Summary
O objetivo aqui é delinear um protocolo para investigar os mecanismos de disbiose na doença cardiovascular. Este artigo discute como coletar e transplantar amostras fecais murinas assepticamente, isolar intestinos e usar o método "Swiss-roll", seguido por técnicas de imunomarcação para interrogar alterações no trato gastrointestinal.
Abstract
A disbiose da microbiota intestinal desempenha um papel na fisiopatologia de distúrbios cardiovasculares e metabólicos, mas os mecanismos não são bem compreendidos. O transplante de microbiota fecal (FMT) é uma abordagem valiosa para delinear um papel direto da microbiota total ou de espécies isoladas na fisiopatologia da doença. É uma opção de tratamento segura para pacientes com infecção recorrente por Clostridium difficile . Estudos pré-clínicos demonstram que a manipulação da microbiota intestinal é uma ferramenta útil para estudar a ligação mecanicista entre disbiose e doença. O transplante de microbiota fecal pode ajudar a elucidar novas terapêuticas direcionadas à microbiota intestinal para o manejo e tratamento de doenças cardiometabólicas. Apesar de uma alta taxa de sucesso em roedores, ainda existem alterações translacionais associadas ao transplante. O objetivo aqui é fornecer orientação no estudo dos efeitos do microbioma intestinal em doenças cardiovasculares experimentais. Neste estudo, um protocolo detalhado para coleta, manuseio, processamento e transplante da microbiota fecal em estudos murinos é descrito. As etapas de coleta e processamento são descritas para doadores humanos e roedores. Finalmente, descrevemos o uso de uma combinação das técnicas de rolagem suíça e imunomarcação para avaliar alterações de morfologia e integridade específicas do intestino em doenças cardiovasculares e mecanismos relacionados da microbiota intestinal.
Introduction
Os distúrbios cardiometabólicos, incluindo doenças cardíacas e acidentes vasculares cerebrais, são as principais causas globais de morte1. Inatividade física, má nutrição, avanço da idade e genética modulam a fisiopatologia desses distúrbios. Evidências acumuladas apoiam o conceito de que a microbiota intestinal afeta distúrbios cardiovasculares e metabólicos,incluindo diabetes tipo 2 2, obesidade3 e hipertensão4, o que pode ser uma chave para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para essas doenças.
Os mecanismos exatos pelos quais a microbiota causa doenças ainda são desconhecidos, e os estudos atuais são altamente variáveis, em parte devido a diferenças metodológicas. O transplante de microbiota fecal (FMT) é uma abordagem valiosa para delinear um papel direto da microbiota total ou de espécies isoladas na fisiopatologia da doença. FMT é amplamente utilizado em estudos com animais para induzir ou suprimir um fenótipo. Por exemplo, a ingestão calórica e o metabolismo da glicose podem ser modulados pela transferência de matéria fecal de um doador doente para um receptor saudável 5,6. Em humanos, o FMT tem se mostrado uma opção segura de tratamento para pacientes com infecção recorrente por Clostridium difficile 7. Evidências que apoiam seu uso no manejo de doenças cardiovasculares estão surgindo; por exemplo, o FMT de pacientes magros a com síndrome metabólica melhora a sensibilidade à insulina8. A disbiose intestinal também está associada à hipertensão arterial em estudos com humanos e roedores 9,10,11. FMT de camundongos alimentados com dieta rica em sal em camundongos livres de germes predispõe os receptores à inflamação e hipertensão12.
Apesar da alta taxa de sucesso de FMT em roedores, os desafios translacionais permanecem. Ensaios clínicos utilizando o FMT no tratamento da obesidade e da síndrome metabólica indicam efeitos mínimos ou nulos sobre esses distúrbios13,14,15. Assim, mais estudos são necessários para identificar vias terapêuticas adicionais visando a microbiota intestinal para o tratamento de distúrbios cardiometabólicos. A maioria das evidências disponíveis sobre a microbiota intestinal e doenças cardiovasculares é associativa. O protocolo descrito discute como utilizar uma combinação de FMT e a técnica de rolamento suíço para mostrar uma associação entre doença e microbiota intestinal e avaliar diretamente a integridade de todas as partes do intestino intestinal16,17,18.
