Name: In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Aprenda a avaliar a fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea murina usando marcação fluorescente. Este método in vitro permite analisar respostas imunes em neurotrauma de forma eficiente.

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Os autores gostaria de agradecer Glenn Sanger-Hodgson, especialista em mídia na faculdade de medicina de FSU, pelo seu trabalho na produção de vídeo, edição e locução.
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R01GM100474 e R01GM072611).

Os métodos descritos aqui e na seção 2 foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e Florida estado Universidade institucional Cuidado Animal e segue as directrizes estabelecidas no guia para o cuidado e uso de animais de laboratório, 8ª edição . Todos os animais utilizados no presente no presente protocolo são casa em um centro de animais de laboratório dedicado até o uso. Nenhuma experimentação na vivo foi realizado antes do sacrifício. Número de animais foram baseado na necessidade experimental usando a célula média e coleções de mielina, como um guia a fim de minimizar o uso.
Nota: Este protocolo descreve a geração de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) (secção 1), a preparação dos restos de mielina fluorescente etiquetadas derivado do cérebro (seção 2), o procedimento geral para a análise de fagocitose de restos de mielina (seção 3), e o procedimento geral para análise de acumulação de lipídios de detritos de mielina (secção 4). Preparação do reagente, celular colheita e manipulação, coleção de mielina e rotulagem e ensaio de desempenho devem ser concluídas em uma fluxo de ar laminar de biossegurança do armário.
1. geração de macrófagos derivados da medula óssea primárias
<ol>
	<li>Preparação do meio de cultura completo macrófago (CMCM) Nota: geração de macrófagos da medula óssea requer o uso de fator colônia-estimulando do macrófago (M-CSF). Esta preparação utiliza mídia de fibroblasto murino condicionado L929 como fonte de M-CSF.<ol>
		<li>Gere mídia de fibroblasto murino condicionado L929 por cultivo de células em pratos de 145 mm com 50 mL de glicose elevada (4500 mg/L, L-glicose) Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 5% de soro de bezerro nascido novo (NCS) e penicilina/estreptomicina por 7 dias.</li>
		<li>Recolher meios de culturas em tubos de centrifuga conico de 50 mL e centrifugar durante 30 minutos a 3500 x g, 4 ° C.</li>
		<li>Filtrar sobrenadantes através de um filtro de seringa 0,2 µm para um novo tubo de centrifuga conico de 50 mL. Condicionado de mídia pode ser armazenadas a-80 ° C por até 6 meses.</li>
		<li>A glicose alta DMEM, adicionar 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 murino fibroblasto condicionado DMEM e 1% penicilina/estreptomicina. Meios de comunicação podem ser armazenados a 4 ° C durante 2-3 meses. Aquecido a 37 ° C antes do uso.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleção de células primárias da medula óssea e indução de macrófagos 
	Nota: Usando este um mouse protocolo irá gerar aproximadamente 20 milhões derivadas da medula óssea macrófagos (BMDMs).<ol>
		<li>Eutanásia o número desejado de semana de 8-10 ratos velhos usando padrão CO2 diretrizes de asfixia seguidos por deslocamento cervical.</li>
		<li>Higienizar o animal usando 70% (vol/vol) etanol: H2O, saturando o pelo.</li>
		<li>Cortar uma pequena abertura no abdômen e puxe cuidadosamente a pele para revelar o tecido subjacente. Tome cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal.</li>
		<li>Remova ambas as pernas traseiras, começando no quadril e terminando na altura da tornozelo. Lugar do tecido coletado em um prato de Petri de 100mm contendo fosfato estéril de 5-10 mL tampão salino (PBS) suplementado com 1% penicilina/estreptomicina. 
		Nota: Quando processar vários animais certifique-se de manter os pratos no gelo para limitar a degradação do tecido.</li>
		<li>Retire o músculo e tecido conjuntivo do osso usando um bisturi. Apenas o fêmur e a tíbia são utilizados para coleta de célula, a fíbula pode ser descartada.</li>
		<li>Expor a cavidade da medula dos ossos recolhidos por aparar uma pequena secção de cada extremidade com um bisturi.</li>
		<li>Usando uma agulha 25g, irrigue as cavidades da medula com CMCM em um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Os ossos aparecerá brancos, uma vez que eles têm sido suficientemente liberados.</li>
		<li>Concluída a coleta, agite aspirados com uma agulha de 18g por 30-90 s gerado uma suspensão de célula única. 
		Nota: Um passo de Lise opcional – glóbulos vermelhos (RBC) pode ser realizado neste momento. Recentemente tem sido sugerido que o teor de ferro intracelular pode influenciar os efeitos dos restos de mielina em macrófago polarização16. Para obter informações sobre a inclusão de uma etapa de Lise RBC referir-Trouplin et al. 17.</li>
		<li>Filtre a suspensão através de um filtro de célula estéril 70 µm para um novo tubo de centrifuga conico de 50 mL.</li>
