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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

मुराइन फेकल अलगाव और माइक्रोबायोटा प्रत्यारोपण

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/64310
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 1
1Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine Vanderbilt University Medical Center and Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 2Division of Pediatric Nephrology Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

यहां लक्ष्य कार्डियोवैस्कुलर बीमारी में डिस्बिओसिस के तंत्र की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करना है। यह पेपर चर्चा करता है कि कैसे म्यूरिन फेकल नमूनों को इकट्ठा और प्रत्यारोपण किया जाए, आंतों को अलग किया जाए, और "स्विस-रोल" विधि का उपयोग किया जाए, इसके बाद जठरांत्र संबंधी मार्ग में परिवर्तन ों से पूछताछ करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग तकनीक ों का उपयोग किया जाए।

Abstract

आंत माइक्रोबायोटा डिस्बिओसिस कार्डियोवैस्कुलर और चयापचय संबंधी विकारों के पैथोफिज़ियोलॉजी में एक भूमिका निभाता है, लेकिन तंत्र को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। फेकल माइक्रोबायोटा प्रत्यारोपण (एफएमटी) रोग पैथोफिज़ियोलॉजी में कुल माइक्रोबायोटा या पृथक प्रजातियों की प्रत्यक्ष भूमिका को रेखांकित करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है। यह आवर्तक क्लोस्ट्रीडियम डिफिसाइल संक्रमण वाले रोगियों के लिए एक सुरक्षित उपचार विकल्प है। प्रीक्लिनिकल अध्ययनों से पता चलता है कि आंत माइक्रोबायोटा में हेरफेर करना डिस्बिओसिस और बीमारी के बीच यांत्रिक लिंक का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। फेकल माइक्रोबायोटा प्रत्यारोपण कार्डियोमेटाबोलिक रोग के प्रबंधन और उपचार के लिए नए आंत माइक्रोबायोटा-लक्षित चिकित्सीय को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है। कृन्तकों में उच्च सफलता दर के बावजूद, प्रत्यारोपण से जुड़े ट्रांसलेशनल परिवर्तन बने हुए हैं। यहां लक्ष्य प्रयोगात्मक कार्डियोवैस्कुलर बीमारी में आंत माइक्रोबायोम के प्रभावों का अध्ययन करने में मार्गदर्शन प्रदान करना है। इस अध्ययन में, मुराइन अध्ययनों में फेकल माइक्रोबायोटा के संग्रह, हैंडलिंग, प्रसंस्करण और प्रत्यारोपण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। संग्रह और प्रसंस्करण चरणों को मानव और कृंतक दाताओं दोनों के लिए वर्णित किया गया है। अंत में, हम कार्डियोवैस्कुलर बीमारी और संबंधित आंत माइक्रोबायोटा तंत्र में आंत-विशिष्ट आकृति विज्ञान और अखंडता परिवर्तन का आकलन करने के लिए स्विस-रोलिंग और इम्यूनोस्टेनिंग तकनीकों के संयोजन का उपयोग करने का वर्णन करते हैं।

Introduction

हृदय रोग और स्ट्रोक सहित कार्डियोमेटाबोलिक विकार, मृत्यु के प्रमुख वैश्विक कारण हैं। शारीरिक निष्क्रियता, खराब पोषण, बढ़ती उम्र और आनुवंशिकी इन विकारों के पैथोफिज़ियोलॉजी को नियंत्रित करते हैं। साक्ष्य जमा करना इस अवधारणा का समर्थन करता है कि आंत माइक्रोबायोटा हृदय और चयापचय संबंधी विकारों को प्रभावित करता है, जिसमें टाइप 2 मधुमेह2, मोटापा3 और उच्च रक्तचाप4 शामिल हैं, जो इन बीमारियों के लिए नए चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास की कुंजी हो सकते हैं।

सटीक तंत्र जिसके द्वारा माइक्रोबायोटा बीमारियों का कारण बनता है, अभी भी अज्ञात हैं, और वर्तमान अध्ययन अत्यधिक परिवर्तनशील हैं, पद्धति गत मतभेदों के कारण। फेकल माइक्रोबायोटा प्रत्यारोपण (एफएमटी) रोग पैथोफिज़ियोलॉजी में कुल माइक्रोबायोटा या पृथक प्रजातियों की प्रत्यक्ष भूमिका को रेखांकित करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है। एफएमटी का व्यापक रूप से पशु अध्ययन में फेनोटाइप को प्रेरित करने या दबाने के लिए उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, कैलोरी सेवन और ग्लूकोज चयापचय को एक बीमार दाता से स्वस्थ प्राप्तकर्ता 5,6 में फेकल पदार्थ को स्थानांतरित करके नियंत्रित किया जा सकता है। मनुष्यों में, एफएमटी को आवर्तक क्लोस्ट्रीडियम डिफिसाइल संक्रमणवाले रोगियों के लिए एक सुरक्षित उपचार विकल्प के रूप में दिखाया गया है। कार्डियोवैस्कुलर रोग प्रबंधन में इसके उपयोग का समर्थन करने वाले सबूत उभर रहे हैं; उदाहरण के लिए, दुबला से चयापचय सिंड्रोम रोगियों तक एफएमटी इंसुलिन संवेदनशीलतामें सुधार करता है। आंत डिस्बिओसिस मानव और कृंतक दोनों अध्ययनों में उच्च रक्तचाप से भी जुड़ा हुआ है 9,10,11. चूहों से एफएमटी को रोगाणु मुक्त चूहों में उच्च नमक आहार खिलाया जाता है, जो प्राप्तकर्ताओं को सूजन और उच्च रक्तचाप12 के लिए प्रेरित करता है।