O objetivo geral deste método é fornecer orientação para o estudo dos efeitos do microbioma intestinal na doença cardiovascular experimental. Este protocolo fornece mais detalhes e considerações importantes no planejamento experimental para promover a tradução fisiológica e aumentar o rigor e a reprodutibilidade dos achados.
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Protocol
O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Vanderbilt aprovou todos os procedimentos descritos neste manuscrito. Camundongos machos C57B1/6 aos 3 meses de idade, adquiridos do The Jackson Laboratory, foram alojados e cuidados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Coleta, armazenamento e processamento de amostras fecais humanas
- Coletar uma amostra de fezes, usando um recipiente estéril se o sujeito estiver na clínica. Refrigerar as amostras de fezes a 4 °C no prazo de 36 h após a colheita até estarem prontas para o processamento. Alternativamente, colete amostras de fezes usando uma ferramenta disponível comercialmente para uma estabilidade fácil e estendida do DNA à temperatura ambiente, especialmente para uso doméstico.
- Higienize um exaustor de nível de biossegurança com uma solução de água sanitária a 10% ou outro desinfetante aprovado pela Agência de Proteção Ambiental.
- Retire as fezes do armazenamento refrigerado e leve para o exaustor; use uma espátula descartável para fazer alíquotas de ~1 g e armazene em um freezer de -80 °C até ficar completamente pronto para o processamento.
- Descarte todos os itens descartáveis no lixo de risco biológico. Desinfete todas as superfícies (capuz e quaisquer superfícies tocadas pelo processador) e itens que estão sendo removidos do capô.
2. Coleta asséptica de amostras fecais de camundongos
NOTA: Use técnicas assépticas, incluindo instrumentos esterilizados.
- Eutanásia do camundongo por asfixia por CO2 . Borrife o peito e as laterais do rato com etanol a 70% e abra cuidadosamente a pele e a cavidade peritoneal para expor o trato gastrointestinal.
- Isole o ceco e use tesoura cirúrgica estéril para cortá-lo ao meio. Resumidamente, expor o ceco e cortar 0,5 cm proximalmente do íleo e 0,5 cm distalmente em sua junção com o cólon. Transfira o ceco isolado para uma placa de Petri estéril.
- Use uma espátula estéril para transferir o conteúdo cecal para tubos estéreis e armazene alíquotas em um freezer de -80 °C19.
NOTA: Como a maioria das bactérias no intestino são anaeróbias, a exposição ao oxigênio pode danificar ou matar os organismos durante o procedimento de isolamento em uma atmosfera ambiente. Assim, amostras fecais devem ser isoladas em câmaras anaeróbias para manter a viabilidade da bactéria.
3. Transplante de matéria fecal
- Ressuspender pellets fecais frescos ou previamente congelados em solução salina estéril na proporção de 1:20 (p:v) e vórtice até homogeneizar.
- Passe o homogeneizado através de um filtro de nylon de poros de 30 μm para remover partículas grandes. Centrifugar a 79 × g por 5 min e coletar o sobrenadante a ser usado para transplante.
- Gavagem oral de 100 μL do chorume por camundongo receptor livre de germes por 3 dias consecutivos, seguida de gavagem a cada 3 dias por 2 semanas. Use camundongos convencionais para estudar mecanismos da microbiota intestinal se eles tiverem sido tratados primeiro com antibióticos para eliminar a microbiota endêmica do próprio receptor. Por exemplo, administrar ceftriaxona (400 mg/kg) diariamente aos camundongos receptores por 5 dias consecutivos por gavagem oral antes da gavagem do chorume fecal.