		<li>Sementes coletadas células uniformemente em pratos de cultura celular de 145 mm com 15-20 mL CMCM. Use aproximadamente três pratos de cultura por rato sacrificado. Incube as culturas a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Após 72 horas lavar pratos uma vez com PBS estéril para remover as células não-aderentes, em seguida, adicione 15-20mL CMCM fresco. Incube as culturas por mais 4 dias a 37 ° C, 5% de CO2. Após 7 dias de cultura total, as células hematopoiéticas da medula óssea inicialmente isoladas será maduros BMDMs (Figura 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. geração de detritos de mielina fluorescente etiquetadas derivado do cérebro
Nota: Todos os reagentes podem ser armazenados a 4 ° C por até 1 mês.
<ol>
	<li>Preparação dos reagentes de coleção de restos de mielina
	<ol>
		<li>Preparar Tris· Solução-tampão de CL.<ol>
			<li>A 800mL água destilada deionizada H2O (ddiH2O) adicionar 20 mL de 1 M Tris· CL, pH 7,45 (concentração final de 20 mM) e 20 mL de 100mm Na2EDTA (concentração final de 2 mM).</li>
			<li>Ajuste o pH a 7,45. Ajuste o volume para 1000 mL com ddiH2solução de filtro de O. através de uma unidade de filtração 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Prepare a solução de sacarose 1M.<ol>
			<li>A 100 mL de Tris· CL solução de tampão, adicionar 68,46 g de sacarose. Ajustar o volume de 200 mL com Tris· Solução-tampão de CL. Filtre a solução através de uma unidade de filtração de 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Preparar 200 mL de solução de sacarose de 0,32 M diluindo a solução 1 M com a Tris· CL 0.83:0.16 de solução tampão (vol/vol).</li>
		<li>Preparar 150 mL de solução de sacarose de 0,83 M diluindo a solução 1 M com a Tris· CL 0.83:0.16 de solução tampão (vol/vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleção de restos de mielina bruto derivado do cérebro 
	Nota: O método de coleta descrito aqui é para o isolamento dos restos de mielina bruto.<ol>
		<li>Eutanásia em ratos de 10-12 8-10 semanas de idade usando padrão CO2 diretrizes de asfixia seguidas por deslocamento cervical.</li>
		<li>Dissecar o cérebro e os coloque em um prato de 100 mm, contendo 10 mL de solução de sacarose de 0,32 M.</li></ol></li></ol>Mantenha o prato no gelo.
		<li>Usando a tesoura cirúrgica estéril, cortar o cérebro em pedaços de aproximadamente 5 mm3 no tamanho.</li>
		<li>Transferir o tecido para um tubo de centrifuga conico de 50 mL e adicionar cerca de 30 mL de solução de sacarose de 0,32 M.</li>
		<li>Homogeneizar com um homogenizador giratório portátil estéril, até que seja alcançada uma solução suave.</li>
		<li>Dilua o cérebro homogeneizado até um volume final de 90 mL com solução de sacarose de 0,32 M.</li>
		<li>Para seis tubos de 38,5 mL paredes finas polipropileno se, adicione 20 mL de solução de sacarose de 0,83 M.</li>
		<li>Delicadamente, adicione a solução de cérebro homogeneizado para o topo da solução de sacarose de 0,83 M, tomando cuidado para não misturar as duas camadas.</li>
		<li>Contrapeso de cada tubo com a solução de sacarose de 0,32 M.</li>
		<li>Centrifugar a 100.000 x g por 45 min a 4° C, usando um apropriado pre-refrigeração rotor se. Conjunto rotor aceleração e desaceleração para seus valores mínimos para reduzir a perda de restos de mielina.</li>
		<li>Recolha os restos de mielina da interface das duas densidades de sacarose. 
		Nota: os detritos devem aparecer como uma faixa branca em direção ao centro do tubo.</li>
		<li>Combinar os restos de mielina bruto em um tubo de centrifuga conico de 50 mL e ajustar o volume a cerca de 35 mL, usando Tris· Solução-tampão de CL.</li>
		<li>Homogeneizar os restos de mielina bruto com um homogenizador giratório portátil estéril para 30-60 s.</li>
		<li>Divida uniformente a suspensão entre 6 tubos se limpa e equilíbrio com um volume adequado de Tris· Solução-tampão de CL.</li>
		<li>Centrifugar a 100.000 x g por 45 min a 4° C, usando um apropriado pre-refrigeração rotor se. Conjunto rotor aceleração e desaceleração para seus valores máximos.</li>
		<li>Como sólidas brancas pelotas agora será visíveis, desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 10-15 mL de Tris· Solução-tampão de CL.</li>
		<li>Divida uniformente a suspensão entre 2 tubos se limpa e equilíbrio com um volume adequado de Tris· Solução-tampão de CL.</li>
		<li>Centrifugar novamente a 100.000 x g durante 45 min a 4 ° C, usando um apropriado pre-refrigeração rotor se. Conjunto rotor aceleração e desaceleração para seus valores máximos.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as bolas em 5-6 mL de PBS estéril e dividir a suspensão entre um número adequado de tubos de microcentrífuga pré-pesados 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 22.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e determinar o peso das pelotas de restos de mielina.</li>
		<li>Re-suspenda as pelotas em PBS para uma concentração final de 100 mg/mL. 
		Nota: dez ou doze cérebro é suficiente para produzir 10-15 mL de restos de mielina de 100 mg/mL. Os restos de mielina podem ser loja a-80 ° C por 6 meses.</li>
	