कृन्तकों में एफएमटी सफलता की उच्च दर के बावजूद, ट्रांसलेशनल चुनौतियां बनी हुई हैं। मोटापे और चयापचय सिंड्रोम के इलाज के लिए एफएमटी का उपयोग करने वाले नैदानिक परीक्षण इन विकारों पर न्यूनतम या कोई प्रभाव नहीं दर्शाते हैं13,14,15. इस प्रकार, कार्डियोमेटाबोलिक विकारों के उपचार के लिए आंत माइक्रोबायोटा को लक्षित करने वाले अतिरिक्त चिकित्सीय मार्गों की पहचान करने के लिए अधिक अध्ययन की आवश्यकता है। आंत माइक्रोबायोटा और कार्डियोवैस्कुलर बीमारी पर उपलब्ध अधिकांश सबूत सहयोगी हैं। वर्णित प्रोटोकॉल चर्चा करता है कि बीमारी और आंत माइक्रोबायोटा के बीच संबंध दिखाने के लिए एफएमटी और स्विस-रोलिंग तकनीक के संयोजन का उपयोग कैसे करें और सीधे आंतआंत 16,17,18 के सभी हिस्सों की अखंडता का आकलन करें।

इस पद्धति का समग्र लक्ष्य प्रयोगात्मक हृदय रोग में आंत माइक्रोबायोम के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए मार्गदर्शन प्रदान करना है। यह प्रोटोकॉल शारीरिक अनुवाद को बढ़ावा देने और निष्कर्षों की कठोरता और प्रजनन क्षमता को बढ़ाने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन में अधिक विवरण और महत्वपूर्ण विचार प्रदान करता है।

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Protocol

वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति ने इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी। जैक्सन प्रयोगशाला से खरीदे गए 3 महीने की उम्र में सी 57 बी 1/6 नर चूहों को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार रखा और देखभाल की गई थी।

1. मानव फेकल नमूनों का संग्रह, भंडारण और प्रसंस्करण

  1. यदि विषय क्लिनिक में है, तो बाँझ कंटेनर का उपयोग करके मल का नमूना एकत्र करें। प्रसंस्करण के लिए तैयार होने तक संग्रह के 36 घंटे के भीतर मल के नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें। वैकल्पिक रूप से, परिवेश के तापमान पर आसान और विस्तारित डीएनए स्थिरता के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरण का उपयोग करके मल के नमूने एकत्र करें, खासकर घर पर उपयोग के लिए।
  2. 10% ब्लीच समाधान, या अन्य पर्यावरण संरक्षण एजेंसी-अनुमोदित कीटाणुनाशक के साथ जैव सुरक्षा-स्तर फ्यूम हुड को साफ करें।
  3. मल को ठंडे भंडारण से निकालें और फ्यूम हुड में लाएं; ~ 1 ग्राम एलिकोट बनाने के लिए एक डिस्पोजेबल स्पैटुला का उपयोग करें और प्रसंस्करण के लिए पूरी तरह से तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
  4. बायोहेजार्ड कचरे में सभी डिस्पोजेबल वस्तुओं को फेंक दें। सभी सतहों (हुड और प्रोसेसर द्वारा स्पर्श की गई किसी भी सतह) और हुड से हटाए जा रहे आइटम को कीटाणुरहित करें।

2. माउस फेकल नमूनों का सड़न रोकनेवाला संग्रह।

नोट: निष्फल उपकरणों सहित सड़न रोकनेवाली तकनीकों का उपयोग करें।

  1. सीओ2 श्वासावरोध द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें। 70% इथेनॉल के साथ माउस की छाती और किनारों को स्प्रे करें और जठरांत्र संबंधी मार्ग को उजागर करने के लिए त्वचा और पेरिटोनियल गुहा को ध्यान से खोलें।
  2. सीकुम को अलग करें और इसे आधा काटने के लिए बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। संक्षेप में, सीकुम को उजागर करें और इलियम से समीपस्थ रूप से 0.5 सेमी और बृहदान्त्र के साथ इसके जंक्शन पर 0.5 सेमी दूर से काटें। पृथक सेकुम को बाँझ पेट्री डिश पर स्थानांतरित करें।
  3. सेसल सामग्री को बाँझ ट्यूबों में स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ स्पैटुला का उपयोग करें, और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर19 में एलिकोट स्टोर करें।
    नोट: चूंकि आंत में अधिकांश बैक्टीरिया एनारोबेस हैं, इसलिए ऑक्सीजन के संपर्क में आने से कमरे के वातावरण में अलगाव प्रक्रिया के दौरान जीवों को नुकसान या मार दिया जा सकता है। इस प्रकार, बैक्टीरिया की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए फेकल नमूनों को एनारोबिक कक्षों में अलग किया जाना चाहिए।

