In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

Apresentamos métodos para avaliar a capacidade fagocitária de primários macrófagos murino derivadas da medula óssea, usando os restos de mielina fluorescente etiquetadas e lipídios intracelulares da gota mancha.

O objetivo geral deste protocolo é avaliar a fagocitose de macrófagos derivados da medula óssea de detritos de mielina derivados do cérebro. Este protocolo foi desenvolvido para responder a perguntas-chave no campo do neurotrauma. A vantagem deste método é que permite uma análise eficiente e relativamente econômica das respostas dos macrófagos in vitro, especificamente a capacidade fagocítica de macrófagos derivados da medula óssea para detritos de mielina.

Este método pode ser facilmente adaptado para investigar os efeitos de moduladores externos. Depois de saturar o camundongo com 70% de etanol, faça uma abertura na pele abdominal. Puxe a pele para trás para revelar as pernas para dissecção.

Tome cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal durante este processo. Uma vez exposto, remova as pernas cortando o tornozelo e o quadril. Coloque as pernas em PBS gelado suplementado com antibióticos.

Repita para a outra perna. Lave o tecido em PBS fresco e gelado, suplementado com antibióticos, para desalojar quaisquer partículas que possam ter aderido ao tecido durante a dissecção. Um movimento de raspagem suave aplicado ao longo do músculo desalojará a maior parte do tecido indesejado.

Com bisturi e pinça, libere a tíbia do músculo e do tecido conjuntivo. Uma vez liberado, remova ambas as extremidades para expor a cavidade da medula. Repita este processo para o fêmur.

Fixe uma agulha de calibre 25 em uma seringa de 20 milímetros cheia de meios macrófagos completos derivados da medula óssea. Em seguida, lave a cavidade da medula óssea. O osso parecerá branco quando suficientemente lavado.

Agitar os aspirados de medula recolhidos com uma agulha de calibre 18 durante 30 a 90 segundos para obter uma suspensão de células únicas. Em seguida, passe a suspensão por um filtro de células de poro estéril de 70 micrômetros. Divida uniformemente as suspensões de células em placas de cultura de células de 145 centímetros.

Cada rato fornecerá o suficiente para um total de três pratos. Após sete dias de cultivo, esses pratos normalmente estarão entre 70 a 80% confluentes com macrófagos maduros. Para isolar os detritos brutos de mielina dos cérebros, uma série de etapas de ultracentrifugação com gradiente de sacarose é realizada.

Para começar, 10 a 12 cérebros são dissecados de camundongos de oito a 10 semanas de idade. Os cérebros são então homogeneizados em solução de sacarose molar 0,32 e, em seguida, colocados em camadas em uma almofada de solução de sacarose molar 0,383 para criar um gradiente descontínuo. Após a centrifugação, os detritos brutos de mielina são encontrados na interface entre as camadas.

Este é coletado e dispensado em uma solução tampão Tris e centrifugado novamente para pellet os detritos de mielina. O pellet é ressuspenso novamente em solução tampão Tris e dividido entre dois tubos para cenetrifugação adicional. Para começar, remova todo o cérebro e coloque-o em um prato com solução gelada de sacarose 0,32 molar.

Usando uma tesoura cirúrgica estéril, corte os cérebros coletados em pedaços de aproximadamente cinco milímetros de tamanho. Esta etapa auxilia no processo de homogeneização subsequente. Colete o tecido em um tubo de 50 mililitros.

Usando um homogeneizador rotativo, homogeneizar o tecido em uma pasta lisa. Certifique-se de que todos os grandes sólidos cerebrais visíveis tenham sido completamente homogeneizados. Em um tubo de ultracentrífuga contendo 20 mililitros de solução de sacarose molar 0,83, gere e homogeneize, tendo o cuidado de manter a separação.

Equilibre cuidadosamente cada tubo usando a solução de sacarose 0,32 molar. Uma vez terminado, transfira os tubos para um rotor de centrífuga apropriado e gire por 45 minutos a 100.000 vezes a gravidade, quatro graus Celsius. Certifique-se de que a aceleração e a desaceleração estejam definidas para seus valores mínimos.

Quando a centrifugação estiver concluída, os detritos de mielina serão visíveis entre a interface de densidade de sacarose. Colete suavemente os detritos de mielina. Uma vez coletado, adicione o tampão Tris aos detritos de mielina.

Homogeneizar novamente com um homogeneizador rotativo. Divida o homogeneizado entre seis tubos de ultracentrífuga limpos e equilibre os tubos conforme necessário com tampão Tris adicional. Centrifugar novamente os detritos de mielina recolhidos a 100 000 vezes a gravidade, quatro graus Celsius durante 45 minutos, com aceleração e desaceleração definidas para os seus valores máximos.

Após a centrifugação, a mielina terá sido peletizada. Usando o tampão Tris, ressuspenda o pellet. Combine as ressuspensões e a ultracentrífuga novamente.

Após a centrifugação, um pellet bem compactado é formado. Transvase o sobrenadar. Ressuspenda o pellet em PBS estéril.