	
	<li>Os restos de mielina fluorescente rotulagem
	<ol>
		<li>Prepare a solução 50 µM carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE) imediatamente antes do uso.<ol>
			<li>Usando o PBS estéril, dilua uma solução stock de 5 mM de CFSE preparado com 100% dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração final de trabalho de 50 µM.</li>
			<li>Filtrar a solução através de um filtro de seringa 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Descongele a quantidade desejada de restos de mielina de 100 mg/mL e ressuspender com uma agulha estéril de 29 g. 
		Nota: congelar os restos de mielina fará com que a largar a solução que exigem re-suspensão antes do uso.</li>
		<li>Transferi os restos de mielina para um tubo de centrífuga de micro pré-pesados 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 14.800 x g durante 10 minutos a 4° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda os restos de mielina em 200 µ l de solução CFSE por restos de mielina 100 µ l peletizado.</li>
		<li>Incube durante 30 min à temperatura (RT), protegida da luz.</li>
		<li>Centrifugar a 14.800 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 600-800 µ l de tampão de lavagem (0,2 µm filtro esterilizado glicina 100mm em PBS).</li>
		<li>Centrifugar a 14.800 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Repita as etapas 2.3.8-2.3.9 mais duas vezes.</li>
		<li>Após a lavagem final, determinar o peso da pelota de restos de mielina e ressuspender a 100 mg/mL com PBS estéril. Nota: Os restos de mielina rotulado podem ser loja a-80 ° C por até 6 meses.</li>
	</ol>
	</li>