3. फेकल पदार्थ प्रत्यारोपण

  1. ताजा या पहले से जमे हुए फेकल छर्रों को बाँझ लवण में 1: 20 (डब्ल्यू: वी) अनुपात में और भंवर में तब तक फिर से निलंबित करें जब तक कि होमोजिनाइज़ न हो जाए।
  2. बड़े कण पदार्थ को हटाने के लिए 30 μm पोर नायलॉन फ़िल्टर के माध्यम से होमोजेनेट को पारित करें। 5 मिनट के लिए 79 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और प्रत्यारोपण के लिए उपयोग करने के लिए सतह पर तैरनेवाला एकत्र करें।
  3. लगातार 3 दिनों के लिए प्रति रोगाणु-मुक्त प्राप्तकर्ता माउस के घोल के मौखिक गैवेज 100 μL, इसके बाद 2 सप्ताह के लिए हर 3 दिनों में गैवेज। आंत माइक्रोबायोटा के तंत्र का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक चूहों का उपयोग करें यदि उन्हें प्राप्तकर्ता के अपने स्थानिक माइक्रोबायोटा को खत्म करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पहली बार इलाज किया गया है। उदाहरण के लिए, फेकल घोल के गैवेज से पहले मौखिक गैवेज द्वारा लगातार 5 दिनों तक प्राप्तकर्ता चूहों को सेफ्ट्रियाक्सोन (400 मिलीग्राम / किग्रा) का सेवन करें।
    नोट: अध्ययनों से पता चलता है कि रक्तचाप20 सहित कार्डियोवैस्कुलर परिवर्तनों को प्राप्त करने के लिए इस उपचार के न्यूनतम 2 सप्ताह आवश्यक हैं।
  4. सुनिश्चित करें कि रोगाणु मुक्त प्राप्तकर्ता चूहों को जीनोबायोटिक फिल्म आइसोलेटर्स में एकल रखा जाता है और बाँझ भोजन और पानी के साथ खिलाया जाता है।

4. सिस्टोलिक रक्तचाप माप

नोट: पारंपरिक रूप से 3 महीने के सी 57बीएल /6 चूहों से एफएमटी प्राप्त करने वाले जीनोबायोटिक चूहों को 2 सप्ताह के लिए कम खुराक एंजियोटेंसिन II (140 एनजी / किग्रा / मिनट) के जलसेक के लिए आसमाटिक मिनीपंप (अल्ज़ेट, मॉडल 2002) के साथ प्रत्यारोपित किया गया था। टेल कफ के माध्यम से साप्ताहिक रक्तचाप की निगरानी की गई। आसमाटिक मिनीपंप ों को प्रत्यारोपित करने के लिए प्रोटोकॉल पहले21 बताया गया है। टेल-कफ का प्रदर्शन नीचे संक्षेप में संक्षेप में किया गया था। रक्तचाप को मापने की एक गैर-आक्रामक विधि, जैसे कि पूंछ कफ, जीनोबायोटिक चूहों में एफएमटी अध्ययन के लिए उपयुक्त है। पूंछ कफ करने के तरीके पर विस्तृत चरणों को पहले22 में वर्णित किया गया है।

  1. संक्षेप में, चूहों को जीनोबायोटिक आइसोलेटर्स से पुनः प्राप्त करें और पूंछ-कफ मशीन प्लेटफॉर्म और माउस धारक को पहले से गर्म करें।
  2. सचेत चूहों को गर्म मंच पर संयम में रखें और पूंछ कफ प्लेथिस्मोग्राफ़ी का उपयोग करके सिस्टोलिक दबाव माप के कम से कम तीन राउंड एकत्र करें। तनाव को कम करने के लिए चूहों को नियंत्रित करने के लिए प्रशिक्षित करने के लिए, उचित माप दिनों से पहले लगातार 3 दिनों में नीचे दिए गए निम्नलिखित चरणों का पालन करें।
    1. धीरे से माउस को पहले से गरम धारक में रखें और पूंछ को बाहर छोड़ दें। इसे चुटकी लेने के बिना शीर्ष को सावधानीपूर्वक टेप करें, ताकि माउस को तनाव न हो।
    2. माउस को धारक में आराम करने दें; 3-5 मिनट के लिए प्लेटफॉर्म पर रखें जो एक शीट द्वारा कवर किया गया है।
  3. प्रत्येक जानवर के लिए औसत सिस्टोलिक दबाव के लिए सभी राउंड से माप का औसत निकालें।

5. कार्डियोवैस्कुलर परिवर्तनों के लिए एफएमटी का आकलन

  1. रक्तचाप माप के बाद, चूहों को इच्छामृत्यु करें और सेप्टिक रूप से सेसल सामग्री एकत्र करें, जैसा कि खंड 2 में वर्णित है।
  2. कार्डियोमेटाबोलिक स्वास्थ्य में आंत माइक्रोबायोटा की भूमिका की जांच करने के लिए हृदय, महाधमनी, यकृत, मेसेंटेरिक धमनियों और गुर्दे सहित आंतों और अन्य ऊतकों की कटाई करें। ऊतकों की कटाई के लिए, माउस में ऊतक का पता लगाएं और उन्हें उत्पाद शुल्क देने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  3. एफएमटी23 के बाद आंत माइक्रोबायोटा के एनग्राफ्टमेंट की पुष्टि करने के लिए दाता और प्राप्तकर्ता चूहों से एकत्र किए गए फेकल नमूने / सीईसील सामग्री पर एक मेटाजीनोमिक अनुक्रमण विश्लेषण चलाएं। माइक्रोबायोटा के सफल उपनिवेशीकरण का पहला प्रमाण इस बात की पुष्टि कर रहा है कि दाता और प्राप्तकर्ता के माइक्रोबायोटा समान हैं।
  4. कटे हुए आंतों के ऊतकों पर स्विस-रोल तकनीक (अनुभाग 6 देखें) का उपयोग करें, जो रूपात्मक और सेलुलरअभिव्यक्ति परिवर्तनों की जांच करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग और हिस्टोलॉजी के साथ युग्मित है।