Divida igualmente os detritos de mielina ressuspensos em tubos de microcentrífuga pré-pesados. Após centrifugação por 10 minutos a 22.000 vezes a gravidade, remova o sobrenato PBS. Depois de pesar o pellet, ressuspenda a uma concentração de 100 miligramas por mililitro com PBS.

Os detritos brutos de mielina resultantes agora são adequados para o estudo da fagocitose. Os detritos de mielina da marcação CFSE podem ser usados para rastrear a internalização precoce, bem como o tráfego intracelular. Os detritos de mielina não marcados são compatíveis com a coloração lipídica Oil Red-O para avaliar o armazenamento e o metabolismo dos lipídios internalizados.

Se você estiver usando detritos de mielina armazenados a 80 graus Celsius negativos, primeiro você deve ressuspender com uma agulha de calibre 29. Ressuspenda 10 miligramas de detritos de mielina peletizados em 200 microlitros de PBS. Em seguida, adicione dois microlitros de solução CFSE de cinco milimolares.

Pipeta para misturar. Após uma incubação de 30 minutos, protegida da luz e lavagem subsequente, ressuspenda os detritos de mielina a 100 miligramas por mililitro com PBS. Após a cultura e fixação com 4% de paraformaldeído, adicione 100% de propilenoglicol a cada poço.

Depois de incubar por cinco minutos em temperatura ambiente, adicione a solução de coloração Oil Red-O a cada poço. Incube por oito minutos a 60 graus Celsius com agitação suave. Incline suavemente a placa para permitir a aspiração completa da mancha Oil Red-O.

Para cada poço, adicione 85% de propilenoglicol. Após cinco minutos de incubação em temperatura ambiente, lave os poços com PBS e core as células com o corante nuclear de sua escolha. Imagens representativas de microscopia de luz de células da medula óssea durante a cultura.

24 horas após a semeadura inicial, poucas células aderentes estão presentes. No entanto, na presença do fator estimulador de colônias de macrófagos, M-CSF, as células precursoras de leucócitos começam a sofrer diferenciação. Após sete dias de cultivo na presença de M-CSF, as células precursoras são totalmente diferenciadas em macrófagos maduros derivados da medula óssea capazes de fagocitose.

Usando esse método, um único camundongo C57 preto 6J de oito a 10 semanas normalmente produz de 18 a 24 milhões de macrófagos da medula óssea. Para visualizar a internalização, detritos de mielina marcados com CFSE são adicionados a culturas de macrófagos derivadas da medula óssea. As células foram tratadas com um miligrama por mililitro de detritos de mielina marcados com CFSE por uma hora antes da lavagem e fixação com paraformaldeído a 4%.

Os detritos de mielina internalizados podem ser visualizados usando conjuntos de filtros GFP padrão em um microscópio com capacidade de epifluorescência. Para demonstrar como o acúmulo de lipídios de mielina muda ao longo do tempo, os macrófagos foram tratados com detritos de mielina não marcados por 90 minutos, depois lavados e fixados em vários momentos. Imediatamente após a lavagem, poucas gotículas lipídicas são visíveis.

No entanto, com o passar do tempo, mais gotículas lipídicas tornam-se visíveis, atingindo um máximo de aproximadamente 24 horas após a lavagem. Os macrófagos começarão a metabolizar o efluxo para os estoques lipídicos, reduzindo o número de gotículas coráveis. Para quantificar a coloração Oil Red-O, cinco imagens obtidas aleatoriamente de cada amostra de ponto de tempo foram obtidas usando um microscópio com capacidade de epifluorescência.

A área manchada de óleo Red-O foi determinada para cada poço usando imagens capturadas no canal DsRed. O número total de células é determinado pela contagem do número de núcleos presentes em cada campo. Este gráfico mostra a quantificação resultante.

Um aumento constante no sinal positivo de óleo Red-O é típico, pois os macrófagos derivados da medula óssea convertem lipídios de mielina internalizados em lipídios neutros. Uma diminuição no sinal de óleo vermelho-o-positivo segue o pico em 24 horas, quando os macrófagos começam a metabolizar ou ejetar os lipídios. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como isolar e cultivar macrófagos primários derivados da medula óssea, bem como estudar sua interação com detritos de mielina derivados do cérebro recém-isolados.

A parte mais importante desses procedimentos é a manutenção adequada da técnica asséptica em todos os momentos. Como os macrófagos podem responder de forma robusta a pequenas quantidades de moléculas associadas a patógenos, é fundamental minimizar qualquer interação potencial que possa influenciar os resultados. A principal vantagem dessas técnicas é que elas nos tornam biologicamente relevantes

Além disso, com alguma otimização do usuário, esses métodos podem ser facilmente adaptados para abordar uma ampla variedade de questões relacionadas à resposta de macrófagos derivados da medula óssea a detritos de mielina. Ao fazer uso de detritos de mielina marcados com fluorescência e coloração Oil Red-O de macrófagos mielinizados, é possível investigar possíveis intervenções terapêuticas para pacientes que sofrem de uma variedade de neurotraumas. O objetivo geral desse trabalho é a eliminação remota de detritos celulares mediados por macrófagos para promover a resolução da inflamação.