NOTA: Estudos sugerem que um mínimo de 2 semanas deste tratamento é necessário para provocar alterações cardiovasculares, incluindo a pressão arterial20. - Certifique-se de que os camundongos receptores livres de germes sejam alojados em isoladores de filme gnotobióticos e alimentados com água e alimentos estéreis.
4. Medidas da pressão arterial sistólica
NOTA: Camundongos gnotobióticos que receberam FMT de camundongos C57Bl/6 com 3 meses de idade alojados convencionalmente foram implantados com minibombas osmóticas (Alzet, modelo 2002) para infusão de baixas doses de angiotensina II (140 ng/kg/min) por 2 semanas. A pressão arterial foi monitorada semanalmente através do manguito de cauda. O protocolo para implantação de minibombas osmóticas já foi relatadoanteriormente21. O manguito de cauda foi realizado como resumido a seguir. Um método não invasivo de medir a pressão arterial, como o manguito de cauda, é adequado para estudos de FMT em camundongos gnotobióticos. Os passos detalhados de como realizar o manguito de cauda foram descritos anteriormente22.
- Resumidamente, recupere os camundongos dos isoladores gnotobióticos e pré-aqueça a plataforma da máquina de manguito de cauda e o suporte do mouse.
- Coloque os ratos conscientes em contenções na plataforma aquecida e colete pelo menos três rodadas de medidas de pressão sistólica usando pletismografia do manguito de cauda. Execute as etapas a seguir abaixo em 3 dias consecutivos antes dos dias de medição adequados, para treinar os ratos a serem contidos a fim de reduzir o estresse.
- Coloque suavemente o rato no suporte pré-aquecido e deixe a cauda para fora. Tape cuidadosamente a parte superior sem beliscar, para não estressar o mouse.
- Deixe o mouse descansar no suporte; Coloque na plataforma por 3-5 min coberto por um lençol para se aclimatar.
- Média das medidas de todas as rodadas para uma pressão sistólica média para cada animal.
5. Avaliação do FMT para alterações cardiovasculares
- Após a medição da pressão arterial, eutanásia dos ratinhos e recolha assepticamente o conteúdo cecal, conforme descrito na secção 2 .
- Colher os intestinos e outros tecidos, incluindo o coração, aorta, fígado, artérias mesentéricas e rins, para examinar o papel da microbiota intestinal na saúde cardiometabólica. Para colher tecidos, localize o tecido no rato e use uma tesoura para excisá-los.
- Executar uma análise de sequenciamento metagenômico em amostras fecais/conteúdo cecal coletadas dos camundongos doador e receptor para confirmar o enxerto da microbiota intestinal após o FMT23. A primeira prova de colonização bem-sucedida da microbiota é confirmar que a microbiota do doador e do receptor são semelhantes.
- Utilizar a técnica de rolo suíço (ver secção 6) no tecido intestinal colhido, juntamente com imunomarcação e histologia para examinar alterações morfológicas e de expressão celular24.
6. Fazendo intestino intestino Swiss-rolls
- Dia 1
- Em um camundongo devidamente eutanasiado pulverizado com etanol 70%, disseque o intestino do camundongo do lado anal (fixado no retroperitônio) para o lado do estômago. Coloque a totalidade do trato gastrointestinal isolado em uma placa de Petri contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS). Segure suavemente a extremidade proximal da extremidade do estômago e remova a gordura circundante e o tecido conjuntivo com a mão.
- Isole o intestino delgado (cefalia do apêndice) e faça um ziguezague tipo Z com cada comprimento. Em seguida, cortar-se para obtenção sucessiva do duodeno, jejuno e íleo, conforme descritoanteriormente25. Isole o cólon cortando a seção do intestino abaixo do ceco.
- Corte o duodeno, jejuno, íleo e cólon.
- Lave e lave o intestino dentro usando PBS com uma seringa e uma agulha com uma ponta de bola, para não rasgar o intestino.