3. a mielina ensaio de fagocitose de detritos
Nota: O seguinte é o método básico para observar a fagocitose de restos de mielina fluorescente etiquetadas. Adição de outros tratamentos e condições experimentais precisará ser otimizado pelo investigador.
<ol>
	<li>Preparação de placas de tratamento
	<ol>
		<li>Para cada placa de 145 mm, colete BMDMs maduros em um tubo de centrifuga conico de 15 mL com 5-6 mL de ácido etilenodiaminotetracético de 10mm (EDTA) em fosfato salino de Dulbecco (dPBS) (pH 7,4). 
		Nota: Não utilize tripsina pois ele pode alterar o estado de ativação de células18.</li>
		<li>Adicione um volume igual de CMCM pré-aquecido a cada tubo de células coletadas.</li>
		<li>Centrifugar a 180 x g por 8 min a 20 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células em CMCM e contagem.</li>
		<li>A cada poço de uma placa de cultura de células 24 poços, adicione 1 x 105 células em 1 mL de CMCM.</li>
		<li>Incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise e tratamento de resíduos de mielina
	<ol>
		<li>Adicione 10 µ l de 100 mg/mL CFSE rotulado os restos de mielina de cada bem (concentração final de 1 mg/mL).</li>
		<li>Incube durante 1-3 horas a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Lave a placa 3 vezes com PBS estéril para remover restos de mielina não engolido.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de paraformaldeído 4% a cada poço. Incubar durante 30 min à RT.</li>
		<li>Lave a placa 2 vezes com PBS estéril.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de solução de Hoechst 33258 a cada poço. Incube durante 5 min à RT, protegido da luz.</li>
		<li>Lave pratos 2 vezes com PBS estéril.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de Fluoro-gel com tampão Tris a cada poço para reduzir fotobranqueamento.</li>
		<li>Células de imagem usando um microscópio capaz de epi-fluorescente invertido. 
		Nota: Os excitação e emissão de comprimentos de onda de CFSE são 494 nm e 521 nm, respectivamente.</li>
		<li>Divida o número de células positivas CFSE pelo número de núcleos para determinar a absorção de restos de mielina relativo.</li>
		<li>Antes da imagem latente, manter as placas por até 7 dias a 4 ° C, protegido da luz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. quantificação dos lipídios intracelulares através de coloração de vermelho-O óleo
Nota: O seguinte é o método básico para a observação de lipídios intracelulares de mielina-detritos derivados.O uso de CFSE rotulado os restos de mielina não é recomendado para quantificação fluorescente de ORO de coloração devido à sobreposição espectral. Adição de outros tratamentos e condições experimentais precisará ser otimizado pelo investigador.
<ol>
	<li>Preparação de soluções de coloração
	<ol>
		<li>Prepare a solução de coloração vermelho-O óleo (ORO) 0,5%.<ol>
			<li>Lentamente, adicionar 100 mL de propilenoglicol 100% (1,2-propanodiol) a 0,5 g de ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol), agitando.</li>
			<li>Aqueça a 95 ° C por 15 min ou até que todas as partículas grandes são dissolvidas. 
			Nota: Não aqueça acima de 100 ° C.</li>
			<li>Filtrar a solução através de um pedaço de papel de filtro, enquanto ainda quente em um novo recipiente.</li>
			<li>Permitir que a solução legal durante a noite no RT. solução pode ser armazenada por até 1 ano no RT</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Prepare a solução de glicol de propileno de 85%.<ol>
			<li>Adicione 85 mL de propilenoglicol 100% para 15 mL de ddiH2O. mexa até misturado. Solução pode ser armazenada por até 1 ano no RT</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação de placas de tratamento
	<ol>
		<li>Prepare uma placa de 24 seguindo o método descrito na seção 3.</li>
		<li>Incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tratamento de detritos de mielina
	<ol>
		<li>Adicione 10 µ l de restos de mielina de 100 mg/mL a cada poço (concentração final de 1 mg/mL).</li>
		<li>Incube durante 1-3 h a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Lave a placa 3 vezes com PBS estéril para remover restos de mielina não digerido. Nota: Neste ponto, placas podem também sofrer fixação imediata ou CMCM fresca pode ser adicionada, e células retornou a incubação por pontos de tempo adicional.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de paraformaldeído 4% a cada poço. Incubar durante 30 min à RT.</li>
		<li>Lave a placa 2 vezes com PBS estéril então, procced à mancha.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloração de ORO e análise
	<ol>
		<li>Lave a placa fixa 3 vezes com ddiH2O.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de propileno glicol de 100% a cada poço e incubar durante 5 min à RT 
		Nota: isto irá reduzir o reporte de ddiH2O.</li>
		<li>Aspirar o propilenoglicol e adicione 400 µ l de solução ORO a cada poço.</li>
		<li>Incubar durante 8 min a 60 ° C.</li>
		<li>Aspire a solução ORO. Em seguida, adicione 400 µ l de 85% propilenoglicol a cada poço e incubar durante 5 minumintes no RT</li>
		<li>Lavar a placa 3 vezes com ddiH2O.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de solução de Hoechst 33258 a cada poço. Incube durante 5 min à RT, protegido da luz.</li>
		<li>Lave pratos 2 vezes com PBS estéril.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de Fluoro-gel com tampão Tris a cada poço.</li>
		<li>Células de imagem usando um microscópio capaz de epi-fluorescente invertido. ORO pode ser fotografada usando um conjunto padrão de filtro vermelho Texas ou DsRed.</li>
		<li>Quantificar de retenção relativo lipídios determinando a área positiva de ORO em cada campo de imagem e dividindo-o pelo número de núcleos.</li>
		<li>Manter as placas durante 7 dias a 4 ° C protegido da luz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores têm sem divulgações.

Os procedimentos descritos aqui utilizam ambos recém isolados restos de mielina CNS bruto e macrófagos derivados da medula óssea primários. Para reduzir despesas do animais, é recomendável que os cérebros e células da medula óssea de cada rato ser colhidas no momento do sacrifício. Dois pesquisadores trabalhando juntos podem preparar ambos os materiais simultaneamente. Alternativamente, os cérebros podem ser armazenados a-80 ° C em PBS suplementadas com antibióticos antes de isolamento de restos de mielina. Tem sido noss...