6. आंत आंत स्विस-रोल बनाना

  1. दिन 1
    1. 70% इथेनॉल के साथ छिड़के गए एक उचित इच्छामृत्यु माउस में, माउस आंत को गुदा पक्ष (रेट्रोपरिटोनियम में तय) से पेट की तरफ विच्छेदित करें। फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) युक्त पेट्री डिश में पृथक जठरांत्र संबंधी मार्ग की संपूर्णता रखें। धीरे से पेट के छोर से समीपस्थ छोर को पकड़ें और हाथ से आसपास के वसा और संयोजी ऊतक को हटा दें।
    2. छोटी आंत (परिशिष्ट से सेफलाड) को अलग करें और प्रत्येक लंबाई के साथ जेड-प्रकार का ज़िगज़ैग बनाएं। फिर, ग्रहणी, जेजुनम और इलियम को क्रमिक रूप से प्राप्त करने के लिए काट लें, जैसा कि पहले वर्णित25 था। सीकुम के नीचे आंत के खंड को काटकर बृहदान्त्र को अलग करें।
    3. ग्रहणी, जेजुनम, इलियम और बृहदान्त्र को काटें।
    4. पीबीएस का उपयोग करके आंत को सिरिंज और बॉल टिप के साथ सुई के साथ अंदर फ्लश और धोएं, ताकि आंत को फाड़ना न हो।
    5. आंत को फिल्टर पेपर पर रखें। कागज को अनुभाग के नाम (जैसे, ग्रहणी) के साथ लेबल करें और फिर समीपस्थ के लिए दाएं शीर्ष कोने पर 'पी' या दाएं निचले कोने पर डिस्टल के लिए 'डी' लेबल करें।
    6. बॉल-टिप कैंची के साथ आंत को अनुदैर्ध्य रूप से काटें। फ़िल्टर पेपर पर आंत खोलें। आवश्यकतानुसार अधिक पीबीएस के साथ धोएं।
    7. दो फिल्टर पेपर के बीच आंत को सैंडविच करें। फिल्टर पेपर को आंत के पास चार बिंदुओं / कोनों पर स्टेपल करें।
    8. 10% फॉर्मेलिन न्यूट्रल बफर घोल (4.0 ग्राम सोडियम फॉस्फेट, मोनोबेसिक, 6.5 ग्राम सोडियम फॉस्फेट, डिबेसिक, 100 एमएल 37% फॉर्मलाडेहाइड, 900 एमएल डिस्टिल्ड पानी) में भिगोएं। रात भर कमरे के तापमान पर 5 आरपीएम पर प्लेटफॉर्म रॉकर का उपयोग करके हिलाएं।
  2. दिन 2
    1. आसुत जल में 2% एगारोस तैयार करें और एल्यूमीनियम पन्नी से ढके बीकर में एक हलचल बार के साथ गर्मी करें।
    2. ऊतकों को पुनः प्राप्त करें; ऊपरी फ़िल्टर पेपर को पट्टी करें। समीपस्थ पक्ष से आंत को रोल करें ताकि समीपस्थ पक्ष पहले अंदर जाए, और अंदर की ओर लुढ़का ताकि लुमेन स्लाइड पर भी अंदर हो। आवश्यकतानुसार 30 ग्राम सुई या दो के साथ पिन करें।
    3. डिस्पोजेबल ग्रेजुएट ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके 1 एमएल एगारोस को एस्पिरेट करें, और ऊतकों में हवा के बुलबुले से बचते हुए एक सपाट सतह पर एक लुढ़का हुआ आंत अनुभाग पर अगारोस डालें।
    4. अगारोस को ठंडा और जमने दें। ऊतक अनुभाग के चारों ओर अतिरिक्त एग्रोस को ट्रिम करने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
    5. आंत के अनुभागों को ऊतक प्रसंस्करण / एम्बेडिंग कैसेट में रखें (एग्रोस के कारण बढ़ी हुई ऊंचाई को समायोजित करने के लिए नियमित लोगों की तुलना में बड़ा)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में भिगोएं।
    6. पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक स्लाइड तैयार करें और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए आगे बढ़ें, जैसा कि नीचे उल्लिखित है।

