Transferência de Embriões em Gene de frango por mais velhos Ovo ex Eletroporação

Um método de transferência de genes em embriões de galinha em fases posteriores de incubação (com mais de Hamburger e Hamilton fase (HH) 22) é descrito. Este método supera as desvantagens dos

O objetivo geral deste procedimento é realizar a transferência de genes para embriões de galinha mais velhos in vivo para estudar a função e regulação do gene em estágios de desenvolvimento mais antigos. Isso é feito primeiro quebrando um ovo por volta do dia 2.5 de incubação e transferindo todo o embrião para um sistema de placa de Petri. O segundo passo é injetar o plasmídeo, codificando o gene de interesse na parte apropriada do embrião.

Após a injeção do plasmídeo, coloque os eletrodos ao lado do embrião e realize a eletroporação X ovo, a etapa final é coletar os embriões eletroporados para análise. Em última análise, a imuno-histoquímica é usada para detectar a expressão de genes transferidos no embrião. Hoje vamos mostrar como fazer a eletroporação oval X usando BULs de frango.

A principal vantagem desta técnica é que X sobre eletroporação pode superar os problemas de eletroporação excessiva usada para transferência de genes em embriões de galinha mais velhos. A cultura X ovo bem-sucedida de embriões de galinha requer o uso de ovos fertilizados frescos. Não use ovos armazenados a 12 graus Celsius por mais de uma semana.

Coloque os ovos em seus lados longos em uma incubadora de tiragem forçada a 37,5 graus Celsius com 60% de umidade após incubação por 2,5 dias. Quando os embriões estão em cerca de hambúrguer e Hamilton. Etapa 17, retire os ovos da incubadora.

Rotule a parte superior de cada ovo com um lápis para indicar a direção de quebra de cada ovo. Despeje cerca de 20 mililitros de água destilada estéril em uma placa de Petri grande e limpa com um diâmetro de 145 milímetros. Coloque uma pequena placa de Petri estéril com um diâmetro de 94 milímetros na placa de Petri grande.

Em seguida, quebre cada ovo no fundo contra uma borda afiada de metal. Abra o ovo com cuidado e transfira todo o seu conteúdo para a pequena placa de Petri. Para garantir a boa qualidade do embrião, todo o conteúdo do óvulo deve ser mantido em uma forma normalmente redonda em um sistema de placa de Petri, sem qualquer lesão na membrana da vilina.

Depois de transferir o conteúdo de cada ovo para o prato pequeno, cubra o prato grande com uma tampa. Coloque os sistemas de placas de Petri em outra incubadora para cultura adicional a 37,5 graus Celsius com cerca de 60% de umidade antes da eletroporação X ovo. Use um microeletrodo polar para puxar capilares de vidro de tubos de vidro de 1,0 milímetro de diâmetro.

Quebre a ponta dos capilares de vidro em um diâmetro apropriado. Em seguida, configure os parâmetros apropriados para eletroporação, como diferentes voltagens para o tecido distinto e tamanho dos embriões. Conecte os eletrodos apropriados ao eletro de acordo com o tecido alvo e o tamanho dos embriões.

Preparar uma solução de plasmídeo contendo plasmídeos, codificando um gene alvo e um gene marcador. Nesta demonstração, a caderina sete ou CAD sete é o alvo e a proteína fluorescente verde ou GFP é o marcador. Adicione verde rápido a uma concentração final de 0,1% para rotular a solução de plasmídeo em verde.

Por fim, use uma pipeta de boca para carregar o capilar de vidro com a solução de plasmídeo. Embriões de galinha da cultura X ovo que foram incubados por seis dias são usados para eletroporação X ovo. Para iniciar este procedimento, use uma pinça fina para rasgar cuidadosamente as membranas de tyleno e âmnio sobre o tectum óptico e adicione três gotas de solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% na superfície do tectum.

Usando uma pipeta bucal, injete a solução de plasmídeo do capilar de vidro na cavidade do tectum. Coloque os eletrodos com um cátodo de agulha de tungstênio e um ânodo de placa retangular ao lado do tectum. Use imediatamente o eletro para aplicar pulsos elétricos ao tectum.

Cubra a placa de Petri grande com a tampa e devolva-a à incubadora dois ou três dias após a eletroporação dos plasmídeos que codificam GFP e CAD sete no tectum de galinha em E seis, o tectum é coletado e fixado para imunocoloração. Os resultados são mostrados nesta figura em E oito. A proteína GFP é fortemente expressa no tum, conforme indicado por todas essas imagens de montagem aqui.

O painel A é uma imagem de campo claro. O painel B é uma imagem GFP e o painel C é emergido. Além disso, nas seções do tectum em E, nove proteínas GFP visualizadas em verde no painel D e CAD sete proteínas visualizadas em vermelho no painel E são co-expressas como representadas pela cor amarela no painel F. Quando feito corretamente, a eficiência da eletroporação X ovo é de 60 a 100% Esses resultados sugerem que a eletroporação X ovo é um método bem-sucedido para transferência de genes para embriões de galinha mais velhos in vivo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a transferência de genes para embriões de galinha mais velhos e boa sorte com seu experimento.