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são um elo importante entre os sistemas imune inatos e adaptativos. Como células apresentadoras de (APCs), eles podem se comunicar com os linfócitos através de ambos apresentação de antigénios e liberação de citocinas1,2,3. No entanto, como fagócitos profissionais, sua principal função é limpar patógenos, células envelhecidas e restos celulares1,4. Na sequência de uma lesão na medula espinal (SCI), quantidades substanciais de restos de mielina é gerada a partir de oligodendrócitos moribundos, o tipo de célula responsável pela CNS axônio mielinização5. Nós e os outros têm mostrado que o afastamento dos restos de mielina é sobretudo da responsabilidade de infiltração BMDMs5,6,7. No entanto, dentro da lesão da medula espinhal com a duração de sites de restos de mielina tem sido sugerida para deslocar estas células normalmente anti-inflamatórios no sentido de um estado pro-inflamatórios5,8,9. Como principais mediadores neuro-inflamação na medula espinhal lesada, BMDMs são alvos clínicos importantes.
Para ajudar a investigar a influência da BMDMs na medula espinhal lesada, desenvolvemos um modelo in vitro para estudar diretamente como BMDMs responder aos restos de mielina. Para melhorar a relevância biológica, tanto BMDMs murino primários e os restos de mielina recentemente isoladas são usados nestas investigações. Como tal, os métodos apresentados aqui também detalham o isolamento e a cultura de BMDMs murino primários e derivado de uma técnica de gradiente de sacarose modificada usada para isolar o CNS murino mielina detritos10,11,12. Os restos de mielina podem prontamente ser rotulados com um corante fluorescente, carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE), para acompanhar que sua internalização por BMDMs. CFSE é bem adequada para esta aplicação, porque é não citotóxicas e suas licenças de espectro estreito fluorescente multiplexação com outras fluorescentes sondas13,14. Após a fagocitose, lipídios de restos de mielina são transportados através de lisossomos e empacotados como lipídios neutros em gotículas de lipídios intracelular5. Para quantificar este acúmulo intracelular de lipídios, apresentamos um óleo vermelho O ORO () método otimizado para análise quantitativa de imagem de coloração. Este método de coloração simples produz resultados reprodutíveis robustos e quantificação de15. Esses métodos facilitam o estudo da mielina detritos fagocitose e lipídios de retenção com equipamento especializado limitada.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Alta glicose com L-glutamina, pirovato de sódio</td></tr><tr><td>Solução de Penicilina-Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X Solução</td></tr><tr><td>Soro de Bezerro Recém-nascido (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>Origem dos Estados Unidos</td></tr><tr><td>NCTC clone 929 [célula L, L-929, derivado da Cepa L]&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 Linha Celular de Preparação de Meios</td></tr><tr><td>Condicionados Placas de Cultura de Células de 24 poços</td><td>VWR</td><td>10062-896&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Prato de Cultura de Células</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>Polistyrin, 145/20mm</td></tr><tr><td>CFSE Kit de Proliferação Celular</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO para Reconstrução Fornecido</td></tr><tr><td>Fluoro-gel com Tris Buffer&nbsp;</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Vermelho O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Materiais</forte><</td><td>forte>Empresa</forte></td><td><forte>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Tubos de Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Thinwall, Polipropileno, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti, Balde Oscilante,</td></tr><tr><td>Homogeneizador Rotativo Manual</td> de Titânio <td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são leucócitos maduros que servem a um papel fisiológico crítico como fagócitos profissionais capazes de limpar uma variedade de partículas. Normalmente, BMDMs são restritas do sistema nervoso central (SNC), mas após uma lesão, podem facilmente se infiltrar. Uma vez dentro o tecido lesado do CNS, BMDMs são o tipo de célula primária responsável para a liberação de restos celulares derivados de lesões, incluindo grandes quantidades de detritos de mielina rica de lipídios. As ramificações neuropatológicas da fagocitose de detritos infiltração e mielina BMDM dentro o CNS são complexas e não é bem compreendido. Os protocolos descritos aqui, permitem direto em vitro estudo da BMDMs no contexto de lesão de CNS. Nós cobrimos murino BMDM isolamento e cultura, preparação de restos de mielina e ensaios para avaliar a fagocitose de restos de mielina BMDM. Estas técnicas produzem resultados quantificáveis robustos, sem a necessidade de equipamento especializado significativo ou materiais, no entanto, podem ser facilmente personalizadas para atender às necessidades dos pesquisadores.