- Coloque o intestino em papel filtro. Rotule o papel com o nome da seção (por exemplo, duodeno) e, em seguida, 'P' no canto superior direito para proximal ou 'D' para distal no canto inferior direito.
- Corte o intestino longitudinalmente com uma tesoura de ponta de bola. Abra o intestino no papel de filtro. Lave com mais PBS conforme necessário.
- Sanduíche o intestino entre dois papéis de filtro. Grampeie os papéis de filtro em quatro pontos/cantos perto do intestino.
- Imersão em solução tampão neutra de formalina a 10% (4,0 g de fosfato de sódio, monobásico, 6,5 g de fosfato de sódio, dibásico, 100 mL de formaldeído a 37%, 900 mL de água destilada). Agite usando um balancim de plataforma a 5 rpm à temperatura ambiente durante a noite.
- Dia 2
- Prepare a agarose a 2% em água destilada e aqueça com uma barra de agitação num copo coberto com papel alumínio.
- Recuperar os tecidos; Retire o papel de filtro superior. Enrole o intestino do lado proximal para que o lado proximal entre primeiro, e role para dentro para que o lúmen fique dentro da lâmina também. Fixe com uma ou duas agulhas de 30 G, conforme necessário.
- Aspirar 1 mL de agarose usando pipetas de transferência de graduação descartáveis e despeje a agarose em uma seção de intestino enrolado em uma superfície plana, evitando bolhas de ar nos tecidos.
- Deixe a agarose arrefecer e solidificar. Use uma lâmina de barbear para aparar a agarose extra ao redor da seção de tecido.
- Coloque as seções intestinais em de processamento/incorporação de tecidos (maiores que as normais para acomodar o aumento da altura devido à agarose). Mergulhe em etanol 70% a 4 °C.
- Prepare lâminas de tecido emblocadas em parafina e proceda à imunomarcação, conforme descrito abaixo.
7. Imunomarcação do trato intestinal intestinal
- Desparafinização
- Passe pelos seguintes banhos com lâminas em rack: xileno por 3 min, xileno fresco novamente por 3 min, xileno com etanol 100% (1:1) por 3 min, etanol 95% por 3 min, etanol 70% por 3 min e etanol 50% por 3 min.
- Enxágue suavemente com água corrente fria da torneira. Armazenar em um banho de água da torneira.
- Recuperação de antígenos
- Após a desparafinização, ferver as lâminas em um rack em um banho de tampão de recuperação de antígeno (citrato trissódico 0,01M di-hidratado em pH 6 e 0,05% Tween-20) a 100 °C por 20 min.
- Corra sob água fria da torneira.
- Mancha
- Retire as lâminas do banho e coloque o lenço virado para cima em uma caixa de slides com lenços umedecidos/toalhas de papel no fundo. Desenhe um contorno ao redor do tecido com uma caneta marcador hidrofóbica.
- Soltar solução salina tamponada com Tris (TBS) + Triton X-100 a 0,025% sobre o tecido e incubar por 5 min. Repita esta etapa.
- Bloqueio com TBS + 10% de soro fetal bovino (SFB) + 1% de albumina de soro bovino (BSA) por 2 h à temperatura ambiente. Vire as lâminas de lado e remova o buffer de bloqueio em um lenço de laboratório.
- Adicionar solução primária de anticorpos e incubar a 4 °C durante, pelo menos, 2 h ou durante a noite. Lave suavemente com TBS + 0,025% Triton X-100 pipetando suavemente ~200 μL sobre a seção.
- Adicionar solução de anticorpos secundários e incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Enxaguar as lâminas 3 x 5 min com TBS enxaguando com uma pipeta, como no passo 7.3.4.
- Montagem com meio de montagem e uma lamínula.
