklært av forfatterne.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (til AK) fra National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (til J.A.I.); og National Heart, Lung, and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (til AK), og NIH stipend 1P01HL116263 (til VK). Figur 1 ble laget ved hjelp av Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
- Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
- Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
- Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
- Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
- Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
- Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
- Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
- Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
- Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
- Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
- Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
- Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
- Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
- Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
- Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
- Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
- Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
- Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
- Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
- Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
- Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M.
- Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
- Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
- Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer's disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
- Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
- Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).