Tratamento de BMDMs com CFSE rotulado os restos de mielina deve produzir interiorização clara (Figura 2). Enquanto um tempo de 3 horas de interação é suficiente para BMDMs fagocitar suficiente restos de mielina adicionado para a deteção de jusante robusto, acúmulo intracelular pode ser observado com tão pouco quanto 1 hora da interação. No entanto, alguns restos de mielina ainda podem estar presentes na superfície das células após a lavagem. Isto pode ser devido à lavagem insuficiente, ou nã...

Apresentamos métodos para avaliar a capacidade fagocitária de primários macrófagos murino derivadas da medula óssea, usando os restos de mielina fluorescente etiquetadas e lipídios intracelulares da gota mancha.

In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

O objetivo geral deste protocolo é avaliar a fagocitose de macrófagos derivados da medula óssea de detritos de mielina derivados do cérebro. Este protocolo foi desenvolvido para responder a perguntas-chave no campo do neurotrauma. A vantagem deste método é que permite uma análise eficiente e relativamente econômica das respostas dos macrófagos in vitro, especificamente a capacidade fagocítica de macrófagos derivados da medula óssea para detritos de mielina.Este método pode ser facilmente adaptado para investigar os efeitos de moduladores externos. Depois de saturar o camundongo com 70% de etanol, faça uma abertura na pele abdominal. Puxe a pele para trás para revelar as pernas para dissecção.Tome cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal durante este processo. Uma vez exposto, remova as pernas cortando o tornozelo e o quadril. Coloque as pernas em PBS gelado suplementado com antibióticos.Repita para a outra perna. Lave o tecido em PBS fresco e gelado, suplementado com antibióticos, para desalojar quaisquer partículas que possam ter aderido ao tecido durante a dissecção. Um movimento de raspagem suave aplicado ao longo do músculo desalojará a maior parte do tecido indesejado.Com bisturi e pinça, libere a tíbia do músculo e do tecido conjuntivo. Uma vez liberado, remova ambas as extremidades para expor a cavidade da medula. Repita este processo para o fêmur.Fixe uma agulha de calibre 25 em uma seringa de 20 milímetros cheia de meios macrófagos completos derivados da medula óssea. Em seguida, lave a cavidade da medula óssea. O osso parecerá branco quando suficientemente lavado.Agitar os aspirados de medula recolhidos com uma agulha de calibre 18 durante 30 a 90 segundos para obter uma suspensão de células únicas. Em seguida, passe a suspensão por um filtro de células de poro estéril de 70 micrômetros. Divida uniformemente as suspensões de células em placas de cultura de células de 145 centímetros.Cada rato fornecerá o suficiente para um total de três pratos. Após sete dias de cultivo, esses pratos normalmente estarão entre 70 a 80% confluentes com macrófagos maduros. Para isolar os detritos brutos de mielina dos cérebros, uma série de etapas de ultracentrifugação com gradiente de sacarose é realizada.Para começar, 10 a 12 cérebros são dissecados de camundongos de oito a 10 semanas de idade. Os cérebros são então homogeneizados em solução de sacarose molar 0,32 e, em seguida, colocados em camadas em uma almofada de solução de sacarose molar 0,383 para criar um gradiente descontínuo. Após a centrifugação, os detritos brutos de mielina são encontrados na interface entre as camadas.Este é coletado e dispensado em uma solução tampão Tris e centrifugado novamente para pellet os detritos de mielina. O pellet é ressuspenso novamente em solução tampão Tris e dividido entre dois tubos para cenetrifugação adicional. Para começar, remova todo o cérebro e coloque-o em um prato com solução gelada de sacarose 0,32 molar.Usando uma tesoura cirúrgica estéril, corte os cérebros coletados em pedaços de aproximadamente cinco milímetros de tamanho. Esta etapa auxilia no processo de homogeneização subsequente. Colete o tecido em um tubo de 50 mililitros.Usando um homogeneizador rotativo, homogeneizar o tecido em uma pasta lisa. Certifique-se de que todos os grandes sólidos cerebrais visíveis tenham sido completamente homogeneizados. Em um tubo de ultracentrífuga contendo 20 mililitros de solução de sacarose molar 0,83, gere e homogeneize, tendo o cuidado de manter a separação.Equilibre cuidadosamente cada tubo usando a solução de sacarose 0,32 molar. Uma vez terminado, transfira os tubos para um rotor de centrífuga apropriado e gire por 45 minutos a 100.000 vezes a gravidade, quatro graus Celsius. Certifique-se de que a aceleração e a desaceleração estejam definidas para seus valores mínimos.Quando a centrifugação estiver concluída, os detritos de mielina serão visíveis entre a interface de densidade de sacarose. Colete suavemente os detritos de mielina. Uma vez coletado, adicione o tampão Tris aos detritos de mielina.Homogeneizar novamente com um homogeneizador rotativo. Divida o homogeneizado entre seis tubos de ultracentrífuga limpos e equilibre os tubos conforme necessário com tampão Tris adicional. Centrifugar novamente os detritos de mielina recolhidos a 100 000 vezes a gravidade, quatro graus Celsius durante 45 minutos, com aceleração e desaceleração definidas para os seus valores máximos.Após a centrifugação, a mielina terá sido peletizada. Usando o tampão Tris, ressuspenda o pellet. Combine as ressuspensões e a ultracentrífuga