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Representative Results
As etapas descritas acima estão resumidas na Figura 1. O conteúdo cecal de camundongos ou fezes humanas são ressuspensos em soro fisiológico estéril para preparar uma pasta para dar a camundongos livres de germes (100 μL) por gavagem, primeiro por 3 dias consecutivos, depois uma vez a cada 3 dias. Ao final do protocolo, a pressão arterial é medida pelo método do manguito de cauda, camundongos são eutanasiados e tecidos são colhidos para avaliação de mudanças na microbiota intestinal e alterações cardiovasculares e metabólicas.
Um passo fundamental na escolha da microbiota é garantir que o fenótipo de interesse da doença esteja presente no doador e esteja associado a alterações disbióticas. Por exemplo, uma dieta rica em sal está fortemente ligada à disbiose e disfunção cardiovascular. Este estudo utilizou um doador de camundongos que foi alimentado com uma dieta de NaCl a 8%. Mudanças na microbiota intestinal em resposta ao alto teor de sal incluíram uma diminuição na biodiversidade bacteriana (Figura 2A), que se agrupou separadamente da microbiota normal do sal (Figura 2B). A relação Firmicutes/Bacteroidetes também estava aumentada (Figura 2C), sugerindo altas alterações na microbiota induzida por sais (modificada de Ferguson et al.12).
Para determinar o papel da disbiose induzida por alto teor de sal na predisposição à hipertensão, FMT de camundongos alimentados com alto teor de sal para camundongos livres de germes foi realizado e as respostas da pressão arterial a uma baixa dose subpressora de angiotensina II (Ang II) foram avaliadas. Camundongos machos C57BL/6 aos 3 meses de idade foram utilizados neste estudo. Camundongos receptores foram implantados com minibombas osmóticas para administrar uma dose baixa contínua de Ang II (140 ng/kg/) por 2 semanas em camundongos. Camundongos que receberam FMT de doadores alimentados com alto teor de sal exibiram um aumento significativo na pressão arterial com o tratamento com Ang II em comparação com receptores normais de microbiota salina (Figura 3). Esse achado indica que o FMT preparou os camundongos receptores para desenvolver hipertensão12. Detalhes sobre o protocolo do manguito caudal em roedores foram relatados anteriormente 12,26.
A microbiota intestinal disbiótica contribui para a doença em parte devido a uma parede intestinal inflamada e com vazamento. Assim, o exame da parede intestinal por imunohistoquímica pode ser usado para interrogar alterações em áreas intestinais específicas em qualquer estado de doença, mesmo além da FMT. A Figura 4 demonstra que podemos realizar imunohistoquímica do íleo utilizando a técnica de rolo suíço e vários marcadores de coloração, como hematoxilina e eosina (H&E), tricrômico de Masson, e marcadores de células imunes, como anti-CD3 e anti-CD68., como descrito anteriormente12, e apolipoproteína AI (AI), que se acumularam no íleo de camundongos proteinúricos (Figura 4).
Figura 1: Diagrama resumindo o desenho do protocolo. Amostras fecais coletadas de um indivíduo humano ou camundongo convencional são usadas para transplante em camundongos livres de germes. Abreviações: FMT = transplante de microbiota fecal; PA = pressão arterial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Camundongos em dieta rica em sal apresentam disbiose da microbiota intestinal. (A) Estimativa da biodiversidade das espécies no conteúdo cecal obtido de camundongos em dietas normais salinas (pretas) e ricas em sal (vermelhas). (B) A escala multidimensional não métrica mostra que as bactérias de camundongos normais com sal e dieta rica em sal formam agrupamentos separados. (C) O alto teor de sal está associado a um aumento da relação Firmicutes/Bacteroidetes. (***p < 0,0001, utilizando testes t de Student bicaudais não pareados). Esse número é adaptado de Ferguson et al.12. Abreviações: NMDS = escala multidimensional não métrica; NS = sal normal; SH = sal alto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: FMT de camundongos alimentados com alto teor de sal predispõe camundongos livres de germes à hipertensão induzida por angiotensina II. A transferência de microbiota intestinal disbiótica induzida por alto teor de sal foi associada a um aumento significativo da pressão sistólica em camundongos livres de germes em comparação com camundongos que receberam microbiota intestinal normal de sal. Esse número é adaptado de Ferguson et al.12. Abreviações: FMT = transplante de microbiota fecal; PA = pressão arterial; Ang II = angiotensina II; NS = sal normal; SH = sal alto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem imuno-histoquímica ilustrando como avaliar as alterações dos marcadores de doença no intestino. Imagens representativas mostrando a coloração da apolipoproteína AI no íleo obtidas de camundongos que apresentaram hiperlipidemia sem (A) ou com (B) proteinúria. Ampliação: 5x na escala de 200 μm (A,B, esquerda); 10x em uma escala de 100 μm (A,B, direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Uma abordagem valiosa para estudar o papel causal da microbiota intestinal em doenças cardiovasculares e metabólicas é transferir a microbiota total ou selecionar espécies de interesse para camundongos livres de germes. Aqui, descrevemos protocolos para coletar amostras fecais de humanos e camundongos convencionalmente alojados em camundongos livres de germes para estudar o papel da microbiota intestinal em doenças hipertensivas.