7. आंत आंत्र पथ का इम्यूनोस्टेनिंग

  1. डिपैराफिनाइजेशन
    1. एक रैक में स्लाइड के साथ निम्नलिखित स्नान के माध्यम से गुजरें: 3 मिनट के लिए जाइलिन, 3 मिनट के लिए फिर से ताजा जाइलिन, 3 मिनट के लिए 100% इथेनॉल (1: 1) के साथ जाइलिन, 3 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 3 मिनट के लिए 70% इथेनॉल, और 3 मिनट के लिए 50% इथेनॉल।
    2. ठंडे बहते नल के पानी से धीरे-धीरे कुल्ला करें। नल के पानी के स्नान में स्टोर करें।
  2. एंटीजन पुनर्प्राप्ति।
    1. डिपैराफिनाइजेशन के बाद, 20 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर एंटीजन रिट्रीवल बफर (पीएच 6 पर 0.01 एम ट्राइसोडियम साइट्रेट डाइहाइड्रेट और 0.05% ट्वीन -20) के स्नान में एक रैक में स्लाइड उबालें।
    2. ठंडे नल के पानी के नीचे चलाएं।
  3. धुंधला
    1. स्नान से स्लाइड हटा दें और ऊतक के चेहरे को स्लाइड बॉक्स में रखें, जिसमें नीचे गीले प्रयोगशाला वाइप्स / पेपर तौलिए हों। हाइड्रोफोबिक मार्कर पेन के साथ ऊतक के चारों ओर एक रूपरेखा खींचें।
    2. ट्रिस-बफर्ड सेलाइन (टीबीएस) + 0.025% ट्राइटन एक्स -100 को ऊतक पर गिराएं और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस चरण को दोहराएं।
    3. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए टीबीएस + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) + 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ ब्लॉक। स्लाइड्स को उनकी तरफ घुमाएं और एक प्रयोगशाला पोंछे पर ब्लॉकिंग बफर को हटा दें।
    4. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और कम से कम 2 घंटे या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। टीबीएस + 0.025% ट्राइटन एक्स -100 के साथ धीरे से धोएं और धीरे से अनुभाग पर ~ 200 μL पाइप करें।
    5. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। चरण 7.3.4 के रूप में पिपेट से कुल्ला करके टीबीएस के साथ 3 x 5 मिनट स्लाइड को कुल्ला करें।
    6. माउंटिंग मीडियम और एक कवरस्लिप के साथ माउंट।

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Representative Results

ऊपर वर्णित चरणों को चित्रा 1 में संक्षेपित किया गया है। माउस सेसल सामग्री या मानव मल को बाँझ खारा में फिर से निलंबित किया जाता है ताकि गैवेज द्वारा रोगाणु मुक्त चूहों (100 μL) को देने के लिए घोल तैयार किया जा सके, पहले लगातार 3 दिनों के लिए, फिर हर 3 दिनों में एक बार। प्रोटोकॉल के अंत में, रक्तचाप को पूंछ-कफ विधि द्वारा मापा जाता है, चूहों को इच्छामृत्यु दी जाती है, और आंत माइक्रोबायोटा और कार्डियोवैस्कुलर और चयापचय परिवर्तनों में परिवर्तन के आकलन के लिए ऊतकों की कटाई की जाती है।

माइक्रोबायोटा चुनने में एक महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि रुचि का रोग फेनोटाइप दाता में मौजूद है और डिस्बायोटिक परिवर्तनों से जुड़ा हुआ है। उदाहरण के लिए, एक उच्च नमक आहार दृढ़ता से डिस्बिओसिस और कार्डियोवैस्कुलर डिसफंक्शन से जुड़ा हुआ है। इस अध्ययन में एक माउस दाता का उपयोग किया गया था जिसे 8% एनएसीएल आहार खिलाया गया था। उच्च नमक के जवाब में आंत माइक्रोबायोटा में परिवर्तन में जीवाणु जैव विविधता (चित्रा 2 ए) में कमी शामिल थी, जो सामान्य नमक माइक्रोबायोटा (चित्रा 2 बी) से अलग थी। फर्मिक्यूट्स / बैक्टेरोइड्स अनुपात में भी वृद्धि हुई थी (चित्रा 2 सी), उच्च नमक-प्रेरित माइक्रोबायोटा परिवर्तनों का सुझाव देता है (फर्ग्यूसन एट अल .12 से संशोधित)।

उच्च रक्तचाप की प्रवृत्ति में उच्च नमक-प्रेरित डिस्बिओसिस की भूमिका निर्धारित करने के लिए, उच्च नमक वाले चूहों से रोगाणु-मुक्त चूहों तक एफएमटी का प्रदर्शन किया गया और एंजियोटेंसिन II (एंग II) की कम सबप्रेसर खुराक के लिए रक्तचाप प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया गया। इस अध्ययन में 3 महीने की उम्र में C57BL/6 नर चूहों का उपयोग किया गया था। प्राप्तकर्ता चूहों को चूहों में 2 सप्ताह के लिए एंग II (140 एनजी / किग्रा / ) की निरंतर कम खुराक देने के लिए आसमाटिक मिनीपंप के साथ प्रत्यारोपित किया गया था। उच्च नमक वाले दाताओं से एफएमटी प्राप्त करने वाले चूहों ने सामान्य नमक माइक्रोबायोटा प्राप्तकर्ताओं की तुलना में एंग द्वितीय उपचार के साथ रक्तचाप में उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन किया (चित्रा 3)। यह खोज इंगित करती है कि एफएमटी ने प्राप्तकर्ता चूहों को उच्च रक्तचाप12 विकसित करने के लिए प्रेरित किया। कृन्तकों में पूंछ-कफ प्रोटोकॉल पर विवरण पहले12,26 बताया गया है।