novamente.Após a centrifugação, um pellet bem compactado é formado. Transvase o sobrenadar. Ressuspenda o pellet em PBS estéril.Divida igualmente os detritos de mielina ressuspensos em tubos de microcentrífuga pré-pesados. Após centrifugação por 10 minutos a 22.000 vezes a gravidade, remova o sobrenato PBS. Depois de pesar o pellet, ressuspenda a uma concentração de 100 miligramas por mililitro com PBS.Os detritos brutos de mielina resultantes agora são adequados para o estudo da fagocitose. Os detritos de mielina da marcação CFSE podem ser usados para rastrear a internalização precoce, bem como o tráfego intracelular. Os detritos de mielina não marcados são compatíveis com a coloração lipídica Oil Red-O para avaliar o armazenamento e o metabolismo dos lipídios internalizados.Se você estiver usando detritos de mielina armazenados a 80 graus Celsius negativos, primeiro você deve ressuspender com uma agulha de calibre 29. Ressuspenda 10 miligramas de detritos de mielina peletizados em 200 microlitros de PBS. Em seguida, adicione dois microlitros de solução CFSE de cinco milimolares.Pipeta para misturar. Após uma incubação de 30 minutos, protegida da luz e lavagem subsequente, ressuspenda os detritos de mielina a 100 miligramas por mililitro com PBS. Após a cultura e fixação com 4% de paraformaldeído, adicione 100% de propilenoglicol a cada poço.Depois de incubar por cinco minutos em temperatura ambiente, adicione a solução de coloração Oil Red-O a cada poço. Incube por oito minutos a 60 graus Celsius com agitação suave. Incline suavemente a placa para permitir a aspiração completa da mancha Oil Red-O.Para cada poço, adicione 85% de propilenoglicol. Após cinco minutos de incubação em temperatura ambiente, lave os poços com PBS e core as células com o corante nuclear de sua escolha. Imagens representativas de microscopia de luz de células da medula óssea durante a cultura.24 horas após a semeadura inicial, poucas células aderentes estão presentes. No entanto, na presença do fator estimulador de colônias de macrófagos, M-CSF, as células precursoras de leucócitos começam a sofrer diferenciação. Após sete dias de cultivo na presença de M-CSF, as células precursoras são totalmente diferenciadas em macrófagos maduros derivados da medula óssea capazes de fagocitose.Usando esse método, um único camundongo C57 preto 6J de oito a 10 semanas normalmente produz de 18 a 24 milhões de macrófagos da medula óssea. Para visualizar a internalização, detritos de mielina marcados com CFSE são adicionados a culturas de macrófagos derivadas da medula óssea. As células foram tratadas com um miligrama por mililitro de detritos de mielina marcados com CFSE por uma hora antes da lavagem e fixação com paraformaldeído a 4%.Os detritos de mielina internalizados podem ser visualizados usando conjuntos de filtros GFP padrão em um microscópio com capacidade de epifluorescência. Para demonstrar como o acúmulo de lipídios de mielina muda ao longo do tempo, os macrófagos foram tratados com detritos de mielina não marcados por 90 minutos, depois lavados e fixados em vários momentos. Imediatamente após a lavagem, poucas gotículas lipídicas são visíveis.No entanto, com o passar do tempo, mais gotículas lipídicas tornam-se visíveis, atingindo um máximo de aproximadamente 24 horas após a lavagem. Os macrófagos começarão a metabolizar o efluxo para os estoques lipídicos, reduzindo o número de gotículas coráveis. Para quantificar a coloração Oil Red-O, cinco imagens obtidas aleatoriamente de cada amostra de ponto de tempo foram obtidas usando um microscópio com capacidade de epifluorescência.A área manchada de óleo Red-O foi determinada para cada poço usando imagens capturadas no canal DsRed. O número total de células é determinado pela contagem do número de núcleos presentes em cada campo. Este gráfico mostra a quantificação resultante.Um aumento constante no sinal positivo de óleo Red-O é típico, pois os macrófagos derivados da medula óssea convertem lipídios de mielina internalizados em lipídios neutros. Uma diminuição no sinal de óleo vermelho-o-positivo segue o pico em 24 horas, quando os macrófagos começam a metabolizar ou ejetar os lipídios. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como isolar e cultivar macrófagos primários derivados da medula óssea, bem como estudar sua interação com detritos de mielina derivados do cérebro recém-isolados.A parte mais importante desses procedimentos é a manutenção adequada da técnica asséptica em todos os momentos. Como os macrófagos podem responder de forma robusta a pequenas quantidades de moléculas associadas a patógenos, é fundamental minimizar qualquer interação potencial que possa influenciar os resultados. A principal vantagem dessas técnicas é que elas nos tornam biologicamente relevantesAlém disso, com alguma otimização do usuário, esses métodos podem ser facilmente adaptados para abordar uma ampla variedade de questões relacionadas à resposta de macrófagos derivados da medula óssea a detritos de mielina. Ao fazer uso de detritos de mielina marcados com fluorescência e coloração Oil Red-O de macrófagos mielinizados, é possível investigar possíveis intervenções terapêuticas para pacientes que sofrem de uma variedade de neurotraumas. O objetivo geral desse trabalho é a eliminação remota de detritos celulares mediados por macrófagos para promover a resolução da inflamação.