Em camundongos, usamos conteúdo cecal coletado assepticamente processado em câmara aeróbica e, em humanos, coletamos fezes. O FMT pode ser realizado imediatamente enquanto a amostra ainda estiver fresca ou congelada em nitrogênio líquido e mantida a -80 °C até estar pronta para ser usada. Se a amostra não puder ser congelada imediatamente, como no caso de humanos que coletam suas amostras em casa, é importante usar um conservante para ácidos nucléicos, como o etanol. A maioria das bactérias no intestino são anaeróbias; Ao preparar as amostras fecais para transplante, isso deve ser feito rapidamente para evitar a exposição de bactérias a ambientes aeróbios, pois isso pode reduzir a eficácia devido à diminuição da quantidade de anaeróbios na mistura27. Para um estudo longitudinal, o sequenciamento metagenômico das amostras deve ser realizado em conjunto para evitar efeitos de lote. As amostras para FMT podem vir de um ou vários doadores agrupados e depois distribuídos para vários receptores nos grupos experimentais.
É extremamente crucial que o sucesso da FMT seja confirmado experimentalmente antes de explorar implicações mecanicistas. O conteúdo fecal ou cecal pode ser analisado por metagenômica e as semelhanças avaliadas entre doadores e receptores. Os resultados esperados seriam diversidade microbiana similar através de índices de diversidade alfa, análise de coordenadas principais e perfis funcionais. Somente então pode-se inferir a conclusão de que a microbiota intestinal desempenha um papel importante na etiologia da doença. Esse passo é ainda mais importante se o estudo utilizar camundongos alojados convencionalmente que foram pré-tratados com antibióticos para esgotar sua microbiota endêmica. Isso porque, se essa etapa não for bem-sucedida, as bactérias dos receptores sobreviventes podem influenciar os resultados da doença. No entanto, o sucesso do FMT, especialmente em estudos pré-clínicos, nem sempre resulta significativamente em tradução clínica. Assim, etapas confirmatórias adicionais são necessárias para implicar mecanismos diretos relacionados ao intestino na fisiopatologia da doença, incluindo mudanças na morfologia intestinal usando a técnica de Swiss-roll descrita aqui.