डिस्बायोटिक आंत माइक्रोबायोटा आंशिक रूप से सूजन और लीक आंत की दीवार के कारण बीमारी में योगदान देता है। इस प्रकार, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा आंतों की दीवार की जांच का उपयोग एफएमटी से परे भी किसी भी रोग की स्थिति में विशिष्ट आंत क्षेत्रों में परिवर्तन से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 4 दर्शाता है कि हम स्विस-रोल तकनीक और विभिन्न दाग मार्करों का उपयोग करके इलियम पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री कर सकते हैं, जैसे कि हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई), मैसन के ट्राइक्रोम, और प्रतिरक्षा कोशिका मार्कर जैसे एंटी-सीडी 3 और एंटी-सीडी 68, जैसा कि पहले वर्णित 12, और एपोलिपोप्रोटीन एआई (एआई), जो प्रोटीनमेह चूहों के इलियम में जमा हुआ था (चित्रा 4)।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल डिजाइन को सारांशित करने वाला आरेख। मानव विषय या पारंपरिक माउस से एकत्र किए गए फेकल नमूने रोगाणु मुक्त चूहों में प्रत्यारोपण के लिए उपयोग किए जाते हैं। संक्षेप: एफएमटी = फेकल माइक्रोबायोटा प्रत्यारोपण; बीपी = रक्तचाप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: उच्च नमक आहार पर चूहे आंत माइक्रोबायोटा डिस्बिओसिस का प्रदर्शन करते हैं। (ए) सामान्य नमक (काला) और उच्च नमक (लाल) आहार पर चूहों से प्राप्त सीईसील सामग्री में प्रजातियों की जैव विविधता का आकलन। (बी) नॉनमेट्रिक बहुआयामी स्केलिंग से पता चलता है कि सामान्य नमक और उच्च नमक आहार चूहों से बैक्टीरिया अलग-अलग क्लस्टर बनाते हैं। (ग) उच्च नमक का संबंध फर्मिक्यूट्स/बैक्टेरोइड्स अनुपात में वृद्धि से है। (**पी < 0.0001, दो पूंछ वाले अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके)। यह आंकड़ा फर्ग्यूसन एट अल .12 से अनुकूलित है। संक्षेप: एनएमडीएस = नॉनमेट्रिक बहुआयामी स्केलिंग; एनएस = सामान्य नमक; एचएस = उच्च नमक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: उच्च नमक वाले चूहों से एफएमटी रोगाणु मुक्त चूहों को एंजियोटेंसिन II-प्रेरित उच्च रक्तचाप के लिए प्रेरित करता है। उच्च नमक से प्रेरित डिस्बायोटिक आंत माइक्रोबायोटा को स्थानांतरित करना सामान्य नमक आंत माइक्रोबायोटा प्राप्त करने वाले चूहों की तुलना में रोगाणु मुक्त चूहों में सिस्टोलिक दबाव में काफी वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ था। यह आंकड़ा फर्ग्यूसन एट अल .12 से अनुकूलित है। संक्षेप: एफएमटी = फेकल माइक्रोबायोटा प्रत्यारोपण; बीपी = रक्तचाप; अंग II = एंजियोटेंसिन II; एनएस = सामान्य नमक; एचएस = उच्च नमक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि यह दर्शाती है कि आंत में रोग मार्कर परिवर्तनों का आकलन कैसे करें। इलिया में एपोलिपोप्रोटीन एआई दाग दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां चूहों से प्राप्त होती हैं जिनके पास (ए) या (बी) प्रोटीनमेह के बिना हाइपरलिपिडिमिया था। आवर्धन: 200 μm पैमाने पर 5x (A, B, बाएं); 100 μm पैमाने पर 10x (A, B, दाएं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

कार्डियोवैस्कुलर और चयापचय रोग में आंत माइक्रोबायोटा की कारण भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण कुल माइक्रोबायोटा या रुचि की चुनिंदा प्रजातियों को रोगाणु मुक्त चूहों में स्थानांतरित करना है। यहां, हम मनुष्यों से फेकल नमूने एकत्र करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और पारंपरिक रूप से उच्च रक्तचाप से ग्रस्त विकारों में आंत माइक्रोबायोटा की भूमिका का अध्ययन करने के लिए चूहों को रोगाणु मुक्त चूहों में रखते हैं।

चूहों में, हम एक एरोबिक कक्ष में संसाधित सड़न रोकनेवाला रूप से एकत्र सीईसील सामग्री का उपयोग करते हैं, और मनुष्यों में, मल एकत्र करते हैं। एफएमटी को तुरंत किया जा सकता है जबकि नमूना अभी भी तरल नाइट्रोजन में ताजा या स्नैप-जमे हुए है और उपयोग करने के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया है। यदि नमूना तुरंत जमे हुए नहीं हो सकता है, जैसे कि मनुष्यों के मामले में घर पर अपने नमूने एकत्र करना, इथेनॉल जैसे न्यूक्लिक एसिड के लिए एक संरक्षक का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। आंत में अधिकांश बैक्टीरिया एनारोबेस हैं; प्रत्यारोपण के लिए फेकल नमूने तैयार करते समय, बैक्टीरिया को एरोबिक वातावरण में उजागर करने से बचने के लिए इसे जल्दी से किया जाना चाहिए, क्योंकि यह मिश्रण में एनारोबेस की कम मात्रा के कारण प्रभावकारिता को कम कर सकताहै27. एक अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए, बैच प्रभाव से बचने के लिए नमूनों के मेटाजेनोमिक अनुक्रमण को एक साथ किया जाना चाहिए। एफएमटी के लिए नमूने एक या कई दाताओं से एक साथ आ सकते हैं और फिर प्रयोगात्मक समूहों में कई प्राप्तकर्ताओं को वितरित किए जा सकते हैं।

यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि यांत्रिक प्रभावों की खोज से पहले एफएमटी की सफलता की प्रयोगात्मक रूप से पुष्टि की जाए। फेकल या सेसल सामग्री का विश्लेषण मेटाजेनोमिक्स द्वारा किया जा सकता है और दाताओं और प्राप्तकर्ताओं के बीच समानता का मूल्यांकन किया जा सकता है। अपेक्षित परिणाम अल्फा विविधता सूचकांक, प्रमुख निर्देशांक विश्लेषण और कार्यात्मक प्रोफाइल के माध्यम से समान माइक्रोबियल विविधता होंगे। यह केवल तभी है कि यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि आंत माइक्रोबायोटा रोग एटियलजि में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह कदम और भी महत्वपूर्ण है यदि अध्ययन पारंपरिक रूप से रखे गए चूहों का उपयोग करता है जिन्हें उनके स्थानिक माइक्रोबायोटा को कम करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया गया था। ऐसा इसलिए है क्योंकि यदि यह कदम सफल नहीं था, तो जीवित प्राप्तकर्ताओं के बैक्टीरिया रोग के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं। हालांकि, सफल एफएमटी, विशेष रूप से प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में, हमेशा नैदानिक अनुवाद में सार्थक परिणाम नहीं देता है। इस प्रकार, रोग पैथोफिज़ियोलॉजी में प्रत्यक्ष आंत से संबंधित तंत्र को फंसाने के लिए अतिरिक्त पुष्टिकरण कदम आवश्यक हैं, जिसमें यहां वर्णित स्विस-रोल तकनीक का उपयोग करके आंत आकृति विज्ञान में परिवर्तन शामिल हैं।

उच्च रक्तचाप के विकास में प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण की एक स्थापित प्रत्यक्ष भूमिका है, जो दत्तक हस्तांतरण अध्ययन 28,29,30 के माध्यम से प्रदर्शित होती है। यद्यपि रोगाणु मुक्त चूहे बीमारी में माइक्रोबायोटा की एक कारण भूमिका निर्धारित करने में स्वर्ण मानक हैं, मॉडल कार्डियोमेटाबोलिक रोगों के भड़काऊ तंत्र का अध्ययन करने में सीमित हो सकता है। रोगाणु मुक्त चूहों में एक अविकसित प्रतिरक्षा प्रणाली होती है, जो आंत माइक्रोबायोटा और सूजन के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने में उनकी अनुवाद प्रासंगिकता को कम करती है। वैकल्पिक रूप से, इस प्रोटोकॉल को पारंपरिक चूहों में फेकल नमूनों को प्रत्यारोपित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करके उनके माइक्रोबायोटा की कमी या पॉलीथीन ग्लाइकॉल31,32 के साथ आंत्र सफाई के बाद। एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किए गए पारंपरिक रूप से रखे गए चूहों में एफएमटी सख्ती से नियंत्रित और महंगे वातावरण की आवश्यकता को समाप्त करता है जो रोगाणु मुक्त चूहों को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। वर्तमान सबूत दर्शाते हैं कि एंटीबायोटिक दवाओं की पसंद, चाहे एक या एक संयोजन, और उपचार प्रोटोकॉल33,34,35 अध्ययनों के बीच भिन्न होते हैं। एंटीबायोटिक दवाओं की पसंद बैक्टीरिया के प्रकार ों को निर्धारित करेगी जो कार्रवाई के तंत्र में भिन्नता के कारण समाप्त हो जाएंगे, और परिणामस्वरूप फेनोटाइप को प्रभावित करेंगे। इस प्रकार, प्रयोगात्मक डिजाइन को फेनोटाइप को मध्यस्थ करने के लिए जाने जाने वाले बैक्टीरिया के प्रकारों को ध्यान में रखना चाहिए, और व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिकदवाओं, प्रशासन के तरीके और आहार को तदनुसार चुना जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल की अपनी सीमाएं हैं। रोगाणु मुक्त चूहों को जीनोबायोटिक सुविधाओं में रखा जाता है, जो हृदय रोगों का अध्ययन करने से संबंधित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को चुनौतीपूर्ण बनाता है। उदाहरण के लिए, रेडियोटेलीमेट्री रक्तचाप को मापने के लिए स्वर्ण मानक विधि है, लेकिन इसमें बहुत आक्रामक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाएं शामिल हैं। यह प्रतिरक्षा, भोले रोगाणु-मुक्त चूहों के लिए व्यावहारिक नहीं है। इस प्रकार, माइक्रोबियल संदूषण से बचने के लिए, इस उद्देश्य के लिए एक नॉनइनवेसिव टेल-कफ का उपयोग किया जाताहै। आमतौर पर, टेल-कफ प्लेथिस्मोग्राफ़ी का उपयोग करके अपेक्षाकृत सटीक माप प्राप्त करने के लिए, जानवरों को सिस्टोलिक दबाव माप से पहले मंच पर प्रशिक्षित और अनुकूलित किया जाता है। रोगाणु मुक्त एफएमटी अध्ययनों में, शोधकर्ताओं कोकई मापों को एकत्र करने और औसत करने पर विचार करना चाहिए।

ये चुनौतियां रक्तचाप से परे अन्य समापन बिंदुओं में मौजूद हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों के व्यवहार संबंधी पहलुओं की खोज करने वाले अध्ययनों को अक्सर हैंडलिंग और बाहरी जोखिम की आवश्यकता होती है। मातृ मोटापे से प्रेरित संज्ञानात्मक और सामाजिक शिथिलता में उच्च फाइबर आहार के प्रभावों की खोज करने वाले एक अध्ययन ने पारंपरिक चूहों में सफल एफएमटी का प्रदर्शनकिया, जिन्हें एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया गया था। अनुदैर्ध्य कार्डियोवैस्कुलर प्रतिक्रियाओं की खोज करने वाले अध्ययन पारंपरिक रूप से रखे गए चूहों में एफएमटी पर विचार कर सकते हैं।