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Os macrófagos têm sido reconhecidos como um componente crítico das respostas imune inata e adaptativa. A recente explosão de conhecimentos relativos aos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos da interação entre macrófagos e micróbios renovou atenção científica para macrófagos. Este artigo descreve um método para diferenciar macrófagos de medula óssea de ratinho.

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Nós descrevemos como visualizar macrófago C. neoformans (Cn) interações em tempo real, com especial ênfase para o processo de exocitose não-lítica usando microscopia de luz digital. Usando esta técnica individualmente macrófagos infectados podem ser estudados para determinar os vários aspectos deste fenómeno.

A visualização não-lítica exocitose de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando Digital Microscopia de Luz

Aqui, nós apresentamos um protocolo para isolar microglia de crias de rato pós-natais (dia 1) para experimentação in vitro. Este método improvisada de isolamento gera tanto rendimento e pureza elevados, uma vantagem significativa em relação aos métodos alternativos que permite a ampla gama de experimentação para efeitos de elucidação da biologia da microglia.

Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

Descrevemos aqui um método simples e rápido para o isolamento de Salmonella typhimurium-contendo phagosomes de macrófagos revestindo as bactérias com biotina e estreptavidina.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Aqui descrevemos os métodos usando microscopia confocal de fiação disco de imagem única fagocíticas eventos por macrófagos peritoneais residente do rato. Os protocolos podem ser estendidos a outras células fagocíticas.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Doenças neurodegenerativas estão associadas a funções de microglia disreguladas. Este artigo descreve um ensaio in vitro de fagocitose de células neuroblastoma por macrófagos iPSC. As leituras quantitativas de microscopia são descritas tanto para imagens de lapso de tempo de células vivas quanto para imagens de alto conteúdo de células fixas.

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Este protocolo descreve um método não enzimático e direto para isolar células da medula óssea de camundongos neonatais de 7 a 9 dias de idade e gerar macrófagos diferenciados usando um sobrenadante de células L929 como fonte de fator estimulador de colônias de granulócitos (M-CSF). Os macrófagos derivados da medula óssea foram posteriormente analisados quanto aos antígenos de superfície F4/80, CD206, CD11b e competência funcional.

Isolamento da medula óssea de camundongos neonatais e preparação de macrófagos derivados da medula óssea

O presente protocolo foi desenvolvido para avaliar o efeito da estimulação magnética repetitiva na capacidade da micróglia de fagocitar detritos de mielina. Um sistema de co-cultura de microglia in vitro e detritos de mielina foi estabelecido para isso.

Avaliação da fagocitose microglial de detritos de mielina in vitro sob estimulação magnética repetida

Aprenda a avaliar a fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea murina usando marcação fluorescente. Este método in vitro permite analisar respostas imunes em neurotrauma de forma eficiente.

In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

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