Existe um papel direto estabelecido da ativação de células imunes no desenvolvimento da hipertensão, demonstrado através de estudos de transferência adotiva28,29,30. Embora camundongos livres de germes sejam o padrão-ouro na determinação do papel causal da microbiota na doença, o modelo pode ser limitado no estudo de mecanismos inflamatórios de doenças cardiometabólicas. Camundongos livres de germes têm um sistema imunológico não desenvolvido, o que diminui sua relevância translacional no estudo da interação entre a microbiota intestinal e a inflamação. Alternativamente, esse protocolo pode ser modificado para transplantar amostras fecais em camundongos convencionais, após a depleção de sua microbiota com antibióticos ou limpeza intestinal com polietilenoglicol31,32. O FMT em camundongos convencionalmente alojados pré-tratados com antibióticos elimina a necessidade do ambiente rigorosamente controlado e caro que é necessário para manter os camundongos livres de germes. As evidências atuais demonstram que a escolha de antibióticos, se um ou uma combinação, e o protocolo de tratamento variam entre os estudos33,34,35. A escolha dos antibióticos determinará os tipos de bactérias que serão depletadas, devido a, variações nos mecanismos de ação, e consequentemente afetarão o fenótipo. Assim, o planejamento experimental deve levar em conta os tipos de bactérias conhecidas por mediar o fenótipo, e os antibióticos de amplo espectro, o modo de administração e o regime devem ser selecionados de acordo.
Esse protocolo tem suas limitações. Camundongos livres de germes são mantidos em instalações gnotobióticas, o que torna desafiadores os procedimentos experimentais relacionados ao estudo de doenças cardiovasculares. Por exemplo, a radiotelemetria é o método padrão-ouro para medir a pressão arterial, mas envolve procedimentos cirúrgicos muito invasivos. Isso não é prático para camundongos imunes e ingênuos livres de germes. Assim, um manguito não invasivo é utilizado para esse fim, para evitar contaminação microbiana12. Tipicamente, para obter medidas relativamente precisas usando pletismografia de manguito de cauda, os animais são treinados e aclimatados à plataforma antes das medidas de pressão sistólica. Em estudos de FMT livre de germes, os pesquisadores devem considerar a coleta e a média de múltiplas medidas36.
Esses desafios podem se apresentar em outros desfechos além da pressão arterial. Por exemplo, estudos que exploram aspectos comportamentais de doenças cardiovasculares frequentemente requerem manuseio frequente e exposição externa. Um estudo explorando os efeitos de uma dieta rica em fibras na disfunção cognitiva e social induzida pela obesidade materna demonstrou sucesso do FMT em camundongos convencionais pré-tratados com antibióticos37. Estudos que exploram respostas cardiovasculares longitudinais podem considerar o FMT em camundongos alojados convencionalmente.
Além de medir a pressão arterial, os animais podem ser eutanasiados e os tecidos colhidos para exames posteriores. Notavelmente, o conteúdo cecal deve ser coletado para ser avaliado para o sucesso da enxertia da microbiota transplantada. Este protocolo detalhado orientará os pesquisadores no estudo do mecanismo do microbioma intestinal desde o FMT até os níveis teciduais, e é aplicável a estudos funcionais. Isso é significativo porque há uma enorme quantidade de literatura metodológica e atualmente disponível. Para fins mecanicistas, plasma, intestinos, rins, corações e outros tecidos podem ser colhidos para investigar as vias envolvidas. Os efeitos causais da microbiota intestinal na doença estão ligados aos metabólitos que eles produzem e sua liberação no sistema devido a um intestino vazado. A saúde de todo o intestino pode ser avaliada através de abordagens histológicas e de imunomarcação. A técnica de Swiss-roll tem sido utilizada para demonstrar o efeito da doença FMT em camundongos 12,24.
A contribuição da microbiota intestinal em doenças cardiovasculares, como a hipertensão, permanece associativa. Aqui, apresentamos abordagens metodológicas para coletar, processar e transplantar matéria fecal de indivíduos humanos ou camundongos convencionais para camundongos livres de germes. O protocolo resume práticas experimentais adicionais e parâmetros a serem investigados no delineamento de uma causa e/ou efeito da microbiota intestinal na saúde cardiometabólica. Estudos devem ser replicados para garantir a reprodutibilidade e o rigor do fenótipo desejado.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse, financeiros ou não, declarados pelos autores.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (para A.K.) do National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (para J.A.I.); e National Heart, Lung, and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (para A.K.) e NIH grant 1P01HL116263 (para V.K.). A Figura 1 foi criada usando Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
References
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