रक्तचाप को मापने के अलावा, जानवरों को इच्छामृत्यु दी जा सकती है और आगे की जांच के लिए ऊतकों को काटा जा सकता है। विशेष रूप से, प्रत्यारोपित माइक्रोबायोटा के सफल एनग्राफमेंट के लिए मूल्यांकन करने के लिए सीईसील सामग्री एकत्र की जानी चाहिए। यह विस्तृत प्रोटोकॉल एफएमटी से ऊतक स्तर तक आंत माइक्रोबायोम के तंत्र का अध्ययन करने में शोधकर्ताओं का मार्गदर्शन करेगा, और कार्यात्मक अध्ययनों पर लागू होता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि पद्धति और वर्तमान में उपलब्ध साहित्य की एक जबरदस्त मात्रा है। यंत्रवत उद्देश्यों के लिए, प्लाज्मा, आंतों, गुर्दे, दिल और अन्य ऊतकों को शामिल मार्गों की जांच करने के लिए काटा जा सकता है। रोग में आंत माइक्रोबायोटा के कारण प्रभाव उनके द्वारा उत्पादित मेटाबोलाइट्स से जुड़े होते हैं और एक लीक आंत के कारण सिस्टम में उनकी रिहाई होती है। हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोस्टेनिंग दृष्टिकोण के माध्यम से पूरे आंत के स्वास्थ्य का आकलन किया जा सकता है। स्विस-रोल तकनीक का उपयोग चूहों12,24 में रोग एफएमटी के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए किया गया है।

उच्च रक्तचाप जैसे हृदय रोगों में आंत माइक्रोबायोटा का योगदान सहयोगी बना हुआ है। यहां, हमने मानव विषयों या पारंपरिक चूहों से रोगाणु मुक्त चूहों में फेकल पदार्थ को इकट्ठा करने, संसाधित करने और प्रत्यारोपण करने के लिए पद्धतिगत दृष्टिकोण प्रस्तुत किए। प्रोटोकॉल कार्डियोमेटाबोलिक स्वास्थ्य में आंत माइक्रोबायोटा के कारण और / या प्रभाव को रेखांकित करने में जांच करने के लिए अतिरिक्त प्रयोगात्मक प्रथाओं और मापदंडों को सारांशित करता है। वांछित फेनोटाइप की प्रजनन क्षमता और कठोरता सुनिश्चित करने के लिए अध्ययन दोहराया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों द्वारा वित्तीय या अन्यथा हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया गया है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को नेशनल सेंटर फॉर एडवांस्ड ट्रांसलेशनल साइंसेज से वेंडरबिल्ट क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल साइंस अवार्ड ग्रांट यूएल 1टीआर 002243 (एके को) द्वारा समर्थित किया गया था; अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन ग्रांट पोस्ट 903428 (जेएआई को); और राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान अनुदान K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (ए.के.) और NIH अनुदान 1P01HL116263 (V.K.को)। चित्रा 1 बायोरेंडर का उपयोग करके बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost ThermoFisher B40932
Anaerobic chamber COY 7150220
Apolipoprotein AI Novus Biologicals NBP2-52979
Artery Scissors - Ball Tip Fine Science Tools 14086-09
Bleach solution Fisher Scientific 14-412-53
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific B14
CD3 antibody ThermoFisher  14-0032-82
CD68 monoclonal antibody ThermoFisher 14-0681-82
Centrifuge Fisher Scientific 75-004-221
CODA high throughput monitor Kent Scientic Corporation CODA-HT8
Cryogenic vials Fisher Scientific 10-500-26
Disposable graduate transfer pipettes Fisher Scientific 137119AM
Disposable syringes Fisher Scientific 14-823-2A
Ethanol Fisher Scientific AA33361M1
Feeding Needle Fine Science Tools 18061-38
Filter paper sheet Fisher Scientific 09-802
Formalin (10%) Fisher Scientific 23-730-581
High salt diet Teklad TD.03142
OMNIgene.GUT DNAgenotek OM-200+ACP102
Osmotic mini-pumps Alzet  MODEL 2002
PAP Pen Millipore Sigma Z377821-1EA
Petri dish Fisher Scientific AS4050
Pipette tips Fisher Scientific 21-236-18C
Pipettes Fisher Scientific 14-388-100
Serile Phosphate-buffered saline Fisher Scientific AAJ61196AP
Smart spatula Fisher Scientific NC0133733
Stool collection device Fisher Scientific 50-203-7255
TBS Buffer Fisher Scientific R017R.0000
Triton X-100 Millipore Sigma
9036-19-5
Varimix platform rocker Fisher Scientific 09047113Q
Vortex mixer Fisher Scientific 02-215-41
Xylene Fisher Scientific 1330-20-7, 100-41-4

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 195 फेकल माइक्रोबायोटा प्रत्यारोपण स्विस-रोल कार्डियोवैस्कुलर
मुराइन फेकल अलगाव और माइक्रोबायोटा प्रत्यारोपण
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Ishimwe, J. A., Zhong, J., Kon, V., Kirabo, A. Murine Fecal Isolation and Microbiota Transplantation. J. Vis. Exp. (195), e64310, doi:10.3791/64310 (2023).

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